丁酸梭菌SZ及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及丁酸梭菌SZ及其应用。

背景技术

丁酸梭菌，又名酪酸梭菌或丁酸梭状芽孢杆菌，是从健康人和动物肠道中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，该菌可发酵碳水化合物产生丁酸、乙酸和氢气等代谢产物，因其可形成内生芽孢而具有耐高温、耐胃酸和耐胆盐等抗逆特性，其在改善畜禽肠道健康方面具有重要作用。丁酸梭菌比一般的益生菌具有更显著的优势和市场前景，可作为我国饲料停抗后重要的抗生素替代物之一。

目前生产中使用的丁酸梭菌在特异性专用畜禽来源菌株的筛选、生物学性能和安全性评价与应用等方面仍存在一些问题。生产中筛选获得的丁酸梭菌菌株大部分为异源菌株，缺乏宿主特异性，造成其在特定畜禽肠道定植能力差；不同来源丁酸梭菌菌株生物学功能差异大；不同菌株功能酶基因和特定功能基因表达不清楚；未对使用的丁酸梭菌菌株的安全性进行全基因组序列系统评价，部分菌株存在耐药基因和毒性基因等安全风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪源特异性丁酸梭菌SZ。

本发明的另一目的是提供丁酸梭菌SZ的生物学特性与全基因组序列系统评价与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株分离自健康猪肠道的丁酸梭菌Clostridium butyricum SZ，该菌株经特异性丁酸梭菌引物扩增，获得片段长度为770bp的丁酸梭菌特异性序列，该序列与NCBI数据库中丁酸梭菌序列的同源性均大于99％，而与其它梭菌属的同源性均小于92％。菌株SZ已于2022年4月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号CGMCC NO.24743，建议的分类命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum。

第二方面，本发明提供含有所述丁酸梭菌SZ的菌剂。

第三方面，本发明提供丁酸梭菌SZ液态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化；

(2)种子液的制备：将活化后的菌种接种于种子培养基中进行厌氧培养；

(3)发酵罐扩大培养：将步骤(2)得到的种子液接入发酵培养基中进行厌氧培养，所得发酵液即为液态菌剂。

所述种子培养基为：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、葡萄糖2.0％、氯化钠0.5％和抗坏血酸0.05％，pH7.5±0.1。

所述发酵培养基为：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、葡萄糖2.0％、乳糖0.5％、(NH

前述的方法，步骤(2)和(3)培养的温度为37℃。

第四方面，本发明提供丁酸梭菌SZ固态菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化；

(2)种子液的制备：将活化后的菌种接种于种子培养基中进行厌氧培养；

(3)固态发酵：将步骤(2)得到的种子液接种于固态发酵培养基，同时接入枯草芽孢杆菌和/或酿酒酵母进行混合厌氧发酵。

所述固态发酵培养基按质量百分比计为：玉米粉5％、稻壳粉25％、麸皮15％、喷浆玉米皮15％、葡萄糖1.5％、石粉6％、硫酸铵2.5％和水30％。

优选地，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.1180，所述酿酒酵母为菌株Y3。

进一步地，所述固态发酵培养基中接入的丁酸梭菌SZ、枯草芽孢杆菌CGMCCNO.1180和酿酒酵母Y3的活菌数之比为1:10:3。

前述的方法，厌氧发酵的温度为30～40℃。

第五方面，本发明提供所述丁酸梭菌SZ或含有所述丁酸梭菌SZ的菌剂或按照所述方法制备的液态菌剂或按照所述方法制备的固态菌剂的以下任一应用：

1)用作饲料添加剂；

2)用于生产淀粉酶和纤维素酶等酶制剂；

3)用于制备改善动物肠道健康的生物制剂。

4)用于改善动物肠道健康。

所述动物包括但不限于猪。

第六方面，本发明提供以丁酸梭菌SZ的生物学特性及全基因组序列系统全面评价其功效和安全性的方法。该方法包括菌株菌落形态、革兰氏染色形态和电镜形态特征观察，发酵活菌数、淀粉酶和纤维素酶、丁酸和总短链脂肪酸产量、芽孢存活率及模拟胃液和模拟小肠液存活率等功能和抗逆特性，以及通过二代和三代测序技术对菌株功能酶基因表达和特定功能基因表达及安全性进行系统全面评价。

丁酸梭菌SZ的形态特征：菌落呈圆形或类圆形、颜色为白色至奶油色、表面光滑湿润、稍凸；革兰氏阳性，杆状或梭杆状，菌体中有圆形或椭圆形芽孢，部分芽孢脱落；电镜形态为长杆状或短杆状，部分为梭杆状或脱落芽孢。

