一种产(+)γ-内酰胺酶发酵条件优化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一种产(+)γ-内酰胺酶发酵条件优化方法。

背景技术

微生物发酵是在适宜的条件下将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程，其发酵过程受很多因素的影响，微生物发酵的生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件，其中发酵培养基的培养条件对微生物发酵产物的形成有很大的影响，每一种代谢产物都有其最适的生产条件。

响应面法是利用合理的实验设计并通过实验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺，解决多变量问题的一种统计学方法。其中，确定因素方法一般采用Plackett-Burman法，这是一种以不完全平衡块(balanced incomplete blocks)为原理的部分析因实验设计法，适用于从众多的考察因素中快速、有效的筛选出最为重要的几个因素，供进一步详细研究使用。确定水平一般采用最陡爬坡试验，该试验分别对3个显著因素的正负效应设计最陡爬坡试验路径，包括各因素的变化步长和变化方向，以便最快地逼近最大响应区域。与通常采用的单因素实验和正交实验无法找到整个区域上各个因素的最佳组合及响应值的最优值比较，该方法具有试验次数少、周期短，求得的回归方程精确度高，又能研究几个因素间相互作用，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效办法，目前己广泛地应用于农业、生物、食品、化学、医药等领域。

目前技术存在的问题是：在目前技术中，发酵液的(+)γ-内酰胺酶酶活低，不能真实地反映各筛选因素的影响，不能用响应面法优化BH24发酵产(+)γ-内酰胺酶的培养条件。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种产(+)γ-内酰胺酶发酵条件优化方法，为了改善Bacillus thuringiensis(BH24)产(+)γ-内酰胺酶的水平，本发明在Plackett-Burman研究基础上，采用Box-Benhnken响应面设计法优化Bacillusthuringiensis产(+)γ-内酰胺酶的发酵条件。本发明得到的(+)γ-内酰胺酶预测最大酶活为116.9U/L，进行验证试验得到(+)γ-内酰胺酶酶活平均值为114.5U/L，相对偏差为2.1％。利用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析得到最优发酵条件：葡萄糖质量浓度为4.0g/L、温度为25.2℃和p H为7.63，预测(+)γ-内酰胺酶最大酶活为116.9U/L，根据实际情况，最优发酵条件数值调整为葡萄糖质量浓度4.0g/L、温度25℃和p H 7.6，在此条件下进，行验证试验得到(+)γ-内酰胺酶酶活平均值为114.5U/L。因此采用响应面法对(+)γ-内酰胺酶菌株培养条件进行优化准确可靠。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法，所述产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法的培养基初始为：培养温度25.0℃、pH7.6、葡萄糖质量浓度4.0g/L。

所述产(+)γ-内酰胺酶菌株：Bacillus thuringiensis(BH24)来源于渤海海域海泥，现由大连大学辽宁省海洋微生物工程技术研究中心保藏。

首先进行菌株初筛

渤海海域海水、海泥样品共20份，海水5m L，海泥各取2.0g左右加入10m L无菌生理盐水，充分混匀，待静置后取上清接种于富集培养基，28℃培养2d，按5％的接种量转入相同富集培养基中再培养2d。采用平板划线分离法，将富集培养后的菌液适度稀释，涂布在平板筛选培养基上，28℃培养。菌株在2～5d后陆续生长，挑取单菌落进行进一步纯化，并将纯化后的菌株进行斜面保藏，用于进一步活性测定。然后将离心获得的湿菌经0.05mol/L，p H7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以上，直至发酵液洗净为止，将洗涤后的菌体悬浮于质量浓度为10g/L的N-乙酰-L-苯丙氨酸的上述磷酸盐缓冲液中。在28℃、150r/min条件下反应8h，8 000r/min离心10min，取上清液，用茚三酮比色法测定氨基酸的方法测定转化率。将能转化N-乙酰-L-苯丙氨酸的32菌株进行保藏待用。

然后进行菌株复筛

将初筛获得的菌株接入种子培养基中在28℃、150r/min培养24h，按5％的接种量转入相同种子培养基中，28℃、150r/min培养24h，按5％的接种量接种于初始发酵培养基，28℃、150r/min培养24h。然后将离心获得的湿菌经0.05mol/L，p H 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以上，直至发酵液洗净为止，将洗涤后的菌体悬浮于质量浓度为10g/L的N-乙酰-L-苯丙氨酸的上述磷酸盐缓冲液中。在28℃、150r/min条件下反应，在10h后取样，手性HPLC分析检测转化后样品中(±)γ-内酰胺成分的变化，将具有较高(+)γ-内酰胺酶活性的菌株保藏待用。

