一种包含15种支原体qPCR快速检测试剂盒及其使用方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种检测试剂盒及其使用方法和应用，具体涉及一种qPCR快速检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

支原体，又称霉形体，在1898年被发现，是目前发现的最小的最简单的原核生物，大小为0.1-0.3微米，能通过滤器，呈高度多形态，支原体基因组为一环状双链DNA，缺乏细胞壁，分子量小，唯一可见的细胞器是核糖体，大多数的支原体以球形为主，有三层结构的细胞膜具有极大的可变性，对人类和动物均具有一定的致病性并且能在无生命的人工培养基上生长繁殖。支原体的基因组多数为双链DNA，散布于整个细胞中的拟核或者没有形成的核区中。支原体的细胞膜中含甾醇，对保持细胞膜的完整性起了很大作用，革兰氏染色不易着色，支原体的种种特性都足以说明它不易被检测和清除的特点。

国外调查发现，大约有二十多种支原体能够污染细胞，有的细胞株甚至会被两种以上的支原体同时污染。研究表明，污染细胞的支原体95％以上为以下四种：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。另外，发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)及梨支原体(M.pirum)也很常见。支原体污染的来源主要包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染以及制备细胞的原始组织及器官的污染等。

支原体对培养细胞的污染发生率高，据估计平均发生率在60％左右。同时又非常隐秘，早期不容易被发现，污染细胞后，首先会影响细胞的生长状态及形态，由于支原体的存在会导致培养基中支持细胞生长的营养物质减少，造成细胞生长缓慢甚至停止，还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变；也会影响细胞正常代谢和功能，蛋白质、DNA、RNA合成发生障碍、破坏细胞膜完整性、影响细胞信号传递、染色体发生异常；此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。

病毒载体的制造过程包括各种基于贴壁或悬浮细胞生产培养的技术。病毒载体的生产大多依赖于在二维(2D)静态系统中培养的贴壁细胞。这些系统可以包括培养皿和T-flasks，但为了维持更大的规模，可以使用细胞工厂和滚瓶，若支原体污染了细胞，对于病毒载体的生产会造成极大的影响，同时慢病毒载体作为CAR-T细胞制备的原料，对于最终的药品安全性造成巨大的隐患。

目前生物制品，支原体检测常用的检测方法有传统的分离培养法、指示细胞培养法(DNA染色法)、ELISA法、PCR法等。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间；二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如猪鼻支原体(M.hyorhinis)。指示细胞培养法(DNA染色法)则灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出；细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性；另外，荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。

PCR法为主流的支原体检测手段。支原体作为一种原核生物，其rRNA基因是由保守和多变序列间隔排列而成，以其16SrRNA核酸序列中高度保守序列设计引物，采用PCR扩增、琼脂糖电泳的方法检测细胞中的支原体污染，PCR法虽然比传统分离培养法检测时间大大缩短，不过已有的PCR支原体检测也存在一些问题，如引物设计不好，导致检测的灵敏度及特异性不够；而且，现在主流的检测试剂盒只能针对某一种或几种支原体，广谱性差。ZL202210318135.7公布了采用微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的组合物及其应用，其只能检测一种支原体，通量较低，ZL 202210646129.4采用LAMP-Taqman技术检测鸡毒支原体，也存在通量较低，应用范围窄的问题，ZL202111573467.1一种用于细胞培养中检测支原体污染的PCR试剂盒及其应用公开了一种可以扩增多种支原体的引物，但检测过程复杂，耗时耗力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于支原体qPCR快速检测的试剂盒及其使用方法，本发明试剂盒可快速检测细胞库样品，病毒载体样品中是否存在支原体污染，本发明具有灵敏度高、数据准确可靠、操作简单、检测快速的特点。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种同时扩增15种支原体qPCR快速检测试剂盒，包括以下组分：用于特异性扩增15种支原体的15组引物对；所述15种支原体分别为：莱氏无胆支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、鸡毒支原体、生殖支原体、人型支原体、猪鼻支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体、梨支原体、肺炎支原体、唾液支原体、滑液支原体、咽支原体和耳支原体；所述15种支原体对应的引物对和引物浓度如表1所示：

表1

PCR是一个复杂的分子动力学过程。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同引物之间的相互干扰越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计和修改大量特异性引物并进行复杂的测试，摸索复合扩增系统中各引物之间最优的浓度比例，，最终保证不降低试剂盒特异性及灵敏度的前提下复合检测更多的支原体，本发明通过复杂的设计和实验摸索确定如下表的引物序列及对应的浓度，如表1。

进一步的，上述检测试剂盒还包含以下组分：如下表2所示：

表2

本发明试剂盒因为需要满足不同样品的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的PCR扩增程序，最终扩增程序如下：

