间充质谱系前体或干细胞的3D培养

技术领域

本公开涉及不含血清的干细胞培养的经改进的方法，具体地涉及生物反应器中的3D培养以及供所述培养使用的细胞培养基和组合物。

背景技术

多能间充质谱系细胞(MLC)因其高增殖和分化潜能以及免疫调节和其它有益特性而被提出作为治疗应用的有吸引力的候选物(Caplan AI(2007)《细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)》,213,341-347；Prockop DJ(2007)《临床药理学与治疗学(Clin PharmacolTher.)》,82,241-243)。然而，面临的最重要且最紧迫的挑战之一是，需要将细胞产物的高度个体化的体外要求转化为可再现、稳健且安全的大规模流线型生物过程。

用于分离和扩增MSC的常规培养基由限定的基础培养基(例如杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)或α改良最小必需培养基(α-MEM))组成，所述培养基由于其高含量的刺激生长因子而补充有胎牛血清。虽然这些培养基总体上被报告为支持多次传代的MSC的增殖，但是已经出现了对由于与胎牛血清相关联的潜在风险的担忧(Dimarakis和Levicar(2006)《干细胞(Stem Cells)》,24,1407–1408；Mannello和Tonti(2007)《干细胞》,25,1603–1609)。具体地，胎牛血清可能含有有害污染物，如朊病毒、病毒和人畜共患病介质，并可能引发免疫反应。此外，胎牛血清的不良定义的性质以及其高度批次间差异可能使培养基的生长支持特性不一致，并因此使得细胞产生过程的标准化变得困难。

已经研究了人来源的补充物，如人血清和血小板裂解物，作为胎牛血清的替代物。人血清通常不被视为合适的替代物，因为其缺乏可用性并且其促生长潜力不一致。最近已提出将人血小板源性补充物，如血小板裂解物(hPL)和富含血小板的血浆，作为优质替代品(Doucet等人(2005)《细胞生理学杂志》,205,228–236；Muller等人(2006),《细胞疗法(Cytotherapy.)》8,437–444；Capelli等人(2007)《骨髓移植术(Bone MarrowTransplant.)》,40,785–91；Lange等人(2007)《细胞生理学杂志》,213,18–26；Reinisch等人(2007)《再生医学(Regen Med.)》,2,371–82)。尽管这些研究表明合并的人血小板衍生物具有相当大的促生长特性，但其对MLC生长的影响不一致(Bieback等人(2008)《移注医学和血液疗法(Transfus Med Hemother.)》,35,286–294)。此外，这些hPL调配物的高成本可能阻止商业细胞培养的脚步。

因此，对于支持在不含胎牛血清的细胞培养物中分离和快速扩增MSC的有成本效益的方法的需求仍未得到满足。

发明内容

诸位发明人发现，胎牛血清在三维(3D)生物反应器培养中是间充质谱系或干细胞生长的令人惊讶地不良的刺激物，但其在二维(2D)环境中是间充质谱系或干细胞生长的有效刺激物。因此，诸位发明人注意到，在2D环境中有效的生长培养基在3D环境中可能无效。此外，通过从培养基中去除动物血清，诸位发明人发现其它非动物生长刺激物，如人血小板裂解物(hPL)，在促进干细胞在3D环境中的生长方面特别有效。因此，在一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述细胞培养基是不含动物血清的。

hPL包括各种生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)。诸位发明人发现了PDGF和FGF2在3D环境中促进间充质谱系或干细胞的重要性。因此，在一实例中，所述培养基是不含动物血清的并且包括PDGF和FGF2。在另一实例中，所述培养基进一步包括EGF。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。

诸位发明人还发现，当所述培养基不含动物血清时，在3D培养中在粘附材料上培养间充质谱系或干细胞对于在3D环境中生长是重要的。因此，在另一实例中，本公开涉及一种在三维培养中培养间充质谱系前体或干细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，并且其中所述细胞培养基是不含动物血清的。在一实例中，所述培养基进一步包括PDGF和FGF2。在另一实例中，所述培养基进一步包括EGF。在一实例中，在生物反应器中培养所述间充质谱系前体或干细胞。在一实例中，所述粘附材料为微载体。

诸位发明人随后发现，在3D培养中在某些粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞是有问题的，因为活细胞数量在峰细胞密度处或附近显著下降。令人惊讶的是，此问题通过在某些粘附材料，特别是可降解微载体，如具有可降解芯的那些微载体和/或低密度的微载体上培养间充质系或干细胞而得以缓解。因此，在一实例中，所述微载体是可降解的。在另一实例中，所述微载体具有可降解芯。在另一实例中，所述微载体具有碳水化合物聚合物或糖蛋白芯。

