高密度样品基因测序方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物医学领域的技术，具体是一种密度大于16000K/mm

背景技术

现有DNA测序方法通过对荧光图像进行分割，获得测序信号所在位置处的信号强度。这种方法对于测序样品密度有一定的要求。由于光学成像系统衍射极限的存在，当测序样品的密度较大时，不同的碱基信号会耦合在一起，对测序结果产生影响。在以荧光像方式为基础的核酸序列检测中，由于光学系统的衍射极限以及邻近信号的影响，限制了每一样品点之间距离缩小以及样品点密度的提高，从而阻碍了测序通量的进一步提升。

发明内容

本发明针对现有基因测序技术中的检测方法无法读取高密度样品信号的问题，提出一种高密度样品基因测序方法，通过对大面积的宽光束照明以及成像，对高密度的样品进行实时计算分析，实现高速、高通量的基因测序任务。在现有测序仪器的基础上，最小可以将样品分布间距减小到成像系统分辨率的0.45倍，且保持读取错误率为万分之一。缩小样品间距到成像系统分辨率的0.36倍，保持错误率为千分之一。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种高密度样品基因测序方法，通过分别采集按二维点阵排列的高密度测序样品的A、C、T、G四通道荧光采集图像各一次并确定每个荧光信号的衍射斑中心位置，从而计算得到样品点阵的整体空间位置分布并确定每一个样品点在成像时单独存在信号情况下的荧光信号计算图像，再根据该荧光信号图像对耦合图像进行解耦，得到每个样品点的信号强度，通过对每一样品点在每一次成像时不同波长通道的信号强度分析，确定每一样品点中核酸的碱基排布顺序。

所述的二维点阵排列是指：通过微加工制得具有空间分布的阵列，阵列中各点相距固定的距离，阵列上每个点加工出一定半径的槽。制备具有待测序DNA模板的成像样品，通过气相沉积方法，使得待测序核酸只会在槽中进行扩增。

所述的四通道荧光采集图像，通过以下方式采集得到：通过在二维点阵排列的一侧设置棱镜，用于反射入射激光，在二维点阵排列的另一侧设置大于0.5数值孔径的镜头，在镜头以及镜筒透镜后设置图像传感器获得二维点阵排列的每一样品点与其序列信息相关联的荧光信号的耦合宽场图像。

所述的每个荧光信号的衍射斑中心位置，通过以下方式得到：对有序列信息相关联的荧光信号的耦合宽场图像进行预处理，然后通过计算图像局部极大值点并经阈值筛选得到若干待定拟合的像素点，再利用高斯分布函数拟合衍射斑的点扩散函数从而得到各衍射斑的位置坐标(x

优选地，通过反复地拟合图像中各候选点，对比单个样品点产生的衍射斑的大小，过滤掉多个样品点耦合的衍射斑的中心位置，得到一系列位置的坐标(x

所述的预处理包括：均值滤波、高斯滤波、低通高斯滤波、高斯差分函数滤波、小波滤波以及均值滤波。

所述的高斯分布函数为：

所述的解耦是指：根据衍射斑中心位置估计视野中第一个点的位置，从而生成测序样品的空间分布的基坐标矩阵A，利用正交匹配追踪算法来优化问题min||y-Ax||，其中：y是步骤B中得到的四通道荧光采集图像，A为基坐标矩阵，x为最终计算得到的点阵各位置信号的强度，求得各个坐标下的分量即样品对应点的信号强度。

所述的视野中第一个点的位置是指：最接近荧光信号计算图像坐标原点的样品点的位置，一般根据图像像素的定义，选择图像左上角第一个；基于衍射斑中心位置的点坐标P

所述的基坐标矩阵是指：基坐标矩阵中的每一列为各个样品点单独存在信号情况下计算得到的宽场荧光成像图，并且将其从二维图像的上一行尾与下一行首相连形成的一维向量。基坐标矩阵中每一列都是模拟计算得到的荧光信号计算图像。

