一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组及方法

技术领域

本发明涉及罗氏沼虾生殖相关基因的生物技术领域，特别涉及用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组及方法。

背景技术

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)隶属长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)。原产于东南亚，上世纪70年代末引进国内，因其生长快、个体大且风味鲜美，逐渐成为淡水养殖的主要品种之一。与其他甲壳类动物一样，罗氏沼虾也表现性别两态性：同龄雌、雄虾个体的大小、生长速度相差悬殊，在相同养殖条件下雄虾生长速度较雌虾快，性成熟后的个体平均体重约是雌虾的两倍；此外，经研究发现，体重仅为6克的雌虾和仅2克的雄虾也有部分个体达性成熟，这些性早熟个体提前产生配子、交配繁殖会导致大量的能量损耗，造成个体发育停滞、大小不一。因此，开展罗氏沼虾生殖发育及其调控机理的研究对罗氏沼虾产业的发展有重大意义。、nanos是一种RNA结合蛋白，具有两个高度保守的锌指结构域(CCHC)，其在生殖发育中起着至关重要的作用。作为一个具有母源效应的基因，nanos基因在不同物种中存在不同的同源物及调节功能，如在果蝇中，nanos基因拥有1个同源基因，该基因对生殖细胞的迁移、体细胞的抑制以及干细胞自我修复的维护起到重要作用。而在线虫(Caenorhabditis elegans)中发现该基因有3种nanos同源物(nanos1、nanos2、nanos3)，其中nanos1和nanos2可维持生殖细胞的生存能力，而nanos3在雌性同体的线虫中主要控制着雌雄性别转换。在脊椎动物斑马鱼(Danio rerio)中，nanos1基因在胚胎发育时期负责原始生殖细胞的存活，在成体斑马鱼中维持卵母细胞的生存，而在小鼠(Mus musculus)中，nanos2和nanos3在生殖细胞生长发育中起到作用，其中敲降nanos2的基因会导致雄性小鼠的精原细胞的丧失以及精子质量的下降，而阻断nanos3的则可完全导致两性生殖细胞的发育的停滞。目前，甲壳类动物中nanos家族基因的研究较为薄弱，仅见在河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)中获得了nanos1和nanos2基因，并推测其对卵巢发育起重要调控作用，尚未发现关于罗氏沼虾nanos基因的研究

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供罗氏沼虾nanos1基因、扩增引物组及其应用，本发明阐明了nanos1基因在罗氏沼虾生殖发育中的重要作用，为罗氏沼虾生殖发育、性别鉴定等研究提供了理论依据和思路。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组，所述引物组包括半定量PCR扩增引物组和荧光定量PCR扩增引物组；

所述半定量PCR扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 F、nanos1R、β-actinF、β-actin R，所述nanos1 F、nanos1 R、β-actin F、β-actin R的核苷酸序列如SED IDNO.1～4所示；

所述荧光定量PCR扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 QF、nanos1 QR、β-actin QF、β-actin QR，所述nanos1 QF、nanos1 QR、β-actin QF、β-actin QR的核苷酸序列如SED ID NO.5～8所示；

所述nanos1 F、nanos1 R还可用于nanos1基因的PCR扩增和原位杂交。

本发明还提供一种权利要求1所述用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组的获取方法，包括以下步骤：

(1)测序获得罗氏沼虾转录组数据，筛选出nanos1基因的预测序列。

(2)随机选择罗氏沼虾健康个体的性腺，提取总RNA，逆转录后获得cDNA，验证筛选出的罗氏沼虾nanos1基因；

(3)半定量PCR扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，设计上下游特异引物及β-actin内参引物，得到罗氏沼虾nanos1基因的半定量PCR扩增引物组；

(4)荧光定量PCR扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，进行荧光定量PCR扩增引物组的设计，得到罗氏沼虾荧光定量PCR扩增引物组。

本发明还提供一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的方法，采用权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组。

优选地，所述基因分析的方法包括半定量PCR、荧光定量PCR、PCR和原位杂交。

优选地，所述PCR用于对罗氏沼虾nanos1基因进行扩增；所述PCR扩增以罗氏沼虾的性腺cDNA为模板；

所述PCR扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃90s38个循环；72℃10min。

优选地，所述半定量PCR用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达；所述半定量PCR以罗氏沼虾不同组织的cDNA为模板；