最后通过形态学、生理生化及16S r DNA序列测定，测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，菌株BH24鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

进一步，所述的产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法具体包括：

首先用Plackett-Burman法筛选出初始pH、培养温度、葡萄糖质量浓度三个影响大的因素；

然后进行最陡爬坡实验逐步改变初始pH、培养温度、葡萄糖质量浓度，逼近最佳响应面区域；

最后通过Box-Benhnken，利用Design-Expert.V8.6.0.1软件进行回归分析，得到各因素的最优培养条件：接种于最优培养基中，初始为培养温度25.0℃、pH7.6、葡萄糖质量浓度4.0g/L。

进一步，所述回归分析的二次多项回归方程为：

Y＝2 109.725X

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本发明的另一目的在于提供一种利用上述产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法产(+)γ-内酰胺酶发酵条件的优化系统。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

产(+)γ-内酰胺酶菌株通过利用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析得到最优发酵条件：葡萄糖质量浓度为4.0g/L、温度为25.2℃和p H为7.63，通过分析图2-4得到(+)γ-内酰胺酶最大酶活预测值为116.9U/L。

采用响应面分析法对BH24菌株发酵产(+)γ-内酰胺酶的培养条件进行优化，首先运用Plackett-Burman法确定出初始pH、培养温度、葡萄糖质量浓度为主要影响因素，然后通过最陡爬坡试验逐步改变三者值的大小，逼近最佳响应面区域；最后采用Box-Benhnken设计和Design-Expert.V8.6.0.1软件分析确定出主要影响因素的最优值，得到最佳发酵培养条件为温度25.0℃、pH7.6、葡萄糖质量浓度4.0g/L，经培养发酵后酶活由优化前的约76.0U/L提高至114.5U/L，比优化前提高了约50.7％(首先进行发酵工艺的单因素优化，然后通过Plackett-Burman、最陡爬坡、中心组合实验设计、回归模型建立与方差分析得到发酵条件主要影响因素及最佳培养条件结果，通过图2-4分析得到。)。同时，回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程能较真实地反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况是比较吻合的，因此用响应面法优化BH24发酵产(+)γ-内酰胺酶的培养条件是有效可行的。

附图说明

图1是本发明实施例提供的产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的温度和pH交互作用的响应曲面和等高线示意图。

图3是本发明实施例提供的葡萄糖质量浓度和温度交互作用的响应曲面和等高线示意图。

图4是本发明实施例提供的pH和葡萄糖质量浓度交互作用的响应曲面和等高线示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

实施例1

本发明实施例提供的产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法的初始培养温度为25.0℃、pH为7.6、葡萄糖质量浓度为4.0g/L。

如图1所示，本发明实施例提供的产(+)γ-内酰胺酶菌株发酵条件的优化方法包括以下步骤具体包括：

S101：首先用Plackett-Burman法筛选出初始pH、温度、葡萄糖质量浓度三个影响大的因素；

S102:然后进行最陡爬坡实验逐步改变三者的大小，逼近最佳响应面区域；

S103:最后通过Box-Benhnken，利用Design-Expert软件进行回归分析，得到各因素的最优培养条件；接种于最优培养基中，培养基初始培养温度为25.0℃、pH为7.6、葡萄糖质量浓度为4.0g/L。

所述回归分析的二次多项回归方程为：

Y＝2109.725X

8.123 75X

下面结合实验对本发明的应用效果作进一步的描述。

本发明通过察所拟合的相应曲面和等高线的形状，从图中及Design-Expert软件分析，回归方程存在稳定点，通过岭崎分析得到极大值所对应的各主要因素为初始培养温度、pH、葡萄糖质量浓度的最优值分别为25.0℃、7.6、4.0g/L，此时发酵液的(+)γ-内酰胺酶活达到最大值，利用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析得到最优发酵条件：葡萄糖质量浓度为4.0g/L、温度为25.2℃和p H为7.63通过图2-4数据进行预测。预测值为116.9U/L。

为了进一步分析相关变量之间的交互作用和确定最优点，通过Design-Expert软件做了三个主要影响因素对发酵水平相互影响的等高线图及其相应面图，如图2-4。通过岭崎分析得到极大值所对应的各主要因素即初始pH、培养温度、葡萄糖质量浓度的最佳浓度分别为7.6、25.0℃、4.0g/L.

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。