步骤1 95℃10min；

步骤2 95℃15s；

步骤3 60℃60s；

步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；

步骤4 95℃15s；

步骤5 60℃60s；接收荧光信号。

步骤6 95℃15s。

优选地，本发明试剂盒的扩增产物采用qPCR方法检测。

本发明PCR试剂盒用于检测细胞基因治疗产品，如细胞库支原体检测，慢病毒(LVV)载体支原体检测等。

本发明的优点是：

1.本发明创造性通过设计，获得15种支原体实时荧光PCR检测引物组合，结合了实时荧光定量PCR快速的特点，比传统分离培养法检测支原体时间大大缩短。

2.本发明是在实时荧光定量PCR技术平台的基础上，对支原体特异性靶标基因进行定性检测，一次实验可检测多个样本，具有快速、特异、经济等特点，极大的降低了细胞基因治疗样品支原体检测成本。

3.本发明中使用自主设计的阳性对照，分别将15种支原体的靶序列构建到3个T载体质粒上，有效避免提取过程中阳性菌株对试剂盒和环境的污染。

4.本发明提供的技术方案适用于产业化，高效简便，为细胞基因治疗产品中支原体污染的防控提供了更高水准的检测方法。

5.本发明经过大量实验、反复测试验证，最终得到最佳的引物及浓度配比，避免假阳性扩增。

附图说明：

图1是阳性对照中莱氏无胆支原体靶序列合成质粒扩增图谱；

图2是特异性验证中对衣原体检测结果图谱；其中A是衣原体扩增图谱；B是衣原体和阳性对照混合后，扩增图谱；C是阴性对照扩增图谱；D是阳性对照扩增图谱。

图3是DMEM培养基扩增图谱；其中A是DMEM培养基扩增图谱；B是DMEM和阳性对照混合后，扩增图谱；C是阴性对照扩增图谱；D是阳性对照扩增图谱。

图4是可疑支原体培养基扩增图谱；其中A是支原体培养基扩增图谱；B是支原体培养基和阳性对照混合后扩增图谱；C是阴性对照扩增图谱；D是阳性对照扩增图谱。

具体实施方式：

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：检测支原体的确定；试剂盒引物设计、扩增体系、扩增方法的确定。

一、检测支原体的确定

研究表明，污染细胞的支原体95％以上为以下四种：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。另外，发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)及梨支原体(M.pirum)也很常见。依据文献，选取15种细胞和基因治疗产品中容易污染的支原体，参照GenBank中基因序列，通过核酸序列的比对，选择靶序列进行特异性引物设计，信息如下表3(支原体靶点信息)。

表3

二、复合扩增体系的优化及建立

1、引物设计

确定好需要检测的支原体靶序列后，采用Oligo6.0软件进行引物设计，本发明的所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，在引物设计时，需保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值和GC含量相近、引物之间不能形成二聚体；引物设计时需要考虑到引物扩增的特异性，而不产生非特异和假阳性扩增。15种支原体对应的引物对和引物浓度如表1所示。

2、复合扩增

经过大量实验和修改优化后，最终确定同时分析15种支原体复合扩增的试剂盒，：配制混合液，Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)采购自Thermo Fisher公司，10×Primer Mix(10×)自配，单个测试孔理论总体积为18μl，混合体系体积见下表4：

表4

检测孔反应体系包括：供试品孔、供试品干扰孔(供试品+阳性对照)、阳性对照孔及阴性对照孔。反应体系的配制表如下表5：

表5

3、上机检测

3.1开启仪器，依次进行程序设置：96-well(0.2ml)、Melt Curve、SYBR GreenReagents、Standard。

3.2定义所有检测孔的报告类型。同时，对供试品孔定义具体的名称。

Target Name：MycoSEQ

Reporter：SYBR

Quencher：None

3.3定义PCR程序，反应总体积：30μl。

Hold stage：95℃，10min；

PCR stage：95℃，15s；60℃，1min；40cycles；

Melt Curve stage：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；

3.4点击“Start Run”开始程序，此过程大概需要1.6h。

4.数据分析及记录：

4.1选择“Manual CT”，设置“Threshold”为0.2。

4.2分别记录阳性对照、阴性对照、供试品的Ct、Tm及DV。

4.3记录供试品干扰孔的Ct、Tm及DV及计算ΔCt＝Ct

5.结果判定，见表6

表6

5.1阳性对照孔：Ct≤36、DV＞0.05且Tm(℃)＝84.5±1，此三个判断标准同时成立方可判定为阳性。

5.2阴性对照孔：Ct＞36，则判定为阴性。

5.3供试品干扰孔：Ct≤36、DV＞0.05、Tm(℃)＝84.5±1且|ΔCt|＜2，同时满足这四个判断标准时，判定为供试品对本分析方法无干扰，供应品检验结果可进行判断；若无同时满足此四个判断标准，则说明供试品对本分析方法有干扰，需排除干扰后再进行判断。

