抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3Sc及其选育方法、分子标记和用途

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是中国重要的粮食作物，由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是危害小麦生产的最重要的真菌病害之一。赤霉病大流行年份穗部发病率可达50％-100％，造成产量下降10％-40％(马忠华等，2020)。近几年，由于气候变暖、肥水条件和耕作制度改变的影响，小麦赤霉病在发生越来越频繁，小麦赤霉病对粮食的生产安全已经构成了严重威胁(Chen et al.，2019)。同时，小麦赤霉病病菌在侵染后还会产生次级代谢产物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)真菌毒素污染小麦及其制品，人或动物误食会引发呕吐、腹泻等疾病，对人畜的生命健康安全构成威胁，造成严重的食品安全问题(Merhej et al.，2011)。因此，挖掘新的小麦赤霉病抗性资源和选育抗小麦赤霉病新品种是实现小麦绿色安全生产急需突破的瓶颈。

小麦近缘物种是小麦遗传改良的重要基因资源宝库，富含抗病、抗逆、抗虫、大穗多粒、优质等优异基因。纤毛鹅观草(Roegneria ciliaris(Trin)Nevski，2n＝28，基因组SSYY)是鹅观草属四倍体多年生物种，具有耐寒、耐旱、耐高温高湿、多花多粒性以及抗病等优良性状。1983年，Muramatsu等以纤毛鹅观草作母本，普通小麦Inayama Komugi作父本杂交获得杂种F1，经染色体加倍育成了普通小麦-纤毛鹅观草双二倍体。翁益群等(1989)发现纤毛鹅观草对赤霉病抗性能力最强且显著高于苏麦3号。本实验室利用染色体工程，以普通小麦中国春为亲本与该双二倍体杂交和连续回交后自交，将纤毛鹅观草有益基因导入普通小麦，先后选育鉴定了多个普通小麦-纤毛鹅观草异附加系新种质(Jiang等，1993；王秀娥等，1997；Wang等，2001；Kong等，2018)。因此，纤毛鹅观草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一。

创制小麦-近缘物种异附加系，是突破小麦与近缘物种之间的染色体重组障碍、转移利用野生近缘物种优异基因的有效途径，也是外源基因育种利用的必备前提。异附加系的创制也是培育异代换系和易位系的中间材料，还可用于外源优异基因的定位、外源染色体特异分子标记的开发和筛选、研究染色体结构和基因组组成、分析染色体组间亲缘关系、物种起源与进化以及分离和克隆染色体特异DNA序列等，育种家相继选育并鉴定出大量的一系列的小麦异附加系，迄今已选育到添加有大麦、黑麦、簇毛麦、山羊草、偃麦草、鹅观草、大赖草和华山新麦草等200多种小麦近缘植物的异附加系(Du et al.，2014)。但是由于异附加系在转移有益基因的同时也将许多冗余基因带入小麦，且有时会导致细胞学上的不稳定和遗传学上的不平衡，或在后代传递过程中不稳定，所以在生产上一般难以直接利用，目前关于纤毛鹅观草添加系的应用也鲜有报道。

IT(Intron Targeting)分子标记是基于EST发展起来的新型PLUG分子标记(Ishikawa等，2007)。IT标记具有更高的多态性、扩增条带清晰、分辨率高而且在外源物种中具有很好的转移性(Poczai等，2008；Li等，2013)。Wang等根据簇毛麦4VS与普通小麦中国春4AL、4BS、4DS以及粗山羊草的4DS的内含子，开发了359个IT标记，其中232个标记可以在小麦-簇毛麦T4VS·4DL易位系上进行特异性扩增，多态率为64.62％(Wang等，2017)；Zhang等比较簇毛麦序列和小麦基因组序列，开发了841个定位到簇毛麦的1V-7V染色体的IT标记，多态率为51.79％(Zhang等，2017)，为提高簇毛麦外源染色质的鉴定效率提供了新手段。基于簇毛麦和普通小麦D亚基因组设计的IT标记，还被用于作为中间偃麦草染色体和大麦染色体特异的分子标记(Li等，2021；Yu等，2019)。基于簇毛麦和普通小麦D亚基因组设计的IT标记，筛选出纤毛鹅观草3S染色体的特异分子标记，对于纤毛鹅观草3S染色体结构变异体的准确鉴定和目的基因的挖掘具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