在各个实例中，如微载体等所述粘附材料可以是包被的。在一实例中，所述粘附材料是包被的。在另一实例中，所述微载体是包被的。在一实例中，用糖蛋白包被所述粘附材料或所述微载体。在一实例中，所述糖蛋白为胶原蛋白或玻连蛋白。在一实例中，所述玻连蛋白为人玻连蛋白或其合成模拟物。玻连蛋白的合成模拟物能够与间充质谱系前体或干细胞结合并支持间充质谱系前体或干细胞在其表面上生长。在另一实例中，所述糖蛋白是合成的。因此，在一实例中，本公开涵盖3D细胞培养，其包括在细胞培养基中的粘附材料上培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上，其中所述细胞培养基是不含动物血清的，并且其中用如粘连蛋白或胶原蛋白等糖蛋白包被所述粘附材料。

在另一实例中，所述微载体包括碳水化合物聚合物芯，其中所述碳水化合物聚合物以钙依赖性方式连接。

在一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至5g/ml。在另一实例中，所述微载体的密度为约0.5g/ml至3g/ml。在一实例中，所述培养基包括0.5g/L至5g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/L至3g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括0.5g/L至2g/L的微载体。在另一实例中，所述培养基包括约1g/L的微载体。

在一实例中，所述微载体是多孔的。在另一实例中，所述微载体是大孔的。

在一实例中，所述细胞培养基是不含动物组分的。

诸位发明人还惊奇地发现，在生物反应器培养中每24小时更换指定量的培养基与细胞生长的改善有关。因此，在一实例中，本公开的方法包括每培养24小时更换60％至80％的培养基。在另一实例中，本公开的方法包括每培养24小时更换约70％的培养基。在这些实例中，培养基更换可以从在生物反应器中培养的第2天至第4天开始。在一实例中，培养基更换从在生物反应器中培养的第3天开始。

在一实例中，本公开的方法进一步包括通过使间充质谱系前体或干细胞与解离剂接触而使间充质谱系前体或干细胞与所述粘附材料解离。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在达到峰细胞密度后与所述粘附材料解离。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中培养约7天后解离。

在一实例中，本公开的方法进一步包括使所述粘附材料或所述微载体降解。在一实例中，通过向所述培养基中添加酶使所述粘附材料或所述微载体降解。在一实例中，所述微载体包括玻连蛋白，例如，包被在玻连蛋白中，并且所述酶是为重组果胶酶。在此实例中，所述微载体可以包括以钙依赖性方式连接的碳水化合物芯，在钙依赖性方式的情况下，可以向所述培养基中添加EDTA和如重组果胶酶等酶。

在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞在3D培养中以5,000个细胞/ml至20,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以10,000个细胞/ml接种。

在一实例中，间充质谱系前体或干细胞已经从主细胞库中培养扩增。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞已经从主细胞库中以二维培养格式培养扩增。

在另一实例中，本公开的方法进一步包括从培养基中回收细胞，并且冷冻保存所回收的细胞。在一实例中，将所回收的细胞在冷冻保存前进行洗涤和浓缩。

在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞在三维培养中培养至少6天，优选地5天至8天，更优选地7天。

在一实例中，所述生物反应器为搅拌釜生物反应器。在另一实例中，所述生物反应器为填充床生物反应器。在另一实例中，所述生物反应器为搅拌釜生物反应器和/或填充床生物反应器。

在另一实例中，本公开涵盖一种组合物，其包括间充质谱系前体或干细胞的群体和细胞培养基，其中所述细胞培养基是不含动物血清的并且包括粘附材料、PDGF和FGF2，并且其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上。在一实例中，所述粘附材料如上文所定义。例如，所述粘附材料可以为微载体。

在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质前体细胞或间充质干细胞。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质前体细胞。在一实例中，所述间充质谱系前体或干细胞为间充质干细胞。

在一实例中，所述培养基中的所述PDGF为PDGF-BB。在一实例中，所述培养基包括介于3.0ng/ml与120ng/ml之间的PDGF-BB。在另一实例中，所述培养基包括介于2pg/ml与6ng/ml之间的FGF2。在另一实例中，所述培养基包括小于0.8ng/ml的FGF2。在另一实例中，所述培养基进一步包括EGF。在另一实例中，所述培养基进一步包括介于0.08ng/ml与7ng/ml之间的EGF。

在一实例中，所述培养基包括α最小必需培养基或不含胎牛血清的扩展培养基。在一实例中，所述培养基是不含血清的。在一实例中，所述培养基将所述干细胞维持在未分化状态下。

在另一实例中，本公开涉及一种在生物反应器中培养干细胞的方法，所述方法包括在包括细胞培养基的生物反应器中培养间充质谱系前体或干细胞的群体，其中所述细胞培养基是不含动物血清的并且包括血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)以及任选地EGF。因此，在本实例中，所述培养基可以包括EGF。

