血栓弹力图质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及凝血检测技术领域，具体涉及血栓弹力图质控品及其制备方法。

背景技术

血栓弹力图仪技术于1948年由德国人Harter发明，作为一种检测凝血功能的方式于21世纪引入我国，其原理是基于凝血过程的最终结果为形成血凝块，血凝块形成过程中产生的旋转力经机电传感器被转换为电信号，转换的电信号被电脑检测而被描绘。在凝块的形成过程中凝块的物理特性(血凝块速率、强度和稳定性)决定其是否具有正常凝血功能，通过对血凝块物理特性的区分和标准确定以此区分凝血功能的正常与异常。

血栓弹力图仪结果的稳定性与准确性与其配套的检测试剂尤其相关，其中采用的血栓弹力图质控品来检测实验仪器的稳定性至关重要。目前的血栓弹力图仪适用的质控品分为两类，一类为血栓弹力图仪质控品，只针对仪器的质量控制；另一类为血栓弹力图质控品，需搭配配套试剂盒使用同时对仪器和试剂盒进行质量控制。临床使用中针对仪器和试剂盒的质量控制的需求，血栓弹力图质控品需求逐渐增加。

血栓弹力图仪对全血进行检测时主要通过血块强度(MA)确定血液的凝血状况，MA值的大小主要是纤维蛋白原和血小板决定的，全血中血小板不易保存，因此在血栓弹力图质控品的研制中主要依靠提升纤维蛋白原的含量增加MA值，从而达到制备不同水平血栓弹力图质控品的目的。目前使用较为广泛的血栓弹力图质控品的制备方式为通过分离动物血浆依次获得血清、纤维蛋白原和凝血因子，调控几者的比例达到预期参数靶值的目的，其中靶值参数主要选择以下四项参数，R值为凝血时间，是血样开始检测直到第一块纤维蛋白凝块形成之间的一段潜伏期；K值为血块形成时间，评估血凝块强度达到某一水平的速度，反应血块织网速度；Angle角是血凝速率，评估纤维蛋白块形成及相互联结(凝块加固)的速度；MA值是最大血块强度或称最大振幅，直接反映纤维蛋白相互联结的纤维蛋白凝块的终强度。上述方法虽参数调控能力较强，但每次均需采集动物全血分离得到血浆并进一步分离血清、纤维蛋白原和凝血因子，步骤繁琐，工艺复杂；且现有技术中的多水平质控品一般采用相同血液成分制得，导致质控品区分度不高，无法满足凝血差异度大的血液样品检测需求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供血栓弹力图质控品及其制备方法，本发明提供的血栓弹力图质控品制备工艺简单、检测快捷且区分度高。

本发明提供了缓冲保护剂，包括体系缓冲剂、防腐剂和冻干保护剂；

所述冻干保护剂包括糖类化合物、氨基酸类化合物、多羟基化合物和聚合物，所述糖类化合物为海藻糖或蔗糖，所述氨基酸类化合物为甘氨酸或精氨酸，所述多羟基化合物为甘露醇或山梨醇，所述聚合物为聚乙二醇600(PEG600)或聚乙烯吡咯烷酮。

相比其他缓冲保护剂，本发明提供的所述缓冲保护剂为在血栓弹力图质控品的制备过程中，提供了更加稳定的冻干体系，能过最大程度的保证冻干后的血栓弹力图质控品的稳定性、灵敏度和特异性，从而获得更准确的技术效果。

在一些具体实施例中，所述体系缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，所述防腐剂为硫酸庆大霉素，所述冻干保护剂包括海藻糖、精氨酸、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮。相比较其他试剂，上述各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合血栓弹力图质控品的制备，从而获得更准确的技术效果。

优选的，所述缓冲保护剂中，各组分浓度为：

所述缓冲保护剂由10～50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、30～80μg/mL的硫酸庆大霉素、1～10g/L的海藻糖、1～5g/L的精氨酸、2～10g/L的山梨醇、0.01～1g/L的聚乙烯吡咯烷酮组成。

进一步优选的，所述缓冲保护剂中，各组分浓度为：

所述缓冲保护剂由水和30mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、50μg/mL的硫酸庆大霉素、5g/L的海藻糖、1g/L的精氨酸、2g/L的山梨醇和0.05g/L的PVP组成。实验表明，在此浓度下，所述缓冲保护剂配合血栓弹力图质控品的制备效果最佳。

