乳品中神经节苷脂的检测方法

技术领域

本发明涉及UPLC-Q-TOF-MS检测技术领域，尤其是涉及一种乳品中神经节苷脂的检测方法。

背景技术

脂质是人类母乳中仅次于乳糖的第2大组分，在母乳中含量丰富，主要包括甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂和糖脂。在人乳中，脂肪占3％-5％，其中甘油酯占98％，磷脂占0.8％，胆固醇占0.5％，神经节苷脂占0.001％。研究表明母乳脂质组成影响婴幼儿生长发育，对于婴幼儿来说，日常所需能量的45％-55％是由脂质所提供的。

神经节苷脂是一类酸性鞘糖脂，由鞘氨醇、脂肪酸和含唾液酸的糖链这3部分组成，广泛分布于人体的组织和体液中，其中在神经系统中的分布最为丰富。乳中神经节苷脂主要位于乳脂球膜的外表面，有助于乳脂肪球的形成和稳定。神经节苷脂是婴儿大脑早期生长和发育的关键营养素之一，在神经发育、记忆形成和突触信号转导中起着重要作用，并参与调节免疫系统，支持新生儿肠道成熟，同时促进婴儿肠道中的双歧杆菌增殖。乳中神经节苷脂参与多种生物过程，包括神经发育、病原体结合和免疫系统激活等。

GM3和GD3是母乳中最主要的神经节苷脂，其中初乳中的神经节苷脂以GD3为主，随泌乳期的延长，GD3含量逐渐降低，GM3含量逐渐增加，在成熟乳中GM3成为母乳中主要的神经节苷脂。

神经节苷脂通常通过离心和甲醇/氯仿液液萃取(重复2-4次)进行提取，其中，部分方法萃取时还会加入磷酸氢二钠、氯化钾等。有些方法也会使用固相萃取柱进行进一步净化，如C8柱、C18柱、HLB柱等。大多数已发表的方法都使用这些方法的组合来制备样品，但是氯仿的毒害性强，会对人体的心、肝、肾造成损害，而固相萃取则会影响神经节苷脂的回收率。同时，薄层色谱法是检测神经节苷脂的主要方法，并通过间苯二酚-盐酸试剂或免疫染色确定神经节苷脂种类，但此方法无法对神经节苷脂进行绝对定量。

此外，牛乳中主要的神经节苷脂为GD3，这使得以牛乳为主要原料生产的婴儿配方粉中的主要神经节苷脂也为GD3，这与成熟母乳中神经节苷脂的组成存在差异。

因此，对母乳、婴儿配方粉及其配料中的神经节苷脂及其亚类检测并进行定性和绝对定量十分必要，对于获得母乳中神经节苷脂的统计数据、开发神经节苷脂母乳化的婴幼儿配方乳粉、以及产品开发和监管具有重要意义。

发明内容

有鉴于现有乳品中神经节苷脂检测所存在的提取过程中使用高毒性的氯仿、神经节苷脂回收率差，以及无法对神经节苷脂进行绝对定性定量分析的问题。

本发明的目的在于提供一种乳品中神经节苷脂的检测方法，该方法通过使用对人体毒害性相对较小的提取试剂，经处理得到神经节苷脂的提取物，随后利用UPLC-Q-TOF-MS方法对提取物进行定性和定量检测，具有准确性高，回收率高，精密度高的技术优势。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供的一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法通过UPLC-Q-TOF-MS进行，其中：

待检测乳品的前处理方法包括：将待检测乳品溶解于二氯甲烷溶液中；随后进行提取处理，得到水相溶液；然后氮吹干后复溶，得到待上机检测样本。

进一步的，所述二氯甲烷溶液包括二氯甲烷和甲醇；

所述二氯甲烷溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为0.9：2～2：1，优选为1：2。

进一步的，所述氮吹干后复溶为使用甲醇复溶，所述甲醇为50～100％的甲醇，优选为80wt％的甲醇。

进一步的，所述乳品包括液态乳和固态乳制品；

优选地，所述液态乳包括母乳、牛乳、羊乳、复原乳；所述固态乳制品包括配方奶粉以及乳脂肪球膜粉、乳清蛋白粉等奶粉配料。

进一步的，所述UPLC-Q-TOF-MS检测包括以下步骤：

利用超高效液相色谱对待上机检测样本中的神经节苷脂进行分离，随后用质谱检测得到物质峰并进行定性分析；

优选地，所述神经节苷脂包括GD3和GM3。

进一步的，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件包括：

采用Waters BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱检测，柱温50℃，流速0.3mL/min，进样量10μL；

