一种产β-榄香烯的工程菌及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种产β-榄香烯的工程菌及应用，特别涉及一种莴苣来源的吉马烯A合成酶及其突变株的制备及在β-榄香烯的高效生物合成。

背景技术

β-榄香烯是从传统中药温郁金中分离出的一种倍半萜类成分，因其抗肿瘤活性强、作用范围广、毒副作用轻微及不易产生耐药性等优点而具有广泛的应用前景。目前β-榄香烯的获取主要依靠从温郁金中分离提取，但传统的生产方式分离纯化难度大、得率低且成本高，严重阻碍了β-榄香烯的大规模生产与应用。随着合成生物学的发展，利用微生物构建细胞工厂生物合成天然药物成为研究热点，也为β-榄香烯的生产提供了新的思路。

β-榄香烯是一种倍半萜烯，属于倍半萜类大家族。一般来说，植物来源的倍半萜以异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)作为基本的结构元件。IPP和DMAPP在植物中主要通过甲羟戊酸途径(MVA)和甲基赤藓糖醇4-磷酸途径(MEP)进行合成。1分子IPP和1分子DMAPP在异戊烯转移酶的催化作用下，头尾缩合生成香叶基焦磷酸(GPP)，GPP再与1分子IPP缩合生成—法尼基焦磷酸(FPP)，后者在吉马烯A合成酶的作用下生成吉马烯A，进一步发生Cope重排，生成β-榄香烯。目前，在酵母细胞中可构建了吉马烯A的生物合成途径，可用于β-榄香烯的生产。但由于酵母细胞发酵时间长，最短约72小时，产量达到309.8mg/L，时空产率为4.20mg/L.h。张等人构建的酵母工程菌诱导培养144小时后，产量达到469mg/L，时空产率为3.26mg/L.h。

目前国内外文献报道中的β-榄香烯的生物合成多在酿酒酵母中进行，目前还未见在大肠杆菌中进行β-榄香烯全生物合成的报道，而大肠杆菌由于生长迅速，遗传操作简单，发酵方法简单成熟，用于中药活性成分的生物全合成具有很大的优势。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种重组菌，为体内含有或表达异戊烯基焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP生物合成途径相关酶基因以及法尼基焦磷酸合成酶，莴苣来源的吉马烯A合成酶基因突变体。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶基因的编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。所述莴苣来源的吉马烯A合成酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶BL21氨基酸序列中第229位、第243位、第364位、第392位、第410位中至少一个进行定点突变。其中第364位的I突变为K，第410位的T突变为S，第392位的T突变为A，第392位的T突变为V，第229位的A突变为S，第243位的S突变为N；

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶氨基酸序列中第364位的I突变为K和第410位的T突变为S。

本发明的第二个目的是提供一种重组基因工程菌，其特征在于由莴苣来源的吉马烯A合成酶编码基因构建的重组载体、pBbA5c-MM重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)star中得到；

所述莴苣来源的吉马烯A合成酶编码基因构建的重组载体由莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体与pET28a载体连接得到。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶基因的编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。所述莴苣来源的吉马烯A合成酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶氨基酸序列中第38位、第58位、第229位、第243位、第364位、第392位、第410位和第492位中至少一个进行定点突变。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶氨基酸序列中第364位的I突变为K和第410位的T突变为S。

本发明的第三个目的是提供上述重组基因工程菌在制备吉马烯A及β-榄香烯中的应用。

作为优选，该应用具体是将上述重组基因工程菌在SBMSE培养基中至OD

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种含有所述莴苣来源的吉马烯A合成酶或突变体编码基因的重组载体。

上述技术方案所述莴苣来源的吉马烯A合成酶或突变体编码基因构建的重组载体，其中：所述重组载体为pET28a-LTC2 I364K-T410S，是由SEQ.ID NO.1所示的莴苣来源的吉马烯A合成酶编码基因与pET28a载体连接得到。

上述技术方案所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，其中：所述重组基因工程菌为E.coli BL21(DE3)star MM，是由重组载体pBbA5c-MM及pET28a-LTC2 I364K-T410S转化至E.coli BL21(DE3)star中得到。重组载体pBbA5c-MM在大肠杆菌细胞中的表达可将生成吉马烯A合成酶的前体FPP。

上述技术方案所述吉马烯A合成酶及突变体在制备吉马烯A及β-榄香烯的应用。上述技术方案所述的应用，其中，所述的应用为：采用定点突变的方法对关键元件LTC2进行改造以提高LTC2的催化活性。基于文献调研和同源序列对比结果选定突变位点，获得了10个突变体，单突变T410S、T392A、T392V、A229S、S243N和I364K体外催化β-榄香烯产量是野生型的1.27倍、1.11倍、1.12倍、1.08倍、1.10倍和1.21倍。接着，构建LTC2双突变载体，T392A-T410S、S243N-T410S和I364K-T410S在SBMSN培养基中诱导培养18h所生成的β-榄香烯产量分别为73.60mg/L、98.20mg/L和126.39mg/L，是野生型产率的1.10倍、1.47倍和1.89倍。

本发明还提供了一种上述β-榄香烯工程菌株的应用，通过诱导工程菌株中LTC2突变酶I364K-T410S及外源MVA生物合成途径的表达生产β-榄香烯，具体为：将工程菌E.coliBL21(DE3)star LTC2 I364K-T410S+pBbA5c-MM活化后转接到SBMSN培养基中培养至OD600为0.6-1.0，加入IPTG诱导，终浓度为0.4mM，25℃发酵18h，并加入10％的正十二烷富集产物，发酵结束后，直接离心收集上层产物，产量达到126.39mg/L，本发明的工程菌具有目前报道最高的时空产量，适用于β-榄香烯的工业化生产。

