常温检测超微量新冠病毒RNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种由靶RNA识别扩增模块和基于CRISPR-Cas12a的二重信号放大模块构成的常温检测超微量新冠病毒RNA的试剂盒及方法。

背景技术

传统的RNA检测方法主要包括测序、Northern分析、PCR、微阵列和荧光探针等方法。测序法能够较为全面的展示样本内的RNA信息，但是该方法成本较高、耗时较长，需要利用复杂、昂贵的仪器，难以在基层进行广泛地推广。Northern分析简单易行，成本低廉，但该方法耗时长、灵敏度低、特异性差。微阵列方法能够进行高通量的miRNA分析，灵敏度较低，但是该方法成本较高，且特异性有待进一步提升。PCR法需要对RNA进行逆转录的预处理，将其转换为cDNA后再进行分析，该步骤需要进行多步的不同温度下的反应，增加了检测时长与操作的复杂度。此外，PCR方法需要对升温、退火温度进行严格地控制，需要配备相关的仪器与经过专业培训的加样人员，提高了该方法的成本与操作复杂性，限制了向基层的进一步推广。

近年来，基于CRISPR-Cas12a的核酸检测体系因其较好的特异性和灵敏度受到人们的广泛关注。当底物DNA激活CRISPR-Cas12a系统后，可激活其反式切割活性，在常温下循环切割体系内的单链DNA荧光探针，实现信号的放大。然而对于RNA检测而言，仍然具有两大瓶颈问题。一是需要进行较为复杂的逆转录过程，将RNA转换为cDNA形式；二是基于CRISPR-Cas12a的RNA检测系统的检测限无法满足超低丰度RNA检测的需求，极大地限制了这一系统的推广与运用。如，CN113337638A公开了一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法和试剂盒，然而该方法是将CRISPR反式切割与PCR技术结合，需要进行PCR扩增。CN111154919A公开了一种单独闭管一步法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，通过滚环扩增(RCA)产生大量G4链体纳米线，进而催化显色反应实现新冠状病毒核酸的快速直接检测，但是其检测限1pM。CN113151591A公开了一种用于检测SARS-CoV-2的核酸组合物和试剂盒，将滚环扩增技术和重组酶聚合酶扩增技术进行了巧妙的融合，可在等温条件下对待测样本进行检测，无需价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，但是其灵敏度仅为100pg/μL。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单、快速、高灵敏的由靶RNA识别扩增模块和基于CRISPR-Cas12a的二重信号放大模块构成的试剂盒及超微量新冠病毒RNA的常温检测方法，以完成快速、廉价、特异的低丰度新冠病毒核酸常温检测。

本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2的核酸组合物，包括DNA识别链和DNA辅助链；所述DNA识别链用于靶RNA的信号识别，识别区域为新冠病毒基因的保守序列；所述DNA辅助链用于辅助识别链与靶RNA滚环扩增。

在其中一些实施方式中，所述DNA识别链的序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的一个或多个序列；所述DNA辅助链的序列如SEQ ID NO.5所示。

在其中一些较优的实施方式中，所述DNA识别链的序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，包括靶RNA识别扩增模块和二重信号放大模块；所述靶RNA识别扩增模块包括本发明第一方面提供的核酸组合物、DNA连接酶和DNA聚合酶；所述二重信号放大模块包括Cas12a反应系统、iCas12a反应系统和荧光探针；所述Cas12a反应系统包括Cas12a和crRNA；所述iCas12a反应系统包括crRNA、Blocker链和Cas12a。

在其中一些实施方式中，所述核酸组合物由DNA识别链和DNA辅助链溶解于DNA聚合酶缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育制得。

在其中一些实施方式中，所述DNA连接酶为T4连接酶；和/或，所述DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。

在其中一些实施方式中，所述Cas12a反应系统由Cas12a和crRNA在缓冲液环境下混匀，37℃孵育制得。

在其中一些实施方式中，所述iCas12a反应系统由crRNA与Blocker链溶解于缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育得到的crRNA-Blocker复合物，与Cas12a在缓冲液环境下混匀，37℃孵育制得。

在其中一些实施方式中，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.6所示；和/或，所述Blocker链的序列如SEQ ID NO.7所示；和/或，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示。

第三方面，本发明提供一种常温检测超微量新冠病毒RNA的方法，基于本发明第二方面提供的试剂盒，具体包括如下步骤：

S1.将待测核酸样本置于靶RNA识别扩增模块进行扩增，得扩增产物；

S2.将扩增产物与二重信号放大模块混合，避光检测；

步骤S1中，扩增反应条件为37℃下反应15分钟；

步骤S2中，检测反应条件为37℃，激发光波长485nm，发射光波长520nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的试剂盒和检测方法能够常温(25℃～40℃，优选37℃)下检测超微量新冠病毒RNA，反应条件温和，无需逆转录过程，操作简便，且兼顾检测的高特异性与高灵敏度。当体系中不存在新冠病毒靶RNA时，靶RNA识别扩增模块无法进行反应，进而无法激活二重信号放大模块，具有低背景的优势。此外，本发明采用的核酸组合物能够充分发挥CRIPSR-Cas12a检测系统灵敏度高的特点，检测限可达到100aM级别，能够实现对超微量RNA的检测。