丁酸梭菌SZ具有优异的生物学功能和抗逆特性：该菌株发酵活菌数可达到4.5×10

丁酸梭菌SZ全基因组序列中功能酶基因表达和特定功能基因表达丰富：经二代测序与三代测序数据组装拼接获得该菌株基因组长度为3256124bp，全基因组序列中α-淀粉酶、纤维素酶CelE、蛋白酶YdeA、蛋白酶YhbU、Lon蛋白酶1和2、ATP-依赖金属蛋白酶FtsH、锌离子依赖金属蛋白酶Rip2、β-桶状增强蛋白酶、溶血磷脂酶L2、三酰基甘油酰基水解酶、溶菌酶、铁氢化酶1、莽草酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶2、L-乳酸脱氢酶2、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘油1磷酸脱氢酶、D-氨基酸脱氢酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、芽孢蛋白Ytfj、芽孢萌发蛋白A1、芽孢光产物裂解酶等功能酶基因表达和特定功能基因表达丰度均较高。

丁酸梭菌SZ全基因组序列中不存在已知毒力因子和耐药的编码基因：该菌株全基因组序列与最新数据库(VFDB等)中存储的序列进行对比，发现其不存在已知毒力因子的编码基因；与最新耐药基因分析数据库(CARD等)对比，发现其不存在已知耐药的编码基因。

第七方面，本发明提供利用该丁酸梭菌菌株制备猪专用丁酸梭菌发酵制剂及其在改善猪肠道健康上的应用。

本发明所述的丁酸梭菌发酵制剂为含有丁酸梭菌SZ的液态菌剂或固态菌剂，进一步还可包括枯草芽孢杆菌或酿酒酵母中的一种或多种活性成分，并配以相应的辅料制备得到。

本发明还提供丁酸梭菌SZ发酵制剂在改善猪肠道健康上的应用。该丁酸梭菌制剂可按1×10

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种分离自健康猪肠道的丁酸梭菌SZ，并研究了该菌的生物学特性及全基因组序列系统评价与应用，该菌株具有优异的生物学功能和抗逆特性，全基因组序列中α-淀粉酶、纤维素酶CelE、蛋白酶YdeA、蛋白酶YhbU、Lon蛋白酶1和2、ATP-依赖金属蛋白酶FtsH、锌离子依赖金属蛋白酶Rip2、β-桶状增强蛋白酶、溶血磷脂酶L2、三酰基甘油酰基水解酶、溶菌酶、铁氢化酶1、莽草酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶2、L-乳酸脱氢酶2、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘油1磷酸脱氢酶、D-氨基酸脱氢酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、芽孢蛋白Ytfj、芽孢萌发蛋白A1、芽孢光产物裂解酶等功能酶基因表达和特定功能基因表达丰富，且不存在已知毒力因子和耐药的编码基因，其制剂可显著提高猪肠道中乳酸菌和双歧杆菌等益生菌丰度，显著降低产气荚膜梭菌和大肠杆菌等致病菌的丰度，并显著改善肠道形态结构和屏障功能。

附图说明

图1为本发明丁酸梭菌SZ单菌落形态图。

图2为本发明丁酸梭菌SZ革兰氏染色镜检图。

图3为本发明丁酸梭菌SZ电镜形态图。

图4为本发明丁酸梭菌SZ淀粉酶平板图。

图5为本发明丁酸梭菌SZ纤维素酶平板图。

图6为本发明丁酸梭菌SZ二代和三代测序混合拼接图。

图7为本发明丁酸梭菌SZ基因组序列中功能酶基因表达图。

图8为本发明丁酸梭菌SZ基因组中特定功能基因表达图。

图6～图8中，1、2、3表示拼接的大片段(contig)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1猪源特异性丁酸梭菌SZ的分离和鉴定

1、样品采集：菌株分离的样品来自健康哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和母猪的新鲜粪便。

2、样品分离：用生理盐水将不同猪粪便样品稀释后于80℃水浴中加热10分钟；然后接种于强化梭菌液体培养基，37℃厌氧培养48小时，再次水浴加热10分钟，接种于梭菌选择性液体培养基厌氧培养48小时；梯度稀释培养液后涂布梭菌选择性培养基平板，37℃厌氧培养48小时。