技术方案：所述的抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

以中国春为母本，普通小麦Ik-纤毛鹅观草双二倍体为父本，利用GISH/FISH技术从BC

其中，作为亲本的中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

进一步地，所述用单花滴注法鉴定二体异附加系DA3S

进一步地，所述禾谷镰刀菌悬液的最适浓度为5000个/mL，摇匀后使用。所述禾谷镰刀菌悬液的滴注量为每个所述小穗上滴注10μl。

进一步地，在滴注完成后，采用网室弥雾对接受赤霉菌悬液感染的每个所述小穗持续喷水保湿3天。

进一步地，在接种后21天进行赤霉病的病情调查并拍照，记录感病小穗率或病小穗数，病小穗率(PSS)＝(感染小穗数/总小穗数)×100％。

进一步地，抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

进一步地，提供一种检测前述与赤霉病抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对，

CIT03G053是如下的引物对：由序列如SEQ ID NO 3(TTGTGAGGCTGTTGTTCGTG)和SEQ ID NO 4(TGCAAGGACACTCTTCTCCA)所示分子组成的引物对用于检测序列如SEQIDNO.1所示的核酸分子；

CIT03G177是如下的引物对：由序列如SEQ ID NO 5(GGCTCAGTCCGCTAATGTTT)和SEQ ID NO 6(TCCTCCAGCATCTACAAGCC)所示分子组成的引物对用于检测序列如SEQIDNO 2所示的核酸分子；

SEQ ID NO.1：对应的基因序列

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SEQ ID NO.2：对应的基因序列

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进一步地，该引物的用途，如鉴定小麦-纤毛鹅观草结构变异体中是否含有3S染色体的用途；

进一步地，基于上述引物的PCR方法以及该方法用于鉴定3S染色体的用途。

进一步地，抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

本发明选育得到的小麦-纤毛鹅观草易位系二体异附加系DA3S

附图说明

图1小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

图2小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

图3小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

具体实施方式

实验材料：

普通小麦(Triticum aestivum)品种中国春和矮抗58由南京农业大学细胞遗传研究所引进和提供；纤毛鹅观草(Roegneria ciliaris，引种号W614249)引自WesternRegional Plant Introduction Station，USA；普通小麦日本小麦品种(Inayama Komugi，IK)和Inayama Komugi-纤毛鹅观草双二倍体(Inayama Komugi-R.ciliaris amphiploid，引种号TA3427)引自美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心(KSU WGRC，USA)；一整套Inayama Komugi-纤毛鹅观草二体异附加系DA1S

实施例1矮抗58背景中添加一对纤毛鹅观草3S

以中国春为母本，普通小麦Ik-纤毛鹅观草双二倍体为父本，利用GISH/FISH技术从BC

选普通小麦品种矮抗58正在开花的穗子，即穗子中部的小花花药呈淡绿色或微黄色，用中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

种植鉴定出的含有纯合纤毛鹅观草3S染色体的种子，即得到二体异附加系DA3S

本实施例一共完成检测矮抗58×DA3S

实施例2分子标记的获得

利用南京农业大学细胞遗传研究所前期开发的第3部分同源群的198个IT标记中国春、IK、纤毛鹅观草和IK-纤毛鹅观草双二倍体及DA3S

利用本实施例一92份矮抗58×DA3S

实施例3待测植株中分子标记CIT03G053和CIT03G177的检测

检测分子标记CIT03G053的引物为CIT03G053 Primer F和CIT03G053 Primer R，它们的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；CIT03G177的引物为CIT03G177PrimerF和CIT03G177 Primer R，它们的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