本发明还提供了血栓弹力图质控品，包括质控品I和质控品Ⅱ；

所述质控品I包括血浆基质、纤维蛋白原基质和所述的缓冲保护剂，其中，所述血浆基质和纤维蛋白原基质的体积比为(50～100)：(0～50)，所述缓冲保护剂的体积分数为10％；

所述质控品Ⅱ包括血浆基质、抗凝剂和所述的缓冲保护剂，所述缓冲保护剂的体积分数为10％。

优选的，所述血浆基质为猪血浆，所述纤维蛋白原基质为牛血浆纤维蛋白原，所述抗凝剂为肝素钠。

采用猪血浆作为血浆基质，由于猪血浆中富含凝血酶和多种凝血因子，但因血浆中血小板的缺乏导致凝血形成的血块强度明显低于健康人体测得的正常值，而采用牛血浆纤维蛋白原为纤维蛋白原基质，通过在猪血浆中加入较高含量的纤维蛋白原能够弥补血小板缺乏引起凝血强度下降的现象，从而可以更加近似的模拟正常人血的凝血状况。

采用肝素钠为抗凝剂，由于肝素钠能够与猪血浆中的抗凝血酶Ⅲ结合，增强抗凝血酶Ⅲ对凝血因子的抑制，从而延长凝血时间。通过调控肝素钠的含量，进而调控所述质控品Ⅱ的凝血参数，从而可以更好的实现制备与所述质控品I更具区分度的血栓弹力图质控品。

进一步优选的，所述质控品I中，所述血浆基质和所述纤维蛋白原基质体积比为85:15，在此体积比下，所述质控品I的四项凝血参数均接近其靶值范围的中间值；

所述质控品Ⅱ中，所述抗凝剂为活性浓度0.025～0.2U/mL的肝素钠。

更进一步优选的，所述肝素钠的活性浓度为0.05U/mL，在此活性浓度下，所述质控品Ⅱ的凝血时间R值明显提升，此时质控品Ⅱ用活化凝血检测试剂盒普通杯(R1)和肝素酶杯(R2)进行检测，满足|R1-R2|≥1min,可达到对血栓弹力图肝素酶杯的质量控制。

优选的，所述质控品I的范围为R值2～8min，K值0～3min，Angle值55～85deg，MA值50～90mm；

所述质控品Ⅱ的范围为R值4～12min，K值0～4min，Angle值45～75deg，MA值20～40mm。

本发明提供了所述的血栓弹力图质控品在制备血栓弹力图凝血检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了所述的血栓弹力图质控品在制备肝素酶杯质量控制试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了包含猪血浆、牛血浆纤维蛋白原和缓冲保护剂的血栓弹力图质控品I，以及包含猪血浆、肝素钠和缓冲保护剂的血栓弹力图质控品Ⅱ。与现有技术相比，本发明的质控品I在制备的过程中无需提取凝血因子，简化了制备工艺，操作更加简单；本发明的质控品Ⅱ通过添加肝素钠，与质控品I凝血检测参数更具区分度，实现了采用双水平血栓弹力图质控品，能够满足凝血差异度大的血液样品的检测需求。另外采用本发明的双水平血栓弹力图质控品可以应用于制备肝素酶杯的质量控制。

具体实施方式

本发明提供了血栓弹力图质控品及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1缓冲保护剂的制备

缓冲保护剂包括体系缓冲剂、防腐剂和冻干保护剂，其中体系缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，防腐剂为硫酸庆大霉素，冻干保护剂包括糖类化合物、氨基酸类化合物、多羟基化合物、蛋白类和聚合物。

为验证不同组分和浓度的缓冲保护剂对血浆基质的凝血影响，本实施例中以猪血浆为血浆基质，添加如下表1中各缓冲保护剂组分，并分别测试血浆的各项凝血参数指标值。其中，不同缓冲保护剂冻干前后凝血参数结果差异数值如下表1所示。

表1单一缓冲保护剂的猪血浆冻干前后凝血偏差结果

注：偏差公式为：CV(％)＝(冻干后数值-冻干前数值)/冻干前数值*100

由表1数据可知，海藻糖的冻干保护效果优于蔗糖；氨基酸中1g/L的精氨酸的冻干保护效果表现较优；总体上PVP的冻干保护效果优于PEG 600，0.05g/L PVP优于1g/L PVP；多羟基化合物中山梨醇的冻干保护效果优于甘露醇；而BSA的冻干保护效果不好。