所述半定量PCR扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃40s 38个循环；72℃10min；

所述不同组织包括罗氏沼虾的脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺、鳃、肠、眼。

优选地，所述荧光定量PCR用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾早期发育时期的表达；

所述荧光定量PCR以罗氏沼虾卵、胚胎和早期发育时期的cDNA为模板；所述卵包括未受精卵、受精卵、卵裂期；所述胚胎包括囊胚期、原肠胚期；所述早期发育时期包括溞状幼体期、幼体期；

所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：50℃2min，95℃2min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，40个循环；溶解曲线检测：95℃15s，60℃30s，95℃15s。

优选地，所述原位杂交用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾性腺组织中的表达位置；所述原位杂交为对罗氏沼虾的性腺组织进行原位杂交。

本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在调控罗氏沼虾雌性生殖细胞发育中的应用。

本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在罗氏沼虾早期发育时期的性别鉴定中的应用。

有益技术效果：本发明获得的nanos1基因，其cDNA序列长2811bp，编码243个氨基酸，与中华绒螯蟹的同源性最高，与鱼类的nanos1同源性较高，与哺乳类同源性较低。nanos1在卵巢中特异表达，且nanso1 mRNA在未受精卵中表达量最高，显著高于受精后及胚胎发育各期；在胚胎发育期间，受精时期表达最高，显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期；该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期至幼体期；而囊胚期至幼体之间表达水平较低且无差异。原位杂交技术检测显示，nanos1 mRNA在卵原细胞及初级卵母细胞(Oc1，Oc2，Oc3，Oc4)的细胞质中表达。nanos1与罗氏沼虾雌性生殖细胞发育有着密切的关系，在罗氏沼虾的生殖发育中发挥着重要的作用，为罗氏沼虾生殖发育、性别鉴定等研究提供了理论依据和思路。

附图说明

图1为罗氏沼虾nanos1 cDNA序列及氨基酸序列；其中，起始密码子和终止密码子用加粗及下划线突出显示；灰色阴影区为保守的-CCHC-锌指结构域；

图2为Nanos1氨基酸序列与其他物种Nanos家族蛋白的系统进化树分析；其中，在基因数据库获得序列:鲤鱼(GenBank ID:BAJ76659)；斑马鱼(GenBank ID:AAL15474)；青鳉(GenBank ID:NP_001116300，NP_001153919，BAG84599 and NP_001153941)；大西洋鳕(GenBank ID:ADV36251)；小家鼠(GenBank ID:NP_918948，NP_918953andNP_848508)；人(GenBank ID:NP_001092092，NP_001025032and NP_955631)；鲈鱼(GenBankID:CBN81978)；非洲爪蟾(GenBank ID:NP_001081503)；中华鲟(GenBank ID:JQ410472)；胡瓜鱼(GenBankID:ACO09328)；大西洋鲑鱼(GenBank ID:NP_001135057)；果蝇(GenBank ID:NP_476658)；线虫(GenBank ID:NP_496358)；中华绒螯蟹(GenBank ID:AMP 42752.1)；

图3为nanos1氨基酸序列与其他物种Nanos家族蛋白的系统进化树分析；其中，在基因数据库获得序列:鲤鱼(GenBank ID:BAJ76659)；斑马鱼(GenBank ID:AAL15474)；青鳉(GenBank ID:NP_001116300，NP_001153919，BAG84599 andNP_001153941)；大西洋鳕(GenBank ID:ADV36251)；小家鼠(GenBank ID:NP_918948，NP_918953and NP_848508)；人(GenBank ID:NP_001092092，NP_001025032and NP_955631)；鲈鱼(GenBankID:CBN81978)；非洲爪蟾(GenBank ID:NP_001081503)；中华鲟(GenBank ID:JQ410472)；胡瓜鱼(GenBankID:ACO09328)；大西洋鲑鱼(GenBank ID:NP_001135057)；果蝇(GenBank ID:NP_476658)；线虫(GenBank ID:NP_496358)；中华绒螯蟹(GenBank ID:AMP 42752.1)；

图4为nanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达分析；其中，1为脑；2为肝胰腺；3为心脏；4为肌肉；5为性腺；6为腮；7为肠；8为眼；M为标准物2000；