附图说明

图1为实施例1对新冠病毒N基因RNA检测的检测限。

图2为实施例2对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

图3为实施例3对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

图4为实施例4对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

图5为实施例5对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

图6为对比例1对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

图7为对比例2对新冠病毒N基因RNA检测限的统计评估。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的技术构思在于提供一种简单、快速、高灵敏的由靶RNA识别扩增模块和基于CRISPR-Cas12a的二重信号放大模块构成的试剂盒及超微量新冠病毒RNA的常温检测方法。

第一方面，本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2的核酸组合物，包括DNA识别链和DNA辅助链；DNA识别链用于靶RNA的信号识别，识别区域为新冠病毒基因的保守序列；DNA辅助链用于辅助识别链与靶RNA滚环扩增。

具体的，DNA识别链的序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的一个或多个序列；

CTACTGCTGCCTGGATTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATGCAGGAGAAGTTCCC(SEQ ID NO.1)；

CTACTGCTGCCTGGAGTTGAATTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCTAGCAGGAGAAG(SEQ ID NO.2)；

TGGTTCAATCTGTCAAGCAGTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCAGCAAAGCAAGAGCAGCA(SEQ ID NO.3)；

TCCCTTCTGCGTAGAAGCCTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCTTGACTGCCGCCTCTGC(SEQ ID NO.4)。

DNA辅助链的序列设计为：ATACTCACCCAGAGT(SEQ ID NO.5)。

第二方面，本发明提供一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，包括靶RNA识别扩增模块和二重信号放大模块；靶RNA识别扩增模块包括本发明第一方面提供的核酸组合物、DNA连接酶和DNA聚合酶；二重信号放大模块包括Cas12a反应系统、iCas12a反应系统和荧光探针；Cas12a反应系统包括Cas12a和crRNA；iCas12a反应系统包括crRNA、Blocker链和Cas12a。

具体的，核酸组合物由DNA识别链和DNA辅助链溶解于DNA聚合酶缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育制得。

DNA连接酶为T4连接酶；DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。

Cas12a反应系统由Cas12a和crRNA在缓冲液环境下混匀，37℃孵育制得。

iCas12a反应系统先由crRNA与Blocker链溶解于缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育得到的crRNA-Blocker复合物，在由crRNA-Blocker复合物与Cas12a在缓冲液环境下混匀，37℃孵育制得。

crRNA的序列设计为：

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAGGGCAUGAGCUAGGUGAU(SEQ ID NO.6)。

Blocker链的序列设计为：

ATCACCTAGTATATCTCATGCCCTTATCTACACTTAGTAGTTTTTAAATTA(SEQ ID NO.7)。

荧光探针的序列设计为：FAM-TTTTTATTTTT-BHQ(SEQ ID NO.8)。

第三方面，本发明提供一种常温检测超微量新冠病毒RNA的方法，基于本发明第二方面提供的试剂盒，具体包括如下步骤：

S1.将待测核酸样本置于靶RNA识别扩增模块进行扩增，得扩增产物；

S2.将扩增产物与二重信号放大模块混合，避光检测；

步骤S1中，扩增反应条件为37℃下反应15分钟；

步骤S2中，检测反应条件为37℃，激发光波长485nm，发射光波长520nm。

当待测核酸样本中存在新冠病毒靶RNA时，靶RNA与DNA识别链结合，并形成环形结构，在DNA辅助链的引导和Phi29 DNA聚合酶的作用下，以DNA识别链作为模板进行环形扩增，得到多个重复的、与DNA识别链互补的扩增DNA产物。扩增产物中包含能与下游二重信号放大模块反应的DNA序列，因此可直接与后一模块相偶联，完成信号的进一步放大与报告。当不存在靶RNA时，DNA识别链无法形成环形结构，无法扩增出与下游模块反应的产物，因而无法产生报告信号，具有低背景的优势。

进一步地，上游产生的扩增DNA产物一方面可直接激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性。即激活的CRISPR-Cas12a可切割两端标记有荧光基团FAM和淬灭基团BHQ的单链DNA荧光探针，从而产生循环信号报告。另一方面，激活的CRISPR-Cas12a可以激活二重信号放大模块中被封闭的iCRISPR-Cas12a(inhibit-CRISPR-Cas12a)，使之转换具有信号放大活性的aCRISPR-Cas12a。上游扩增产物进入本模块后，Cas12a的非特异性切割活性会被激活，进而切割体系中存在的单链探针，从而产生荧光信号。此外，激活的Cas12a会切割体系中封闭igRNA-T2的DNA链，随后igRNA-T2形成完整的gRNA-T2；然后，gRNA-T2与Cas12a结合，并与辅助目标引物匹配，激活Cas12a。激活的Cas12a一方面会切割体系中的游离探针，另一方面也会切割sgRNA，从而形成正反馈系统，实现信号的二重放大。通过二重循环放大体系，直接增加产生信号的Cas12a的酶的数量，进而提高检测方法的灵敏度，从而在保持体系以及检测程序相对简单的情况下，实现对超微量RNA的检测。