所述的正交匹配追踪，具体包括：

i)将每一通道实际采集到耦合荧光图像一维化处理后与每一样品点在成像时单独存在信号情况下的一维化的荧光信号计算图像即基坐标矩阵中的每一列向量进行内积计算；

ii)取得到内积最大的信号点的值作为对应点的信号强度的估计，将采集到的耦合图像信号减去估计的信号；

iii)当估计的样品点数大于等于两个时，采用最小二乘法对已估计的信号强度进行修正，具体操作为：优化方程min||A

iv)迭代上述步骤i到步骤iii直至迭代大于一定步数或耦合图像趋于0时停止。

所述的信号强度分析是指：通过对每一样品点在每一次成像时不同波长通道的信号强度分析，确定每一样品点中核酸的碱基排布顺序。对比四个通道信号的强度，强度最大的信号的碱基通道来确定所测碱基所属的碱基类别。如果四个通道信号强度相差较小，则丢弃此信号点信号，将此点作为废弃点，表示读取错误。

技术效果

本发明利用测序四通道荧光图像的稀疏性，定位得到点阵样品的实际空间分布，通过对上述空间分布信息的利用实现对高密度的样品信号进行解耦，从而提高测序的密度，实现不改变传统激光照明成像的原理上，能够大规模的提高测序的密度至10倍，即16000K/mm

附图说明

图1为本发明流程图；

图2为实施例中点阵示意图；

图3为A、C、T、G四通道的局部荧光成像图；

图4为样品可能产生的偏移以及偏转方式；

图5为对荧光图像的光斑进行高斯拟合的局部结果图；

图6为基坐标矩阵的示意图(局部)

图7为A、C、T、G四通道点阵对应位置信号计算图；

图8为A、C、T、G四通对比确定最终碱基类别的结果；

图9为实施例成像示意图。

具体实施方式

本实施例涉及一种成像系统，其分辨率为550纳米，样品分布间点阵如图2所示，样品圆心距为230纳米，样品半径为80纳米，通过成像模块对系统成像得到如图3所示的荧光信号采集图像。根据上述参数计算，样品密度为密度大于16000K/mm

如图1所示，为本实施例涉及一种高密度样品基因测序方法，包括以下步骤：

步骤一：采集A、C、T、G四通道荧光信号采集图像；

步骤二：使用高斯拟合定位光斑位置以及大小；

步骤三：通过光斑位置估计视野中第一个点的位置；

步骤四：生成点阵分布的基坐标矩阵；

步骤五：利用正交匹配追踪算法计算A、C、T、G四通道点阵位置信号强度；

步骤六：对比A、C、T、G四通道的信号强度确定点阵对应位置的碱基类别。

如图4所示，为本实施例样品偏转方式，当成像系统调整合适之后，水平偏转角度以及垂直偏转角度约等于0度，因此只需要考虑水平偏移的大小，即视野中第一个点的位置。如图5所示的对图像进行定位得到一系列的光斑中心坐标。通过对上述一系列筛选后的光斑中心位置估计视野中第一个点的坐标P

如图6所示，为根据上述视野中第一个点的坐标以及点阵间距生成的基坐标矩阵A。利用上述生成的基坐标矩阵迭代计算A、C、T、G四通道点阵位置的信号强度如图7所示。

如图8所示，根据A、C、T、G四个通道的相同点阵位置的信号计算最终的碱基类别。

如图9所示，本实施例通过以下方式实现成像：成像模块中激光通过棱镜反射，实现大范围内的均匀照明且保持激光功率为普通激光器的输出功率。激光为宽光束，且每一束激光之间紧紧挨着。激光通过全内反射方式照射到样品，样品受激发，发射荧光通过高数值孔径和大视场的镜头以及荧光滤光片后被探测器检测到。系统通过镜筒透镜对镜头的相差进行校正。探测器可以选用CCD或者CMOS。

通过使用光学检测系统实际参数，系统分辨率设置为550纳米，模拟测试不同样品间距下，调整不同成像像素大小，进行模拟计算得到使用本发明所述方法进行测序的错误率如图9所示。当相邻样品点间距减小到成像系统分辨率的0.4倍，计算获得测序读取错误率仍小于万分之一。缩小样品间距到成像系统分辨率的0.36倍，测序错误率仍保持小于千分之一。

表1样品间距以及像素大小与读取错误率的关系。

与现有技术相比，本方法在不改变传统激光照明成像方式的基础上实现了样品密度为密度大于16000K/mm

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。