图5为罗氏沼虾nanos1在不同胚胎发育时期及早期幼体中的相对表达量；其中1为(卵)未受精期；2为(卵)受精期；3为卵裂期；4为囊胚期；5为原肠胚期；6为前溞状幼体期；7为溞状幼体期；8为幼体期；字母不同表示同一时间各实验组之间存在显著性差异(P<0.05)；

图6为Nanos1 mRNA在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞分布；其中，(A)罗氏沼虾卵巢切片(HE染色)；(B)罗氏沼虾卵巢切片(反义探针结果)；(C)罗氏沼虾卵巢切片(正义探针结果)；(D、E、F)分别展示的是A、B和C图方框中的放大视野图；Og：卵原细胞；Oc1：初级卵母细胞一期细胞；Oc2：初级卵母细胞二期细胞；Oc3：初级卵母细胞三期细胞；Oc4：初级卵母细胞四期细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组，所述引物组包括半定量PCR扩增引物组和荧光定量PCR扩增引物组；

在本发明中，所述半定量PCR扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 F、nanos1R、β-actin F、β-actin R，所述nanos1 F、nanos1 R、β-actin F、β-actin R的核苷酸序列如SED ID NO.1～4所示；其中nanos1 F、nanos1 R为上下游特异性引物，β-actin F、β-actinR为内参引物。

在本发明中，所述荧光定量PCR扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 QF、nanos1 QR、β-actin QF、β-actin QR，所述nanos1 QF、nanos1 QR、β-actin QF、β-actin QR的核苷酸序列如SED ID NO.5～8所示；其中nanos1 QF、nanos1 QR为上下游特异性引物，β-actin QF、β-actin QR为内参引物。

在本发明中，所述半定量PCR扩增引物组和荧光定量PCR扩增引物组的核苷酸序列如表1所示。

表1罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组

所述nanos1 F、nanos1 R还可用于nanos1基因的PCR扩增和原位杂交。

在本发明中，所述用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组获得的条带单一、扩增效率高，能够很好地满足后续罗氏沼虾nanos1基因的研究。

本发明还提供一种权利要求1所述用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组的获取方法，包括以下步骤：

(1)测序获得罗氏沼虾转录组数据，筛选出nanos1基因的预测序列。

(2)随机选择罗氏沼虾健康个体的性腺，提取总RNA，逆转录后获得cDNA，验证筛选出的罗氏沼虾nanos1基因；

(3)半定量PCR扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，设计上下游特异引物及β-actin内参引物，得到罗氏沼虾nanos1基因的半定量PCR扩增引物组；

(4)荧光定量PCR扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，进行荧光定量PCR扩增引物组的设计，得到罗氏沼虾荧光定量PCR扩增引物组。

本发明还提供一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的方法，采用权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组。

在本发明中，所述基因分析的方法包括半定量PCR、荧光定量PCR、PCR和原位杂交。

在本发明中，所述PCR用于对罗氏沼虾nanos1基因进行扩增；所述PCR扩增以罗氏沼虾的性腺cDNA为模板；所述PCR扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃90s38个循环；72℃10min。

在本发明中，所述PCR扩增的产物使用Gel Extraction Kit(Omega,China)试剂盒回收，得到目的片段，将得到的目的片段连接到pMD19-T(Takara,Chin a)载体上，转化至DH5α感受态细胞(Takara，China)中，筛选阳性克隆菌株，并将阳性克隆菌株送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，测序后进行比对，将比对结果一致的阳性菌株扩大培养，提取质粒，置于-20℃冰箱中保存。

在本发明中，所述测序的结果是利用Sequence Manipulation Suite(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/)来分析nanos1基因的核苷酸和氨基酸序列，用简单模块化体系结构研究工具(SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/)来预测其蛋白质的结构域，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对Nanos1的氨基酸序列与其他物种的Nanos蛋白家族的氨基酸序列进行同源比对，用DNAMAN，BioEdit进行多个序列比对分析；采用MEGA7软件中的最大拟然法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)构建系统进化树，对nanos1序列进行了同源性分析。

本发明克隆获得了nanos1基因，并将该基因的核苷酸序列上传了NCBI，(GenBank：ON155838)，其cDNA序列长为2811bp，5’端非编码区(UTR)为686bp，3’-UTR为1396bp，开放阅读框(Open reading frame，ORF)为729bp，编码243个氨基酸。该基因在罗氏沼虾的生殖发育中发挥着重要的作用。