A相：1mM乙酸铵的甲醇/水(1:9，v/v)溶液，B相：1mM乙酸铵的甲醇溶液。

更进一步的，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱梯度洗脱参数包括：

更进一步的，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件包括：

负离子模式下检测，一级质谱检测参数：累积时间(accumulation time)0.25secs，扫描范围(tof masses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V；

质谱二级碎片检测参数：累积时间(accumulation time)0.05secs，扫描范围(tofmasses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V。

进一步的，所述检测方法还包括制备标准曲线对神经节苷脂中的GD3和GM3进行定量分析的步骤；

所述标准曲线制备中采用C18:0GM3-d5和C18 Ganglioside GD3-d3作为内标，采用C18:0GM3和Ganglioside GD3作为外标，标曲范围为0.01mg/L-10mg/L；

所述标准曲线中外标峰面积与相应内标峰面积比值为纵坐标，以外标浓度为横坐标。

进一步的，所述神经节苷脂中GM3的定量分析标准曲线为：

y＝3.547x-0.1923，R2＝0.9932；

所述神经节苷脂中GD3的定量分析标准曲线为：

y＝0.5765x+0.0123，R2＝0.9985。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本申请提供的乳品中神经节苷脂的检测方法通过UPLC-Q-TOF-MS进行。本申请检测方法在待检测乳品的前处理过程中使用二氯甲烷溶液替代具有高毒性的氯仿，减少了对操作人员身体健康造成的影响；同时使用氮吹后复溶的方法替代现有直接定容的方法，有效缓解了直接定容法将样品稀释8～10倍，所造成的质谱二级碎片强度减小，部分低含量神经节苷脂的二级碎片强度低于检出限，进而影响神经节苷脂定性定量的问题。在上述前处理的基础上本申请采用UPLC-Q-TOF-MS对上机样本进行检测，通过液相色谱和质谱条件的选择，实现了乳品中神经节苷脂的准确定性和定量，具有准确性高，回收率高，精密度高的技术优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的UPLC-Q-TOF-MS液相色谱检测后神经节苷脂的GM336:1；2提取色谱图；

图2为本发明实施例1提供的UPLC-Q-TOF-MS液相色谱检测后神经节苷脂的GD334:1；2提取色谱图；

图3为本发明实施例1提供的UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂总离子流图；

图4为本发明实施例1提供的UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂的GM3 36:1；2二级碎片图；

图5为本发明实施例1提供的UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂的GD3 34:1；2二级碎片图；

图6为本发明实施例3提供的提供的神经节苷脂GM3的标准曲线图；

图7为本发明实施例3提供的提供的神经节苷脂GD3的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法通过UPLC-Q-TOF-MS进行，其中：

待检测乳品的前处理方法包括：将待检测乳品溶解于二氯甲烷溶液中；随后进行提取处理，得到水相溶液；然后氮吹干后复溶，得到待上机检测样本。

本申请提供的乳品中神经节苷脂的检测方法通过UPLC-Q-TOF-MS进行。本申请检测方法在待检测乳品的前处理过程中使用二氯甲烷溶液替代具有高毒性的氯仿，减少了对操作人员身体健康造成的影响；同时使用氮吹后复溶的方法替代现有直接定容的方法，有效缓解了直接定容法将样品稀释8-10倍，所造成的质谱二级碎片强度减小，部分低含量神经节苷脂的二级碎片强度低于检出限，进而影响神经节苷脂定性定量的问题。在上述前处理的基础上本申请采用UPLC-Q-TOF-MS对上机样本进行检测，通过液相色谱和质谱条件的选择，实现了乳品中神经节苷脂的准确定性和定量，具有准确性高，回收率高，精密度高的技术优势。

具体的，本申请乳品中神经节苷脂检测方法的技术优势也可总结如下：

1、使用毒性较小的二氯甲烷替代氯仿。二氯甲烷既对脂质具有良好的溶解性，提取效果好，其毒性又低于氯仿，减少了对操作人员身体健康造成的影响。同时，氯仿作为易制毒危险化学品，购买和储存都有着更严格的要求，废弃的氯仿在存放、运输和处理过程中也会造成二次毒害。