最终确定缓冲保护剂的最佳配比为：30mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，50μg/mL的硫酸庆大霉素，5.0g/L的海藻糖，1.0g/L的精氨酸；2.0g/L的山梨醇和0.05g/L的PVP，缓冲保护剂pH在7.5±0.1，近似模拟正常人血的pH值，优选pH为7.5。

实验中，采用下表2配置10×缓冲保护剂。

表2 10×缓冲保护剂配制：

实施例2血栓弹力图质控品I的制备

本发明提供的血栓弹力图质控品I，包括血浆基质、纤维蛋白原基质和实施例1中制备的缓冲保护剂，其中血浆基质为猪血浆，纤维蛋白原基质为牛血浆纤维蛋白原。

其中牛血浆纤维蛋白原通过冷沉淀方式获取，具体方法为将冷冻冻实的牛血浆置于2～8℃冰箱内，待牛血浆全部融化后放置离心机内离心，离心条件为：3500g，15min，2～10℃，待离心完成后将上层血浆移除，剩余部分血浆重悬底部白色纤维蛋白原沉淀，待沉淀完全溶解后分装并置于-20～-30℃冰箱保存备用；

由于猪血浆中富含凝血酶和多种凝血因子，但因血浆中血小板的缺乏导致凝血形成的血块强度明显低于健康人体测得的正常值，通过代偿性的加入冷沉淀离心获取的牛血浆纤维蛋白原达到增加猪血浆中纤维蛋白原含量的目的。在活化凝血检测试剂的启动下通过内外源凝血级联最终将纤维蛋白原分解为纤维蛋白并进一步形成纤维蛋白网，较高含量的纤维蛋白原能够弥补血小板缺乏引起凝血强度下降的现象，从而近似模拟正常人血的凝血状况。通过改变血浆基质和牛血浆纤维蛋白原的比例，调节质控品I的各项凝血参数，猪血浆和牛血浆纤维蛋白原的混合物中添加缓冲保护剂后冻干，其中缓冲保护剂占总体积的10％。

为进一步探究血浆基质和纤维蛋白原基质的添加比例对于质控品I参数的影响，采用如下表3中血浆基质和纤维蛋白原基质的体积比制备的液体质控品I，并将其置于真空冷冻干燥机内冻干即得到质控品I，并针对不同比例制备获得的质控品I测试其各项凝血参数，结果如表3所示。

表3质控品I凝血参数结果

猪血浆除MA值较低以外，其余参数均在正常的范围之内，能够成为良好的基质；牛血浆纤维蛋白原含量远远高于人血浆和猪血浆，在使用冷沉淀分离是获取的纤维蛋白原更多。在质控品I的制备时只需通过调节基质和纤维蛋白原的比例就能完成质控品的制备，操作简便，除此之外，通过控制冷沉淀重悬底部纤维蛋白原的血浆体积以及纤维蛋白原与基质的占比能够较大范围内调节质控品I的各项参数范围，使质控品具有优异的可调节性和可控性。由表3可知，血浆基质的猪血浆的MA值较低，仅为31.4，当其与不同比例的纤维蛋白原进行搭配，随着纤维蛋白原占比增加，Angle值和MA值均出现不同程度的增加。

现有作为对照的血液样本无法长时间稳定保存，且血液样本除了难以获得其的均一性和安全性也难以保障，难以实现对血栓弹力图活化凝血检测试剂的持续稳定、准确的质量控制。本质控品I使用稳定性好的猪血浆，通过调节其R值、K值、Angle值和MA值的取值范围，使其落入临床健康人血样本的血栓弹力图参数范围内，以模拟人健康血液样本，满足临床血栓弹力图检测的质控要求。因此暂定本项目血栓弹力图质控品的质控品I的靶值范围为(R:2-8；K:0-3；Angle:55-85；MA:50-90)。结合表3结果，将85％猪血浆和15％牛血浆纤维蛋白原混合得到质控品I基础液，向质控品I基础液中加入占总体积10％的上述缓冲保护剂即得到质控品I，将液体质控品I置于真空冷冻干燥机内冻干即得到目标质控品I。本发明质控品I由体积比153:27:20的血浆基质、纤维蛋白原基质和缓冲保护剂体积比配置，并经冻干获得。