在本发明中，所述半定量PCR用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达；所述半定量PCR以罗氏沼虾不同组织的cDNA为模板；

在本发明中，半定量PCR扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃40s38个循环；72℃10min；所述不同组织包括罗氏沼虾的脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺、鳃、肠、眼。

本发明通过对不同组织中的nanos1基因的表达量进行检测和分析，得到了nanos1在正常罗氏沼虾个体的肝、脾、心脏、雌性性腺、肌肉、鳃、肠、脑和眼睛等不同组织中的表达分布，为罗氏沼虾生殖发育等研究提供了理论依据和思路。

在本发明中，所述半定量PCR扩增的产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，并使用凝胶成像分析系统拍照(GenoSens2200，CN)。

在本发明中，所述荧光定量PCR用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾早期发育时期的表达；所述荧光定量PCR以罗氏沼虾卵、胚胎和早期发育时期的cDNA为模板；所述卵包括未受精卵、受精卵、卵裂期；所述胚胎包括囊胚期、原肠胚期；所述早期发育时期包括溞状幼体期、幼体期；

所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：50℃2min，95℃2min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，40个循环；溶解曲线检测：95℃15s，60℃30s，95℃15s。

在本发明中，所述原位杂交用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾性腺组织中的表达位置；所述原位杂交为对罗氏沼虾的性腺组织进行原位杂交。

在本发明中，所述原位杂交具体操作步骤参照文献方法(YU L,XU D,YE H,etal.Gonadal Transcriptome Analysis ofPacific Abalone Haliotis discus discus:Identification of Genes Involved in Germ Cell Development[J].MarineBiotechnology,2018,20(5):1-14.)。

本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在调控罗氏沼虾雌性生殖细胞发育中的应用。本发明对所述应用的类型没有特殊限定，采用本领域常规的应用方式即可。

本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在罗氏沼虾早期发育时期的性别鉴定中的应用。本发明对所述应用的类型没有特殊限定，采用本领域常规的应用方式即可。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

1方法与步骤

1.1实验材料的收集及其处理

选取3月龄健康的罗氏沼虾雌雄各20只，购于佛山三水白金有限公司。将罗氏沼虾进行解剖，分别采集脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺、腮、肠和眼等组织，放入液氮中速冻，随后转入-80℃冰箱保存，用于各组织的RNA提取；取部分性腺组织，放入波恩氏液中固定8h后转入75％的酒精中，然后置于4℃冰箱保存，用于石蜡切片；采集卵、胚胎发育和早期发育不同时期的样品，放入液氮中速冻，放入-80℃冰箱保存，用于后续实验。

1.2不同组织总RNA提取及其cDNA合成

将采集的组织进行裂解，使用

1.3性腺组织nanos1 cDNA的克隆

根据本实验室罗氏沼虾性腺转录组测序所得的nanos1基因(Nanos1)cDNA序列(序列未公布)，设计上下游特异引物nanos1 F和nanos1 R(表1)。以性腺cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃90s(共38个循环)；72℃10min。PCR产物使用Gel Extraction Kit(Omega,China)试剂盒回收。然后将目的片段连接到pMD19-T(Takara,China)载体，转化至DH5α感受态细胞(Takara，China)中，克隆筛选，并将阳性克隆菌株送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，测序后进行比对，将比对后一致的阳性菌株扩大培养，提取质粒，置于-20℃冰箱中保存。

1.4nanos1cDNA序列分析

测序结果利用Sequence Manipulation Suite(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/)分析nanos1核苷酸和氨基酸序列，用简单模块化体系结构研究工具(SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测其蛋白质结构域，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对Nanos1氨基酸序列与其他物种的Nanos蛋白家族氨基酸序列进行同源比对，用DNAMAN，BioEdit进行多个序列比对分析；采用MEGA7软件中的最大拟然法(Maximum LikelihoodEstimate，MLE)构建系统进化树。

1.5nanos1在不同组织中的表达

根据nanos1序列，设计一对引物nanos1 F和nanos1 R，并以β-actin为内参基因(GenBankNO:AY626840)(表1)。以脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺(雌、雄)、鳃、肠和眼的组织cDNA为模板，进行RT-PCR扩增(Applied Biosystems，BRD)，以确定Nanos1在不同组织中的表达分布。反应程序如下：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃40s(共38个循环)；72℃延伸10min。RT-PCR产物由1％的琼脂糖凝胶进行分离，并使用凝胶成像分析系统拍照(GenoSens2200，CN)。