下面针对新冠病毒N基因的实验进行举例说明。

本发明试验例中的寡核苷酸链由上海生工经HPLC纯化合成。

Lba Cas12a和NEBuffer 2.1由New England Biolabs公司购买。

T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶在BBI生命科学公司购买。

检测仪器：Biotek酶标仪。

实施例1

(1)委托合成如下序列

合成DNA识别链序列：

CTACTGCTGCCTGGATTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATGCAGGAGAAGTTCCC(SEQ ID NO.1)。

合成DNA辅助链序列：ATACTCACCCAGAGT(SEQ ID NO.5)。

合成crRNA序列：

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAGGGCAUGAGCUAGGUGAU(SEQ ID NO.6)。

合成Blocker链序列：

ATCACCTAGTATATCTCATGCCCTTATCTACACTTAGTAGTTTTTAAATTA(SEQ ID NO.7)。

合成荧光探针序列：FAM-TTTTTATTTTT-BHQ(SEQ ID NO.8)。

(2)制备识别链-辅助链核酸组合物

将DNA识别链与DNA辅助链以1:1.5比例溶解于phi29 DNA聚合酶缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育10分钟。具体反应体系见下表：

(3)制备靶RNA识别扩增模块

将不同浓度的待测新冠病毒样品、识别链-辅助链核酸组合物、T4连接酶、Phi29DNA聚合酶共同溶解于缓冲溶液，37℃下反应15分钟，得扩增产物。具体反应体系见下表：

(4)预组装Cas12a反应系统

将Cas12a和crRNA在NEBuffer2.1环境下混匀，37℃孵育30分钟。具体反应体系见下表：

(5)预组装iCas12a反应系统

制备crRNA-Blocker复合物：将crRNA与Blocker链以1:2比例溶解于NEBuffer2.1缓冲液中，85℃变性3分钟，55℃退火3分钟，放置于37℃孵育1小时后可放置于4℃备用。具体反应体系见下表：

将crRNA-Blocker复合物与Cas12a在NEBuffer2.1环境下混匀，37℃孵育30分钟。具体反应体系见下表：

(6)CRISPR-Cas12a切割体系的构建与荧光检测：

将预先构建好的扩增产物、Cas12a反应系统、iCas12a反应系统和荧光探针混合。在37℃条件下，在酶标仪内进行避光检测。具体反应体系见下表：

荧光酶标仪反应条件：37℃，激发光波长485nm，发射光波长520nm，检测时间90分钟。

检测结果统计见图1。分析各浓度对应荧光曲线的线性段上升速率，可以看出本系统可检测到10fM级别的新冠病毒RNA。

实施例2

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链的序列为：

CTACTGCTGCCTGGAGTTGAATTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCTAGCAGGAGAAG(SEQ ID NO.2)。

检测结果如图2所示，检测限可达到10fM。

实施例3

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链的序列为：

TGGTTCAATCTGTCAAGCAGTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCAGCAAAGCAAGAGCAGCA(SEQ ID NO.3)。

检测结果如图3所示，检测限可达到1fM。

实施例4

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链的序列为：

TCCCTTCTGCGTAGAAGCCTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCTTGACTGCCGCCTCTGC(SEQ ID NO.4)。

检测结果如图4所示，检测限可达到1fM。

实施例5

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链有3条，序列分别为：

CTACTGCTGCCTGGATTTTTATACATATTTATGGGTTTGGCTCTGGGAAAGTATGCAGGAGAAGTTCCC(SEQ ID NO.1)；

TGGTTCAATCTGTCAAGCAGTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCAGCAAAGCAAGAGCAGCA(SEQ ID NO.3)；

TCCCTTCTGCGTAGAAGCCTTTTTTAAGGGCATGAGCTAGGTGATACTCTGGGTGAGTATCTTGACTGCCGCCTCTGC(SEQ ID NO.4)。

制备识别链-辅助链核酸组合物的各识别链序列比例为：1:1:1。

检测结果如图5所示，检测限可达到100aM。

对比例1

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链的序列为：

CATACCGCAGACGGCCCGCCCTACCCAAAACTGAACCCGCCCTACCAAAACCCAACCCGCCCTACCATAACCTTTCCA(SEQ ID NO.9)。

检测结果如图6所示，1nM组与空白组的荧光曲线上升速率没有明显差异，检测限仅1nM。

对比例2

本实施例试验原料及工艺步骤基本与实施例1相同，区别仅在于，设计的DNA识别链的序列为：

GCAGCAGAGACGAAAAAACACAAAGGAACGAGAGGACAGGAACCACAGACAAAGGAGCACGA(SEQ IDNO.10)。

检测结果如图7所示，1nM组与空白组的荧光曲线上升速率没有差异，检测限仅1nM。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。