实施例3血栓弹力图质控品Ⅱ的制备

本发明提供的血栓弹力图质控品Ⅱ包括血浆基质、抗凝剂和缓冲保护剂，其中血浆基质为猪血浆，抗凝剂为肝素钠。

制备过程：向猪血浆中加入肝素钠，肝素钠的加入能够与抗凝血酶Ⅲ结合，增强抗凝血酶Ⅲ对凝血因子的抑制，从而延长凝血时间，由于不同浓度肝素钠对质控品Ⅱ凝血参数的调节功能不同，向猪血浆中加入肝素钠混合后得到如表4中不同终浓度的肝素钠与猪血浆的混合液，并向混合液中加入占总体积10％的缓冲保护剂得到液体质控品Ⅱ，将液体质控品Ⅱ置于真空冷冻干燥机内冻干即得到目标质控品Ⅱ，并分别测定其凝血参数，结果如表4所示。

表4质控品Ⅱ凝血参数结果

由表4可知，随着肝素钠浓度的增加，测得凝血时间(R值)逐渐延长，MA值的变化微小。而当肝素钠的浓度超过0.1U/mL时，除R值出现较为明显的变化外，K值和Angle角也会出现连带反应，主要表现为K值的增加和Angle角的降低，这可能与肝素的存在抑制了凝血酶的活性，减缓纤维蛋白原转化为纤维蛋白的速率，从而进一步影响纤维蛋白成网的速率，降低血凝速率。暂定0.05U/mL肝素钠为质控品Ⅱ配方的终浓度，此时的MA值为31.5；根据此原理能够通过加入建立合适浓度肝素钠的质控品Ⅱ，从而建立与质控品I更具有区分度的靶值范围。参照国内外厂商、药监局以及其他专利中血栓弹力图质控品靶值范围(MA中间值为30左右)以及本研究测定结果，将本项目质控品质控品Ⅱ的靶值范围为：(R:4-12；K:0-4；Angle:45-75；MA:20-40)

上述质控品I与质控品Ⅱ的四项凝血参数的靶值范围交叉较少。其中，质控品I为正常质控品，模拟正常人全血的普通杯检测正常范围进行制备，质控品Ⅱ为异常质控品，有两种情况①MA异常低，MA值与质控品I MA值不交叉，R值与质控品I R值交叉；②R值和MA值都与质控品I相差较大，均不交叉，本发明的R值有交叉。

其优势在于：

一、质控品Ⅱ通过添加肝素钠，与质控品I凝血检测参数更具区分度，实现了采用双水平血栓弹力图质控品，能够满足凝血差异度大的血液样品的检测需求。

二、现有作为对照的血液样本无法长时间稳定保存，且血液样本的均一性和安全性难以保障，难以实现对血栓弹力图活化凝血检测试剂的稳定、准确的质量控制。本质控品使用稳定性好的猪血浆，通过调节其R值、K值、Angle值和MA值的取值范围，使其落入临床健康人血样本的血栓弹力图参数范围内，以模拟人健康血液样本，满足临床血栓弹力图检测的质控要求。

实施例4血栓弹力图质控品Ⅱ在肝素酶杯质量控制中的应用

除了能提供作为活化凝血检测试剂盒(普通杯)的质量控制外，血栓弹力图质控品Ⅱ中肝素钠的加入也同时满足肝素酶杯的质量控制。肝素钠作为经典的抗凝剂，能够减缓血液凝固，预防或治疗血栓。当肝素钠的活性浓度为0.05U/mL，在此活性浓度下，质控品Ⅱ的凝血时间R值明显提升，此时质控品Ⅱ用普通杯(R1)和肝素酶杯(R2)进行检测，满足|R1-R2|≥1min,可达到对血栓弹力图肝素酶杯的质量控制。采用上述血栓弹力图质控品Ⅱ分别对两种市售血栓弹力图样品杯(普通杯和肝素酶杯)的四项凝血参数进行检测，结果见表5，每组设置4个重复。

表5质控品Ⅱ检测普通杯与肝素酶杯的凝血参数结果

普通杯检测含有肝素的质控品II其凝血时间R值因为肝素的存在而延长，用肝素酶杯进行检测时，因为肝素酶杯中的肝素酶将肝素中和，反应在血栓弹力图检测参数上就是其R值减小，凝血时间缩短，通过与普通杯比较其R值是否缩短可判断肝素酶杯中的肝素酶量及活性是否达到要求。

质控品Ⅱ中肝素的加入不仅为肝素酶杯的质量控制提供可能，同时肝素能够延缓凝血启动过程，使质控品II的血栓弹力图参数除MA外其余参数与质控品I更具有区分度，增加了双水平质控品检测的区分度。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。