3、样品鉴定：通过菌落形态和革兰氏染色镜检对菌株进行初步鉴定，从中挑选出培养特征、菌落形态和镜检形态符合丁酸梭菌特征的菌株连续划线纯化培养三代，分别标记编号进入下一步鉴定。挑取单菌落接种于强化梭菌液体培养基培养24小时，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌株基因组DNA。通过特异性的丁酸梭菌引物：F：5'-CAGCAGCAGATGGTCCAATG-3'，R：5'-GCGATTGGAGTGATTAATTC-3'，扩增获得片段长度为770bp的丁酸梭菌特异性序列(SEQ ID NO:1)，该序列与NCBI数据库中丁酸梭菌序列的同源性均大于99％，而与其它梭菌属的同源性均小于92％，确定菌株SZ为丁酸梭菌Clostridiumbutyricum。该菌株已于2022年4月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC NO.24743，建议的分类命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum。

实施例2猪源特异性丁酸梭菌SZ的生物学特性及全基因组序列系统全面评价

通过对菌株菌落形态、革兰氏染色镜检形态和电镜形态特征观察，发酵活菌数、淀粉酶和纤维素酶、丁酸和总短链脂肪酸产量、芽孢存活率及模拟胃液和模拟小肠液存活率等功能和抗逆特性研究，以及通过二代和三代测序技术对菌株功能酶基因表达和特定功能基因表达及安全性进行系统全面评价。

1、菌株菌落形态：采用体式荧光显微镜(Leica M205FA)对菌株菌落形态进行拍照和特征观察。

2、革兰氏染色镜检形态：采用革兰氏染色法进行染色，用正置荧光显微镜(AxioImager A2)油镜进行拍照和观察。

3、电镜形态：收集培养好的新鲜菌体，清洗固定后用乙醇水溶液脱水，干燥后使用高真空镀膜仪(Leica EM ACE600)喷金，采用日立高新扫描电子显微镜(SU3500)进行拍照和观察。

4、取上述编号菌株接种到强化梭菌液体培养基厌氧培养16～24h，测得其OD650，分别接种相同OD量的菌液到强化梭菌液体培养基厌氧培养48h，得到各菌株发酵液，用于比较不同菌株的生物学性能和抗逆性。

5、活菌数：采用平板计算法测定各菌株厌氧培养48h后发酵液中丁酸梭菌的活菌数。

6、淀粉酶活力：取上述相同OD量的种子液滴种到淀粉平板(可溶性淀粉0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，NaCl 0.5％，牛肉膏0.5％，琼脂0.8％，pH 7.1±0.1，121℃，20min灭菌备用)，厌氧培养48h，在其表面覆盖一层碘液(5mmol/L I

7、纤维素酶活力：取上述相同OD量的种子液滴种到纤维素刚果红培养基平板(CMC-Na 0.2％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.3％，牛肉膏0.5％，MgSO

8、丁酸和总短链脂肪酸产量：采用气相色谱法测定上述发酵液中各短链脂肪酸的含量。

9、芽孢存活率：比较80℃水浴30s和3min和不加热各菌株发酵液的活菌数，计算芽孢存活率。

10、模拟胃液存活率：胃蛋白酶(3g/L)，溶于0.2％ NaCl溶液，用浓盐酸调pH到2.5。比较模拟胃液处理3h前后的活菌数。

11、模拟小肠液存活率：胰蛋白酶(1g/L)+胆盐(1g/L)溶于0.68％ KH

12、丁酸梭菌SZ生物学功能和抗逆特性见表1。

表1丁酸梭菌SZ生物学功能和抗逆特性

13、全基因组序列评价：对菌株DNA分别进行二代和三代测序，二代测序采用illumina测序技术，三代测序采用齐碳科技试剂盒和测序仪。采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌株基因组DNA。采用核酸蛋白荧光定量仪(Qubit 4Fluorometer)和启衡星StarLighter dsDNA高灵敏检测试剂盒(FS-TI00I)测定DNA浓度。采用齐碳科技建库试剂盒(QSK-V1.1.1)进行末端修复和纯化、测序接头连接、连接产物纯化和测所得文库浓度。采用测序芯片(QCell-384)和纳米孔基因测序仪(QNome-3841)进行上机测序。

经二代测序与三代测序数据组装拼接获得该菌株基因组长度为3256124bp，丁酸梭菌SZ全基因组序列中功能酶基因表达和特定功能基因表达丰富：全基因组序列中α-淀粉酶、纤维素酶CelE、蛋白酶YdeA、蛋白酶YhbU、Lon蛋白酶1和2、ATP-依赖金属蛋白酶FtsH、锌离子依赖金属蛋白酶Rip2、β-桶状增强蛋白酶、溶血磷脂酶L2、三酰基甘油酰基水解酶、溶菌酶、铁氢化酶1、莽草酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶2、L-乳酸脱氢酶2、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘油1磷酸脱氢酶、D-氨基酸脱氢酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、芽孢蛋白Ytfj、芽孢萌发蛋白A1、芽孢光产物裂解酶等功能酶基因表达和特定功能基因表达丰度均较高。