检测的过程如下：

提取92份矮抗58×DA3S

表1实施例3的PCR反应体系

涡旋混匀，离心后加一滴石蜡油，防止在PCR过程中水分蒸发。

PCR的反应程序如下表2所示：

表2实施例3的PCR扩增程序

PCR程序结束后，将扩增产物置于4℃冰箱进行保存。

PCR扩增产物的检测如下：在PCR扩增产物中加入2.0μL loading buffer，离心，取1.5-2μL PCR扩增产物加入8％聚丙烯酰胺凝胶中(39：1)进行电泳检测。电泳缓冲液1×TBE，电泳电压200V，电泳时间50min左右。电泳结束后，参照依据银染法对PCR扩增产物进行检测。银染方法：用0.1％AgNO

电泳检测的结果如图1所示：图1中，各泳道从左到右依次是Marker：分子量标记DL2000；-：F

实施例4：纯合的抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S

(1)小麦种子萌发：将种子放置于垫有两层滤纸的培养皿中，加ddH

(2)染色体中期同步化处理：观察小麦种子的根生长状态，待根长至约1.5-2cm时，直接向培养皿中加入2μmol/LAPM(amiprophos-methyl，甲基氨草磷)溶液至根被完全浸没(2μmol/L APM溶液现配现用)，之后将培养皿置于25℃培养箱生长处理2h，最长处理时间不能超过3h。

(3)笑气处理：APM溶液处理完小麦的根之后，用流动的水冲洗根部5min，直至将APM冲洗干净，剪根，把剪下来的根放到带孔的1.5mL的离心管中，之后用压强为0.8-1.0MP笑气处理1.5-2h。

(4)固定处理：用提前放在4℃冰箱中预冷的90％冰醋酸固定根7-10min，之后用吸水纸将根上的醋酸吸取干净，再将根尖转移到70％的酒精中-20℃保存。

根尖细胞中期染色体制片

染色体制片的方法是压片法，主要参照Gill and Kimber(1974)的方法稍作改动。试验中，从70％的酒精中取出根尖，放入滴有45％醋酸的白瓷盘中解离10min以上，切除根冠，切取根尖小部分分生区组织置于干净的世泰载玻片上，滴一滴45％的醋酸，盖上18mm×18mm干净的盖玻片，先用刀片垫在盖玻片一角，再用镊子或者牙签轻敲盖玻片，待细胞分散后，用酒精灯外焰轻轻烘烤载玻片，待盖玻片处雾气散开后，垫一层干燥的滤纸，轻轻按压载玻片；之后，放在相差显微镜下进行镜检，选取染色体形态较好、数目完整且分散度较好的制片放入-70℃冰箱中冷冻过夜。用双面刀片揭去盖玻片，无水乙醇脱水半小时以上，气干后进行后续荧光原位杂交实验。

全基因组DNA探针标记：

探针标记采用缺刻平移法，具体参照Zhang等(2004)的程序。所使用的全基因组DNA探针反应体系如下表3所示：

表3实施例4的全基因组DNA探针反应体系

在冰上操作，探针混合液混匀离心后，迅速将混合液置于PCR仪中，16℃反应2h，程序结束后将探针放在-20℃保存。

寡核苷酸探针的标记：

本研究所用的寡核苷酸探针(GAA)

荧光原位杂交：

荧光原位杂交过程中，杂交液的配制如表4：

表4实施例4的荧光原位杂交杂交液配制

将杂交液按上述配方依次加入200μL离心管，反复涡旋、离心1-2次，混匀，在105℃条件下变性13min，之后立即放入冰水中，防止单链复性。制片变性：制片在0.15mol/L的NaOH的70％酒精溶液中变性5min；之后，依次在70％、70％和100％的两个梯度的酒精中脱水，各5min；气干备用。杂交：每张制片滴加15μL杂交液，盖上20mm×20mm盖玻片，37℃杂交至少6h。洗片：将杂交完成的制片取出，轻轻甩去盖玻片，42℃水浴条件下，用ddH

从图3可以看出，该二体异附加系DA3S