附图说明

图1：使用补充有所述浓度的hPL的培养基用EMD-密理博(EMD-Millipore)培养间充质谱系细胞(MLC)后的增殖和最大细胞密度。示出了在胎牛血清中用同一MLC库进行的先前运行的结果以供比较。

图2：V2.2支持MLC在密理博Mobius 50L Cell Ready生物反应器(MilliporeMobius 50L Cell Ready bioreactor)中的稳健增殖。

图3：来自不同供体的MLC在V2.2中表现出不同的增殖动力学和产率。

图4：用于制备种子的培养基交换/收获策略对在旋转器烧瓶中在V2.2中产生的后续产率没有影响。

图5：在第4天的培养基交换之后第6天(D4MX/D6H)从8种不同供体中收获接种有单个MCB的CF10细胞工厂产生了7/8个MCB的4亿个细胞的目标数量。

图6：Cultispher-G微载体与Solohill胶原蛋白包被的微载体在BioBLU 3c中在V2.2培养基中的性能的比较。

图7：将Cultispher-G微载体与BioBLU 50c一次性使用的BioR一起使用产生了由V2.2驱动的MLC的高度可再现产率，并且在峰数量后达到稳定平台期。

图8：Cultispher G、Solohill胶原蛋白包被的微载体在旋转器烧瓶中的性能与用胶原蛋白或Synthemax包被的康宁DMC(Corning DMC)的性能的比较。

图9：不同MLC库之中使用的康宁Synthemax DMC在旋转器烧瓶(100mL体积)中获得的产率的比较。

图10：在BioBLU 50c中使用V2.2和康宁Synthemax微载体获得的MLC的高度可再现产率。产率不受DO调节的影响。

图11：来自MCB019的MLC在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中繁殖后的解冻后活力。在不存在溶解氧(DO)对照的情况下产生的那些-蓝色；具有DO对照的那些-红色。

图12：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中繁殖后产生的冷冻保存的MLC的解冻后即刻细胞直径。在不存在DO对照的情况下产生的那些-蓝色；具有DO对照的那些–红色。

图13：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的冷冻保存的MLC的解冻后增殖动力学。

图14：由在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的冷冻保存的MLC在第6天产生的每孔的平均细胞数量。在不存在DO对照的情况下产生的那些-蓝色；具有DO对照的那些–红色。

图15：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的解冻后的冷冻保存的MLC的同一性(上图)和MLC纯度标志物在所述MLC上的表达(下图)的流式细胞术分析。

图16：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的MLC的条件培养基的SDF-1α水平。

图17：使用SDF-1α依赖性迁移测定在来自在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的MLC的条件培养基中测量的SDF-1α生物活性。

图18：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的MLC的条件培养基的VEGF-A水平。

图19：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的MLC的条件培养基的ANGPT1水平。

图20：在BioBLU 50c生物反应器中在康宁Synthemax DMC上在V2.2中产生的MLC一致地表现出抑制活化的同种异体T细胞的增殖的强大能力。

图21：用于MLC制造的生物反应器过程的示意图。

具体实施方式

一般技术和定义

除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子生物学、干细胞培养、免疫学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

除非另有说明，否则本公开中使用的细胞培养技术和测定是本领域的技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：如J.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》,约翰威利父子出版公司(JohnWiley and Sons)(1984)；J.Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)；T.A.Brown(编辑),《基本分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology:APractical Approach)》,第1卷和第2卷,IRL出版社(IRL Press)(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，和F.M.Ausubel等人(编辑),《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Pub.Associates)和威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience)(1988，包含迄今为止的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室,(1988)；以及J.E.Coligan等人(编辑),《当代免疫学指南(Current Protocols inImmunology)》,约翰威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。

如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％。

术语“水平”用于限定细胞培养基和本公开的组合物中存在的特定物质的量。例如，特定的浓度、重量、百分比(例如v/v％)或比率可用于定义特定物质的水平。

术语“足够的”在本文中用于定义当溶解于干细胞培养基中时提供特定浓度的生长因子的量。在这种情况下，“足够的量”由所需的培养基的体积决定。例如，如果干细胞培养基中的FGF2的所需浓度为约10pg/ml，并且需要500ml的细胞培养基，则足够的量将为约5ng。

在从粘附材料释放间充质谱系前体或干细胞的上下文中，术语“足够的”用于指在足以使间充质谱系前体或干细胞从粘附材料释放的频率和振幅下振动一定时间段。

术语“接种”在本文中用于指将细胞引入到3维(3D)培养中的过程。在一实例中，本公开的方法涵盖动态接种，其中培养基在细胞附着到粘附材料上时继续混合。在另一实例中，将细胞接种到3D培养中，并且放置足以粘附到培养基中的粘附材料上使得细胞可以附着到材料上的时间段。在一些实施例中，将细胞接种到生物反应器中的步骤是在接种后将生物反应器中的流断开至少10小时时实现的。

