一种评估干细胞对免疫细胞效能的方法

技术领域

本发明属于免疫效能评价技术领域，具体涉及一种评估干细胞对免疫细胞效能的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)可通过分泌免疫调节因子、细胞因子、生长因子、细胞外囊泡(EV)等生物活性因子调节一系列生理过程，具有抗凋亡、抗纤维化、抗氧化和免疫调节作用。MSCs通过释放miRNA和免疫调节蛋白作用于多种免疫细胞(巨噬细胞、树突状细胞、Th1和Th17细胞)，使其发生表型转化，转变为免疫抑制细胞(M2巨噬细胞、耐受性DC和Treg细胞)。最新研究表明：MSCs干预PBMC中T细胞的活化、增殖和表型转化，并增加Tregs的水平，从而发挥免疫调节作用，其中Treg细胞通过细胞接触机制，对效应T细胞增殖和细胞因子产生有强大的抑制作用。

单个核细胞(PBMC)中的T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化，表现为增殖能力增强。淋巴细胞转化率(增殖率)的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。目前尚没有明确的标准及检测方法，采用干细胞作用免疫系统作为机体免疫功能有效评估手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种评估干细胞对免疫细胞效能的方法。

一种评估干细胞对免疫细胞效能的方法，干细胞与免疫细胞的共培养后，免疫细胞增殖能力发生不同程度减弱，换算为干细胞对免疫细胞的抑制率，进而评估干细胞的免疫调节能力。

所述干细胞为人神经干细胞或人脐带间充质干细胞。

所述免疫细胞为外周单个核细胞。

所述抑制率的计算公式为：(实验组增殖百分比-植物血凝素组增殖百分比)/植物血凝素组增殖百分比×100％。

当所述干细胞为人脐带间充质干细胞，免疫细胞为外周单个核细胞时，人脐带间充质干细胞抑制外周单个核细胞体外增殖能力为：低剂量组即人脐带间充质干细胞：外周单个核细胞为0.001：1时，人脐带间充质干细胞对植物血凝素诱导的外周单个核细胞增殖起促进作用，随着作用浓度增加，抑制率升高，人脐带间充质干细胞：外周单个核细胞为0.2：1时，外周单个核细胞增殖抑制率达80％以上。

当所述干细胞为人神经干细胞，免疫细胞为外周单个核细胞时，人神经干细胞抑制外周单个核细胞体外增殖能力为：低剂量组即人神经干细胞：外周单个核细胞为0.001：1-0.01：1时，人神经干细胞对植物血凝素诱导的外周单个核细胞增殖起促进作用，随着作用浓度增加，抑制率升高，人神经干细胞：外周单个核细胞为0.25：1时抑制30％的外周单个核细胞体外增殖，人神经干细胞：外周单个核细胞为1:1时完全抑制植物血凝素诱导的外周单个核细胞体外增殖。

本发明的有益效果：本发明检测外周单个核细胞在植物血凝素作用后的增殖结果，在经干细胞与外周单个核细胞共培养后，外周单个核细胞增殖能力发生不同程度减弱，换算为干细胞对外周单个核细胞的抑制率，进而评估干细胞的免疫调节能力。利用该方法，检测了人脐带来源间充质干细胞(hUMSCs)及神经干细胞(hNSCs)在不同浓度下对外周单个核细胞(PBMC)的增殖抑制结果，得出有效作用浓度；可在患者利用干细胞治疗免疫功能相关疾病时，进行体外评估干细胞免疫效能，提示有效干细胞治疗浓度。

附图说明

图1为hUMSCs抑制PBMC增殖实验。

图2为hNSCs抑制PBMC增殖实验。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例采用的仪器见表1：

表1

下述实施例采用的试剂见表2：

表2

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下述实施例采用的耗材见表3：

表3

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实施例1

1.外周单个核细胞(PBMC)的分离

采集外周血2ml于抗凝管中。PBMC分离：Ficoll梯度离心法分离PBMC，取3mLFicoll-Paque分离液至离心管中；用PBS 1:1稀释2mL血液样品；小心将稀释的血液样品4mL铺在Ficoll-Paque分离液面上；关闭制动，20℃条件下400g离心30min，得到分层细胞，中间白膜层即为PBMC，用无菌移液管将PBMC层转移至一支无菌离心管中，加入3倍体积的PBS溶液，轻轻吹打重悬细胞以清洗细胞，500g离心10min，弃上清，重复清洗步骤1次，用RPMI-1640完全培养基(含10％FBS)重悬所得细胞。

2.干细胞与免疫细胞的共培养刺激

2.1悬浮培养-人神经干细胞(hNSCs)与PBMC体外共培养

取需检测的hNSCs用25μg/mL丝裂霉素C于37℃预处理30min，抑制其过度增殖。分别以每孔1.0×10

2.2贴壁培养-人脐带间充质干细胞(hUMSCs)与PBMC体外共培养取需检测的hUMSCs，分别以每孔1.0×10

3.免疫细胞EDU增殖检测

收集共培养后的PBMC于新的孔板中；每孔加入EdU溶液(10μM)，置于37℃培养箱孵育2h，收集细胞于流式管中，加3mL 1％BSA溶液清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清，加100μL 1％BSA溶液重悬细胞；每管中加入Fc受体结合抑制剂，室温孵育15min，阻断非特异性Fc受体介导的非特异性结合；每管加入对应表面抗体，常温避光染色30min，加3mL 1％BSA溶液清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清收集细胞；各管中加固定缓冲液100μL，充分混匀，常温避光孵育15min，加3mL 1％BSA溶液清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清收集细胞；向各管加入1×破膜/清洗缓冲液100μL，充分混匀，常温避光孵育15min；将提前配制好的含有Alexa Fluor

干细胞的免疫抑制能力评估：

1.hUMSCs抑制PBMC体外增殖能力

如图1所示，hUMSCs在图中简写为UMSC，PHA-L简写为PHA，低剂量组即UMSC：PBMC：为0.001：1时，hUMSCs对PHA-L诱导的PBMC增殖起促进作用，随着作用浓度增加，抑制率升高，UMSC：PBMC：为0.2：1时，PBMC增殖抑制率达80％以上。

抑制率＝(实验组增殖百分比-PHA组增殖百分比)/PHA组增殖百分比

×100％

2.hNSCs抑制PBMC体外增殖能力

对hNSCs(简写为NSC)及PBMC行体外共培养发现，PHA可刺激PBMC体外增殖(P＝0.006)，以PHA为对照组，计算hNSCs对PBMC的抑制率，结果如图2所示，低剂量hNSCs(0.001倍和0.01倍)可促进PBMC增殖(P<0.01)，随着浓度增加发挥免疫抑制作用，0.25倍hNSCs可抑制约30％的PBMC体外增殖(P<0.05)，1:1浓度的hNSCs完全抑制PHA诱导的PBMC体外增殖(P<0.01)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。