丁酸梭菌SZ全基因组序列中不存在已知毒力因子和耐药的编码基因：该菌株全基因组序列与最新数据库(VFDB等)中存储的序列进行对比，发现其不存在已知毒力因子的编码基因；与最新耐药基因分析数据库(CARD等)对比，发现其不存在已知耐药的编码基因。

丁酸梭菌SZ单菌落形态见图1。

丁酸梭菌SZ革兰氏染色镜检结果见图2。

丁酸梭菌SZ电镜形态见图3。

丁酸梭菌SZ淀粉酶平板图见图4。

丁酸梭菌SZ纤维素酶平板图见图5。

丁酸梭菌SZ二代和三代测序混合拼接图见图6。

丁酸梭菌SZ基因组序列中功能酶基因表达图见图7。

丁酸梭菌SZ基因组中特定功能基因表达图见图8。

实施例3猪专用丁酸梭菌发酵制剂制备及其在改善猪肠道健康中的应用

1、菌种活化：取甘油管菌种于37℃水浴中快速解冻，按1v/v％量接种于灭菌的丁酸梭菌SZ种子培养基(50℃接种)，加2厘米厚的灭菌液体石蜡液封或置于厌氧罐中，静置或完全厌氧培养24～48小时。

2、种子液培养：取活化后的菌种培养液按5v/v％量接种于灭菌的丁酸梭菌SZ种子培养基(50℃接种)，加2厘米厚的灭菌液体石蜡液封或置于厌氧罐中，静置或完全厌氧培养18～24小时；优选地，可在约5小时开始产气后放摇床50-100r/min低速摇动，10几小时产气停止后继续静置或完全厌氧培养。

3、发酵罐扩大培养：取种子液按5％量接种于灭菌的丁酸梭菌SZ发酵培养基(50℃接种)，密封发酵罐静置培养，约5小时开始产气后打开排气管，并保持50-100r/min进行搅拌，十几个小时产气停止后继续静置培养至18～48小时，发酵好的丁酸梭菌可用平板计数法或血球计数板计数，革兰氏染色观察菌株形态和纯度。

上述丁酸梭菌SZ发酵液可采用常规技术手段，加入微生物制剂领域允许的辅料直接制备为液态菌剂或固态菌剂。

优选地，可进一步制备固态发酵饲料。将上述发酵罐扩大培养的发酵也作为丁酸梭菌SZ种子液，接种于固态发酵培养基，与枯草芽孢杆菌或酿酒酵母就任一单一菌种或复合菌种混合，利用枯草芽孢杆菌或酿酒酵母先消耗掉固态培养基中的氧气，在发酵罐(或发酵桶、发酵袋、发酵池)30～40℃密闭生物厌氧发酵3～4天。每天观察发酵进展，按照发酵料指标测定发酵前后指标。

更优选地，枯草芽孢杆菌为菌株CGMCC NO.1180，酿酒酵母为菌株Y3。

枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1180可参见CN200410086557.8。

酿酒酵母Y3可参见“产纤维素酶酵母菌的筛选及鉴定”(张璐璐等，饲料工业，2016)。

在固态发酵培养基中接入的丁酸梭菌SZ、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1180和酿酒酵母Y3的活菌数之比为1:10:3。采用复合菌种进行固态发酵之后，发酵产物包括：小肽含量≥15％，丁酸含量≥5mmol/kg，芽孢杆菌活菌数≥1.0×10

丁酸梭菌SZ种子培养基：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、葡萄糖2.0％、氯化钠0.5％、抗坏血酸0.05％、调节pH 7.5±0.1，灭菌条件：121℃灭菌20min。

丁酸梭菌SZ发酵培养基：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、葡萄糖2.0％、乳糖0.5％、(NH

丁酸梭菌SZ固态培养基(按质量百分比计)：玉米粉5％、稻壳粉25％、麸皮15％、喷浆玉米皮15％、葡萄糖1.5％、石粉6％、硫酸铵2.5％和水30％。

实施例4猪专用丁酸梭菌发酵制剂在改善猪肠道健康中的应用

试验选用120头体重9.8kg左右的健康杜×长×大保育猪，按体重随机分到4个处理组，每组3个重复，每个重复圈10头保育猪。4个处理组如下：对照组饲喂基础日粮，丁酸梭菌组分别在基础日粮的基础上添加1×10

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。