2、使用氮吹后复溶的方法替代直接定容的方法。由于母乳中神经节苷脂含量较低，GD3或GM3的总含量为0.9mg/L-18mg/L，使用直接定容法会使得样品被稀释8-10倍，造成质谱二级碎片强度减小，部分低含量神经节苷脂的二级碎片强度低于检出限，影响神经节苷脂定性数量，进而影响神经节苷脂定量。同时，由于泌乳期、膳食习惯、生活习惯等的存在差异，检测的母乳样本的成分也不尽相同，这导致液液萃取出的液体体积也存在一定差异。因此，液液萃取后直接定容，不能确保每个样品定容后的基质体系完全相同。

而氮吹将溶剂吹干后，再用复溶液溶解可以保证每个样品的基质体系相同，避免因基质差异对神经节苷脂检测造成的影响，也更利于确定样品对应空白样品种类，便于通过扣除空白以减少基质、管路残留等对于检测结果的影响。

3、使用UPLC-Q-TOF-MS检测，可以对神经节苷脂的亚类进行定性和定量检测，确定神经节苷脂的碳原子和双键数量。在进行母乳研究及婴儿配方粉创制方面，可以从神经节苷脂亚类水平上更全面的进行研究及模拟。

注：现有乳品中的神经节苷脂通常通过离心和甲醇/氯仿液液萃取(重复2-4次)进行提取，提取过程中使用高毒性的氯仿。氯仿在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气，稳定性差，在较高温度下发生热分解，能进一步氯化为CCl4，且具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害，大批量样品检测会对人体健康的产生较大伤害。

此外，使用氯仿提取样品的沉淀和分层效果差。使用氯仿对样品中神经节苷脂进行提取时，蛋白沉淀的效果不好，轻微晃动试管容易导致部分沉淀重新溶解，在吸取上清液时也容易吸到沉淀；液液萃取分层时，分层界面形成白色、不规则胶状物，不利于观察分层界面，影响吸取效果。

在本发明的一种优选实施方式中，所述二氯甲烷溶液包括二氯甲烷和甲醇；

所述二氯甲烷溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为0.9：2～2：1，优选为1：2。

在本发明的一种优选实施方式中，所述氮吹干后复溶为使用甲醇复溶，所述甲醇为50～100％的甲醇，优选为80wt％的甲醇。

在本发明的一种优选实施方式中，所述乳品包括液态乳和固态乳制品；

优选地，所述液态乳包括母乳、牛乳、羊乳、复原乳；所述固态乳制品包括配方奶粉以及乳脂肪球膜粉、乳清蛋白粉等奶粉配料。

需要说明的是，目前绝大多数神经节苷脂检测方法仅能检测母乳、牛乳等液态乳，或是仅能检测婴儿配方粉等固体样品。而对于母乳化婴儿配方粉的开发来说，使用同样的方法对母乳、牛乳、婴儿配方粉中神经节苷脂进行检测，可以消除不同检测方法带来的方法误差，使得不同种类样品的检测结果更加具有可比性，有利于婴儿配方粉进行母乳化模拟。

本申请基于母乳神经节苷脂的特性和UPLC-Q-TOF-MS检测母乳神经节苷脂的原理，建立样本量少、安全、高效的检测方法，该方法可适用于不同食品，包括液体和固体，尤其是母乳、乳制品及其配料。

即采用少量样本，通过对人体毒害性相对较小的提取试剂，经过一次处理，得到神经节苷脂的提取物，对其进行定性和定量检测，为建立食品、尤其是母乳脂质数据库，以及科学的食品脂质(母婴食品脂质)的设计提供技术支持。

在本发明的一种优选实施方式中，所述UPLC-Q-TOF-MS检测包括以下步骤：

利用超高效液相色谱对待上机检测样本中的神经节苷脂进行分离，随后用质谱检测得到物质峰并进行定性分析；

优选地，所述神经节苷脂包括GD3和GM3。

需要说明的是，UPLC-Q-TOF-MS分析方法是超高效液相色谱-四极杆联合飞行时间串联质谱分析方法，通过高效液相的联用，可以方便得到每个样品的主要结构信息，并针对每个组分进行准确的定性分析。四级杆质谱是在交变电场的作用下没事某些符合要求的离子通过四级杆到达检测器，飞行时间质谱(TOF)是应用不同的m/z离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离。四级杆串联飞行时间质谱不仅用千一级质谱的分析而且可以实现二级质谱分析，一级质谱可得出化合物的分子量信息，二级质谱则可以得到化合物的碎片离子等结构信息。