2结果

2.1nanos1 cDNA序列特征

图1为罗氏沼虾nanos1 cDNA序列及氨基酸序列，其中，起始密码子和终止密码子用加粗及下划线突出显示；灰色阴影区为保守的-CCHC-锌指结构域。图2为罗氏沼虾nanos1与其他物种锌指区域结构的比较。由图1可以看出，克隆获得nanos1基因(GenBank：ON155838)cDNA序列长为2811bp，5'端非编码区(UTR)为686bp，3′-UTR为1396bp，开放阅读框(Open reading frame，ORF)为729bp，编码243个氨基酸。由图1、2可以看出，对Nanos1氨基酸序列进行预测发现该蛋白具有两个保守的-CCHC-(-Cys-Cys-His-Cys-)锌指结构域，以及nanos家族特有的结构功能域。

2.2nanos1系统发育

采用MEGA7.0以最大拟然法构建nanos1系统发育树，并对nanos1序列进行了同源性分析。图3为nanos1氨基酸序列与其他物种Nanos家族蛋白的系统进化树分析。由图3可以看出，nanos基因家族分为了2个大支：一个分支为nanos1蛋白分支聚集，另一个为nanos2和nanos3蛋白分支聚集。系统发育树的结果显示，nanos1与其他物种的nanos1蛋白集合聚集在一起，且于中华绒螯蟹聚集在一个分支，该研究获得的罗氏沼虾nanos基因属于nanos1基因家族。为了进一步了解nanos1基因的同源性，将nanos1氨基酸序列与鱼类、两栖动物和哺乳动物的氨基酸序列进行比对和鉴定。发现nanos1基因的锌指基序列与其他动物的锌指基序列具高度同源性。在nanos1集簇中，nanos1序列与中华绒螯蟹nanos的同源性最高，为51％的相似性，与鱼类的同源性较高，其中与青鳉鱼(Oryzias latipes)nanos1a和大西洋鲑(Salmo salar)nanos1的同源性分别有40.7％和46％的相似性，与非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、小鼠和人(Homo sapiens)nanos1分别有40％、22％和23％的相似性；而在Nanos2和Nanos3的聚类中，它显示出较低的相似性。

2.3nanos1 mRNA组织表达分析

为了解nanos1在不同组织中的表达模式，以β-actin为内参基因，利用RT-PCR技术进行检测，分析Nanos1在正常雌雄个体的肝、脾、心脏、雌性性腺、肌肉、鳃、肠、脑和眼睛等不同组织中的表达分布。图4为nanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达分析。由图4可以看出，nanos1仅在卵巢中检测到表达，雌性其他组织以及雄性的所有组织中均未见有表达。

2.4nanos1在卵、胚胎和早期发育过程中的表达模式

为了解nanos1在卵、胚胎和早期发育过程中的表达模式，对卵、胚胎等样品进行了qPCR检测。图5为罗氏沼虾nanos1在不同胚胎发育时期及早期幼体中的相对表达量，由图5可以看出，nanso1 mRNA在(卵)未受精期表达量最高，显著高于(卵)受精期，极显著高于卵裂期和胚胎发育其他后期(囊胚期、原肠期、前溞状幼体期、溞状幼体期)和幼体期；在胚胎发育期间，(卵)受精期表达最高，显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期(囊胚期、原肠期、前溞状幼体期、溞状幼体期)；而该基因在卵裂期的表达水平有显著高于囊胚期、原肠期、前溞状幼体期和溞状幼体期；囊胚期、原肠期、前溞状幼体期和溞状幼体期和幼体期之间，该基因表达水平较低且无显著差异。

2.5nanos1在卵巢组织中的亚细胞定位

利用原位杂交技术研究nanos1在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞定位。图6为nanos1mRNA在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞分布，由图6可以看出，在罗氏沼虾卵巢中，nanos1 mRNA在卵母细胞中检测到阳性信号，在Oc1，Oc2，Oc3，Oc4期的卵母细胞中的阳性信号最强，在初级卵母细胞Oc1，Oc2，Oc3，Oc4期的阳性信号主要集中在卵母细胞的细胞质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。