5.4供试品Ct＞36，则判定为未检测出支原体。

5.5当供试品Ct≤36时，则根据以下不同情况进行判定：

①DV＜0.05时，Tm值不作参考，供试品判定为未检测出支原体。

②如果DV≥0.05，但Tm(℃)不在75℃～81℃范围之内，则判定为未检测出支原体。

③如果DV≥0.05，且Tm(℃)在75℃～81℃之间，则判定为供试品支原体检测为阳性。

实施例2：试剂盒阳性对照质粒的构建与合成

为评价试剂盒引物特异性、灵敏度、方法稳定性，根据引物靶向核苷酸序列，委托商业公司(金唯智，苏州)合成质粒，分别以合成的质粒标准品为阳性对照，采用实施例1中的扩增分析体系，15个质粒均能获得很好的扩增，代表图谱见图1，表明试剂盒复合扩增引物特异性良好，对靶基因均能得到有效的扩增。

实施例3：试剂盒特异性性能验证

本实施例所用PCR检测试剂盒同实施例1。

直接使用实验室已有的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，破伤风杆菌、肺炎双球菌及衣原体，采用核酸提取试剂盒(ABI采购)，按如下步骤进行DNA提取：

1.供试品准备：

供试品为上述微生物样品，直接吸取100μl于EP管中。

2.供试品裂解：

2.1金属浴预热至56℃，水浴锅预热至37℃备用。

2.2在含有供试品的EP管中加入200μl的Lysis Buffer(试剂盒内试剂)，漩涡震荡混匀。

2.3再在此EP管中依次加入0.5mol/L EDTA溶液2μl、RNase Cocktail(试剂盒内试剂)18μl，轻微震荡混匀。

2.4将此EP管置于56℃金属浴孵育15min。

2.5取出此EP管，在管内加入2μl Proteinase K(试剂盒内试剂)，轻微震荡混匀，置于56℃金属浴孵育10min。

2.6取出EP管，将此EP管于室温下放置5min，在此EP管中加入700μl LysisBuffer，在漩涡震荡器上混匀。

3.DNA吸附：

3.1提前将Magnetic Particles(试剂盒内试剂)于37℃水浴保温约10min。

3.2在EP管中加入30μl Magnetic Particles，漩涡震荡。

3.3在EP管中加入525μl Binding Solution(试剂盒中试剂)，颠倒混匀。

3.4混匀后将EP管置于漩涡振荡仪上，垂直震荡，约1500rpm，5min。

3.5取下后，在离心机上瞬时最高转速离心约15s。

3.6将EP管放置于磁力架上约5min。

3.7用1000μl移液枪吸取上清并弃去，吸取时避免触碰Magnetic Particles。

4.DNA洗涤：

4.1在EP管中加入300μl Wash Buffer(试剂盒内试剂)，在漩涡震荡器上混匀。

4.2将EP管在离心机上瞬时最高转速离心约15s。

4.3取出后，将EP管放置于磁力架上约1min。

4.4用200μl移液枪吸取上清并弃去，吸取时避免触碰Magnetic Particles。

4.5重复步骤5.6.1～5.6.4操作一次。用200μl移液枪吸取管底残余的上清。

4.6保持管盖开启状态，室温下放置5min，干燥Magnetic Particles沉淀。

5.DNA洗脱：

5.1将金属浴预热至70℃，备用。

5.2在步骤5.6.6中的EP管中，加入100μl Elution Buffer(试剂盒内试剂)。

5.3将EP管在漩涡震荡器上震荡约10s。

5.4将EP管在70℃的金属浴内孵育7min，孵育期间取出离心管于漩涡震荡器上震荡2～3次，使Magnetic Particle完全悬浮。

5.5然后将EP管在13000rpm离心5min。

5.6取出后将EP管放置于磁力架上3min。

5.7转移洗脱上清液到新的1.5ml EP管中。

利用本实施例所述PCR检测试剂盒对以上获取的6种基因组分别进行PCR扩增，结果见表7(PCR检测试剂盒的特异性验证结果)，表明试剂盒对6种微生物均未获得有效扩增，不会干扰试剂盒对支原体的检测，造成假阳性的结果，代表图谱见图2。

表7

实施例4：PCR检测试剂盒的应用验证

将实验室正在培养的各种检验细胞：Vero细胞、CHO细胞、293T细胞、HEK293细胞、HT1080细胞取100μl培养上清，按照实施例3中DNA抽提步骤进行DNA抽提；DMEM细胞培养基，一瓶多次使用的可疑支原体培养基分别取样100μl同样按照实施例3中DNA抽提步骤进行DNA抽提；取实验室支原体培养法用的阳性标准品支原体，肺炎支原体和口腔支原体菌株(购自ATCC)按照实施例3中DNA抽提步骤进行DNA抽提，共计9份基因组DNA样品，采用实施例1中试剂盒进行扩增检测分析，结果汇总在表8中(PCR检测试剂盒的样品检测结果)，一瓶使用过多次的支原体培养基已经被支原体污染，而检验用细胞及培养基都未受到污染。这个结果帮助实验室及时发现培养基的污染问题，避免检测出现重大偏差。这也说明了所述PCR检测试剂盒在实际应用中具有非常高的检测灵敏性。图3为验证所用样品阴性扩增的代表图谱(DMEM培养基扩增图谱)，图4为验证所用样品阳性扩增的代表图谱(可疑支原体培养基扩增图谱)。

表8

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。