因此，本申请采用UPLC-Q-TOF-MS分析方法，质谱可以同时提供关于神经节苷脂的聚糖和神经酰胺脂质部分的定性信息；ESI技术可获得丰富的化合物结构碎片信息，而飞行时间质谱(TOF-MS)具有扫描速度快、离子传输率快、灵敏度高等优点，二者的结合可有效提高复杂样品中脂质结构鉴定的准确性。

在本发明的一种优选实施方式中，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件包括：

采用Waters BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱检测，柱温50℃，流速0.3mL/min，进样量10μL；

A相：1mM乙酸铵的甲醇/水(1:9，v/v)溶液，B相：1mM乙酸铵的甲醇溶液。

在上述优选实施方式中，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱梯度洗脱参数包括：

在上述优选实施方式中，所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件包括：

负离子模式下检测，一级质谱检测参数：累积时间(accumulation time)0.25secs，扫描范围(tof masses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V；

质谱二级碎片检测参数：累积时间(accumulation time)0.05secs，扫描范围(tofmasses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V。

作为一种优选的实施方式，本申请通过上述液相色谱和质谱条件的选择，实现了乳品中神经节苷脂的准确定性和定量，具有准确性高，回收率高，精密度高的技术优势。

在本发明的一种优选实施方式中，所述检测方法还包括制备标准曲线对神经节苷脂中的GD3和GM3进行定量分析的步骤；

所述标准曲线制备中采用C18:0GM3-d5和C18 Ganglioside GD3-d3作为内标，采用C18:0GM3和Ganglioside GD3作为外标，标曲范围为0.01mg/L-10mg/L；

所述标准曲线中外标峰面积与相应内标峰面积比值为纵坐标，以外标浓度为横坐标。

在上述优选实施方式中，所述神经节苷脂中GM3的定量分析标准曲线为：

y＝3.547x-0.1923，R2＝0.9932；

所述神经节苷脂中GD3的定量分析标准曲线为：

y＝0.5765x+0.0123，R2＝0.9985。

下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。

注：下述实验例1和对比例1～3中吸取进行检测的母乳样本为同一样本。

实施例1

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(A)、待检测乳品的前处理：

吸取母乳0.5mL，加入2mL二氯甲烷/甲醇(1:2，v/v)溶液于离心管中，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液于离心管中，得到上清液A；剩余沉淀物加0.5mL超纯水，涡旋混合后加2mL二氯甲烷甲醇(1:2，v/v)溶液，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液B；

合并上清液A、B，加入1mL超纯水，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相于另一离心管中，下层有机相中加入0.13mL 0.01M氯化钾水溶液和0.18mL甲醇，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相；

合并上述两次吸取的水相，氮吹至近干，用0.5mL的80％甲醇复溶，涡旋混合后静置1～2min，在6000rpm下离心5min，吸取上清液，得到待上机检测样本。

(B)、使用步骤(A)的上机检测样本进行UPLC-Q-TOF-MS检测；

(1)所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件包括：采用Waters BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱检测，柱温50℃，流速0.3mL/min，进样量10μL；

A相：1mM乙酸铵的甲醇/水(1:9，v/v)溶液，B相：1mM乙酸铵的甲醇溶液。

所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱梯度洗脱参数包括：

图1为本实施例UPLC-Q-TOF-MS的液相色谱检测后神经节苷脂的GM3 36:1；2提取色谱图；其中GM3 36:1；2表示由36个碳原子和1个不饱和双键组成的GM3(单唾液酸神经节苷脂)，分号后的数字为神经节苷脂中含有的羟基数。

图2为本实施例UPLC-Q-TOF-MS的液相色谱检测后神经节苷脂的GD3 34:1；2提取色谱图；其中GD3 34:1；2表示由34个碳原子和1个不饱和双键组成的GD3(双唾液酸神经节苷脂)，分号后的数字为神经节苷脂中含有的羟基数。

(2)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件包括：

负离子模式下检测，一级质谱检测参数：累积时间(accumulation time)0.25secs，扫描范围(tof masses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V；

质谱二级碎片检测参数：累积时间(accumulation time)0.05secs，扫描范围(tofmasses)100-2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气(GS1)40psi，辅助加热气(GS2)35psi，气帘气(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)-4500V，去簇电压(DP)-40V，碰撞能量(CE)-40V。