附图说明

图1β-榄香烯前体在大肠杆菌中的生物合成途径及重组质粒组成

图2大肠杆菌宿主菌及培养基的优化

图3LTC2及突变体产β-榄香烯产量及发酵菌体OD的比较

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

图1是β-榄香烯前体在大肠杆菌中的生物合成途径及重组质粒组成示意图。

实施例1高产FPP前体的工程菌菌株及培养基筛选

选择E.coli BL21(DE3)、E.coli BW25113、E.coli JM109(DE3)、E.coli BL21 txB(DE3)和E.coli BL21 Star(DE3)作为宿主细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，热激法将pBbA5c-MM质粒(大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA))引入上述不同的大肠杆菌宿主细胞中，氯霉素(25μg/mL)抗性筛选阳性克隆，获得MM工程菌。

将构建成功的MM工程菌分别在三种不同的培养基(SBMSN培养基、LB培养基、YM9培养基)中进行IPTG诱导表达，测定其生物合成FPP的能力。在大肠杆菌中存在焦磷酸酶，FPP被进一步水解生成法尼醇，所以通过测定工程菌生成的法尼醇的产量推断其生成FPP的能力。从图2结果表明不同宿主的MM工程菌在SBMSN培养基中诱导发酵产生不同量法尼醇，以MM-BL21为例，在SBMSN培养基中诱导发酵产生的法尼醇分别是在LB培养基和YM9培养基诱导发酵产生的法尼醇的4.88倍和3.34倍。在以SBMSN培养基时，MM-BL21 star诱导发酵产生的法尼醇更多，经过18小时摇瓶发酵，产生了7.83mg/L的法尼醇。因此，选择BL21 star作为表达菌株，SBMSN作为培养基进行后续的筛选。

SBMSN培养基配方为：蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH

YM9培养基配方为：酵母提取物2g，Na

LB培养基按常规配置。

实施例2LTC2突变酶的构建及分析

通过文献查阅及同源序列比对，LTC2的38位(苏氨酸)、58位(亮氨酸)、229位(丙氨酸)、243位(丝氨酸)、364位(异亮氨酸)、392位(苏氨酸)、410位(苏氨酸)和492位(异亮氨酸)，进行定点突变，采用Fast Mutagenesis System试剂盒，突变引物见表1。

取PCR产物20μL，加入DMT酶1μL，充分混匀，37℃消化1h。取DMT酶消化产物5μL，加入到50μL E.coli DMT感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min；水浴42℃热激1min，立即取出，继续冰上放置2min；加入500μL无抗LB培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；5000rpm离心1min，弃上清至终体积200μL；均匀涂布至含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养筛选获得阳性克隆，经PCR鉴定后确定为突变质粒，突变后的质粒转入BL21(DE3)进行诱导表达，提取粗酶液，加入FPP作为底物，30℃，280rpm，反应2h。同时用固相微萃取顶空采集样品，反应结束后GC分析产物，经产量计算，T410S、T392A、T392V、A229S、S243N和I364K有利于提高LTC2催化FPP生成β-榄香烯的产量，是野生型的1.27倍、1.11倍、1.12倍、1.08倍、1.10倍和1.21倍。

在此基础上进一步构建双突变，获得了LTC2-S243N-T410S、LTC2-I364K-T410S、LTC2-T392A-T410S、LTC2-T392V-T410S共4个双突变基因，突变后的质粒转入BL21(DE3)进行诱导表达，提取粗酶液，加入FPP作为反应底物，30℃，280rpm，反应2h。同时用固相微萃取顶空采集样品，反应结束后GC分析产物，经产量计算，LTC2-T392A-T410S和LTC2-S243N-T410S有利于提高LTC2催化FPP生成β-榄香烯的产量；产量是野生型的1.40倍和1.09倍。

表1定点突变LTC2中所用的引物

3携带LTC2突变酶的工程菌产β-榄香烯的分析

将PET-28a-LTC2-T410S、PET-28a-LTC2-T392A、PET-28a-LTC2-T392V、PET-28a-LTC2-S243N、PET-28a-LTC2-I364K、PET-28a-LTC2-T392A-T410S、PET-28a-LTC2-T392V-T410S、PET-28a-LTC2-S243N-T410S和PET-28a-LTC2-I364K-T410S质粒采用热激法转化至含有pBbA5c-M-M质粒的E.coli BL21star(DE3)中，用通用引物T7和进行菌落PCR检测确定阳性克隆，进而分别在SBMSN培养基中进行诱导发酵18h，获得含有吉马烯A的培养液；并采用正十二烷覆盖收集挥发性吉马烯A产物，经260℃以上高温转化后生成β-榄香烯。测定其摇瓶发酵生成β-榄香烯的产量。通过GC分析，MM-LTC2-LTC2-I364K-T410S S-BL21 star(126.39mg/L)相较于野生型MM-LTC2-BL21 star(66.71mg/L)，摇瓶发酵产生的β-榄香烯产量有所提高。β-榄香烯产量最高的工程菌为MM-LTC2-I364K-T410S-BL21 star，β-榄香烯产量达到了126.39mg/L，是野生型的1.89倍。

图3LTC2及突变体产β-榄香烯产量及发酵菌体OD的比较结果。

本发明利用大肠杆菌为宿主，构建了β-榄香烯异源生物合成工程菌，通过宿主细胞、培养基的优化提高前体FPP的供应，并对关键酶吉马烯A合成酶的筛选和突变改造，使在大肠杆菌中生物合成β-榄香烯的产量提高到了126.39mg/L。继续通过上罐发酵，将获得更高的β-榄香烯产量，为高效合成中药抗癌活性成分β-榄香烯奠定了基础。