图3为本实施例UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂总离子流图；

图4为本实施例UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂的GM336:1；2二级碎片图；

图5为本实施例UPLC-Q-TOF-MS检测得到的神经节苷脂的GD334:1；2二级碎片图。

(3)、神经节苷脂定性分析方法：

神经节苷脂使用Peakview软件进行定性分析，根据分子式和精确分子量对神经节苷脂进行检索，其中GM3的加合离子为“-H”，GD3的加合离子为“-2H”，再根据检索到的神经节苷脂二级碎片中的唾液酸(m/z为290.1)特征碎片确定是否含有某种神经节苷脂。

对比例1

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(A)、待检测乳品的前处理：

1#管：200μL母乳+200μL超纯水+2mL甲醇+900μL二氯甲烷(色谱纯)→手动摇匀震荡10s，超声5min→加入200μL超纯水+900μL二氯甲烷(色谱纯)→手动摇匀震荡10s→离心，6000r/min，15min→取出下层有机相到2#管

1)、1#管上层水相+1.8mL二氯甲烷→离心，6000r/min，15min→取出下层有机相

2)、2#管下层有机相+1mL超纯水+2.2mL甲醇+0.6mL二氯甲烷，手动摇匀→离心，3000×g，10min→取出下层有机相

3)、将2#管上层水相与1#管上层水相混合，氮气吹干后，用200μL的80％甲醇复溶液溶解，静置1～2min→涡旋震荡摇匀→离心，6000r/min，5min→吸取上清液上机测定。

(B)、使用步骤(A)的上机检测样本进行UPLC-Q-TOF-MS检测；

(1)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件同实施例1；

(2)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件同实施例1。

对比例2

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(A)、待检测乳品的前处理：

吸取母乳0.5mL，加入2mL三氯甲烷/甲醇(1:2，v/v)溶液于离心管中，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液于离心管中，得到上清液A；剩余沉淀物加0.5mL超纯水，涡旋混合后加2mL二氯甲烷甲醇(1:2，v/v)溶液，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液B；

合并上清液A、B，加入1mL超纯水，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相于另一离心管中，下层有机相中加入0.13mL 0.01M氯化钾水溶液和0.18mL甲醇，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相；

合并上述两次吸取的水相并用甲醇定容至5ml，得到待上机检测样本。

本对比例与实施例1的区别在于：1、使用三氯甲烷/甲醇(1:2，v/v)溶液对母乳进行溶解；2、使用对水相直接定容的方法替代实施例1中的氮吹后复溶的方法。

(B)、使用步骤(A)的上机检测样本进行UPLC-Q-TOF-MS检测；

(1)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件同实施例1；

(2)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件同实施例1。

对比例3

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(A)、待检测乳品的前处理：

吸取母乳0.5mL，加入2mL二氯甲烷/甲醇(1:2，v/v)溶液于离心管中，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液于离心管中，得到上清液A；剩余沉淀物加0.5mL超纯水，涡旋混合后加2mL二氯甲烷甲醇(1:2，v/v)溶液，涡旋混合，超声5min；在4000rpm下离心10min，吸取上清液B；

合并上清液A、B，加入1mL超纯水，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相于另一离心管中，下层有机相中加入0.13mL 0.01M氯化钾水溶液和0.18mL甲醇，涡旋混合后在4000rpm下离心10min，吸取上层水相；

合并上述两次吸取的水相并用甲醇定容至5ml，得到待上机检测样本。

本对比例与实施例1的区别在于：使用对水相直接定容的方法替代实施例1中的氮吹后复溶的方法。

(B)、使用步骤(A)的上机检测样本进行UPLC-Q-TOF-MS检测；

(1)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件同实施例1；

(2)、所述UPLC-Q-TOF-MS检测的质谱条件同实施例1。

实施例2

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

本实施例除将步骤(A)中的待检测乳品“母乳0.5mL”替换为“溶解后的婴儿配方粉0.5mL，溶解方法为：称取1.3g的婴儿配方粉，加入9mL超纯水溶解并混匀”外，其余同实施例1。

注：所述婴儿配方粉为三元爱力优1段奶粉。

对比例4

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

本实施例除将步骤(A)中的待检测乳品“200μL母乳”替换为“溶解后的婴儿配方粉0.5mL，溶解方法为：称取1.3g的婴儿配方粉，加入9mL超纯水溶解并混匀”外，其余同对比例1。

注：所述婴儿配方粉为三元爱力优1段奶粉。

对比例5

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

本实施例除将步骤(A)中的待检测乳品“母乳0.5mL”替换为“溶解后的婴儿配方粉0.5mL，溶解方法为：称取1.3g的婴儿配方粉，加入9mL超纯水溶解并混匀”外，其余同对比例2。

注：所述婴儿配方粉为三元爱力优1段奶粉。

对比例6

一种乳品中神经节苷脂的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

本实施例除将步骤(A)中的待检测乳品“母乳0.5mL”替换为“溶解后的婴儿配方粉0.5mL，溶解方法为：称取1.3g的婴儿配方粉，加入9mL超纯水溶解并混匀”外，其余同对比例3。

注：所述婴儿配方粉为三元爱力优1段奶粉。

实验例1

使用本申请实施例1的方法与对比例1～3中方法检测同一母乳样品，定性检测到的神经节苷脂数量如下：

使用本申请实施例2的方法与对比例4～6中方法检测同一婴儿配方粉样品，定性检测到的神经节苷脂数量如下：

从定性结果可以看出，与对比方案相比，无论是检测母乳样品还是婴儿配方粉样品，本申请实施例1的方法定性出的GM3和GD3种类更多。

由于GD3含量随着泌乳期延长而下降，对比实验中使用的母乳为成熟乳，而成熟乳中重要的神经节苷脂为GM3，因此，母乳定性结果与文献记载相符。而以牛乳为主要原料生产的婴儿配方粉中的主要神经节苷脂为GD3，因此，婴儿配方粉中定性到更多的GD3。

实施例3

制备标准曲线对神经节苷脂中的GD3和GM3进行定量分析：

(1)、采用C18:0GM3-d5和C18 Ganglioside GD3-d3作为内标，采用C18:0GM3和Ganglioside GD3作为外标，配置成不同浓度的标准品溶液；

标曲范围为0.01mg/L-10mg/L；标准品浓度分别为0.01mg/L、0.025mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L。

(2)、利用实施例1中提供的UPLC-Q-TOF-MS检测的液相色谱条件和质谱条件，对标准品溶液进行检测；

然后，以外标浓度为横坐标，以外标峰面积与相应内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，所述标准曲线如图6、图7所示：

图6为本实施例提供的神经节苷脂GM3的标准曲线图；

图7为本实施例提供的神经节苷脂GD3的标准曲线图。

具体线性回归方程如下：

所述神经节苷脂中GM3的定量分析标准曲线为：

y＝3.547x-0.1923，R2＝0.9932；

所述神经节苷脂中GD3的定量分析标准曲线为：

y＝0.5765x+0.0123，R2＝0.9985。

参见图6、图7可知，本实施例GM3和GD3标准曲线的R2均大于0.99，这表明，在现有的仪器条件下，2种神经节苷脂在其标曲范围内均具有良好的线性条件。

(3)精密度检测：

(a)仪器精密度：白天、晚上分别间隔1h，重复进样6次，计算相对标准偏差RSD，确定方法的精密度。

(b)日内精密度：取同一母乳样品，经过本发明所述的方法进行样品处理，处理6个平行样，上机分析，计算相对标准偏差RSD。

(c)日间精密度：取同一母乳样品，经过本发明所述的方法进行样品处理，每天处理3个平行样，连续测定3天，计算相对标准偏差RSD。

具体精密度检测结果参见下述表1、表2；

表1：

表2：

本申请仪器精密度及方法精密度如表1和表2所示。仪器精密度的结果显示，2种神经节苷脂标准品分别在3个不同浓度条件下，外标离子色谱峰峰面积与内标离子色谱峰峰面积比值的RSD％值均小于15％，这表明本方法精密度符合要求。同时，根据日内精密度和日间精密度的结果显示，RSD％值也均小于15％，这表明本方法的稳定性好，可重复性高，能够满足大批量样品检测的要求，保证不同提取批次间的数据具有可比性。

(4)回收率检测：

分别设置样品组和样品加标组，样品加标组在处理前向母乳样品中加入一定浓度标准品，具体加标浓度如下：GM3:1mg/L，GD3:1mg/L，样品组加入等量的同一母乳样品，两组同时经前处理提取神经节苷脂并进样分析。每个样品处理3个平行，计算各组分回收率。

具体回收率检测结果参见下表：

从上表可以看出，2种神经节苷脂在加标浓度下，回收率分别为86.30％和91.13％，该回收率范围在精密仪器分析要求的80％-120％之间。因此，本文中的提取方法符合神经节苷脂仪器分析要求，可以确保神经节苷脂检测结果的准确性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。