在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以5,000个细胞/ml至20,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以8,000个细胞/ml至20,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以8,000个细胞/ml至15,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以5,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以8,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以至少8,000个细胞/ml接种。在另一实例中，将间充质谱系前体或干细胞以10,000个细胞/ml接种。

术语“回收”在本文中用于指从2D或3D培养中去除细胞。例如，可以从本文公开的生物反应器培养中回收细胞。在一实例中，首先将所回收的细胞用盐水溶液或可比溶液洗涤(例如2-3次)。在洗涤步骤之后，可以对粘附材料进行解离步骤。在一个实例中，在解离步骤期间采用合适的解离酶。在一实例中，在冷冻保存前对从3D培养中回收的细胞进行洗涤和浓缩。在一实例中，在冷冻保存前可以将经洗涤且经浓缩的细胞储存、填料、精加工和目视检查。

如本文所用，“解离剂”是用于破坏细胞和细胞所附着的表面之间的附着点的任何化合物。在一些实施例中，解离剂为酶。在特定实施例中，酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶包含重组胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶1型、胶原酶2型、胶原酶3型、胶原酶4型或分散酶。在一实例中，解离剂包括EDTA。在一实例中，解离剂包括EDTA和酶。例如，解离剂可以包括EDTA和果胶酶。在一实例中，解离剂可以包括EDTA和胶原酶。本领域的技术人员将理解，EDTA可以是具有以钙依赖性方式连接的碳水化合物芯的微载体的适当的解离剂。在一实例中，解离剂还使微载体降解。例如，解离剂可以使微载体芯降解。

在一实例中，可以使用解离剂使细胞与本文公开的粘附材料解离。例如，解离剂可以被进料到本文公开的生物反应器中以根据需要使细胞解离。在一实例中，细胞培养可以在与适当的解离剂接触之前进行过滤或部分过滤。例如，细胞可以在达到峰细胞密度后与解离剂接触。在另一实例中，所培养的细胞可以通过振动与粘附材料解离。“振动”意指围绕平衡点的机械振荡。振荡可以是周期性的或随机的。在一个实施例中，振动是由于在振幅和频率方面进行控制的往复线性振荡引起的。在一些实施例中，振荡的振幅和频率是恒定的，而在其它实施例中，振幅或频率中的一者或两者可以根据需要变化以实现细胞的解离。其它实例，还可以使用本领域常规的设备和装置来控制振动的时间段的持续时间。在一些实例中，振动是由机电装置，例如，在其驱动轴上具有不平衡质量的电动机提供的。在其它实例中，振动是由电气装置提供的。能够赋予振动的装置的各个实例在本领域是已知的。

贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。

贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一种或多种)。

本领域的技术人员将会了解，可以对在此描述的本公开进行除具体所描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两者或更多者的任何和所有组合。

本公开的范围不受本文所述的具体实施例的限制，这仅出于例示的目的。如本文所描述的，功能等效的产物、组合物和方法显然在本公开的范围内。

除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实例。

间充质谱系前体细胞

如本文所使用的，术语“间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)”是指未分化的多能细胞，所述多能细胞具有自我更新的能力同时保持多能性以及分化为许多间充质来源(例如，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层来源(例如，肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的细胞类型的能力。为避免疑义，“间充质谱系前体细胞”是指可以分化为如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织等间充质细胞的细胞。

术语“间充质谱系前体或干细胞”包含亲本细胞以及其未分化的后代。所述术语还包含间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞(MSC)、血管周围间充质前体细胞以及其未分化的后代。

间充质谱系前体或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同源的(syngenic)或同基因的(isogenic)。自体细胞是从其将被重新植入的同一个体中分离的。同种异体细胞是从同一物种的供体中分离的。异种细胞是从另一物种的供体中分离的。同源或同基因细胞是从基因相同的生物体中分离的，如双胞胎、克隆或高度近交的研究动物模型。

在一实例中，间充质谱系前体或干细胞是同种异体的。在一实例中，同种异体间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。

间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也显示存在于多种宿主组织中，包含例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。其还存在于皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中；并且能够分化成种系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，间充质谱系前体或干细胞能够分化成大量细胞类型，包含但不限于脂肪、骨、软骨、弹性组织、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响和/或如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件等内源性生物活性因子的各种影响。

术语“富集的”、“富集”或其变体在本文中用于描述与未经处理的细胞群体(例如，在其自然环境中的细胞)相比，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加的细胞群体。在一实例中，富集间充质谱系前体或干细胞的群体包括至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的间充质谱系前体或干细胞。在此方面，将采用术语“富集间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”来明确支持术语“包括X％间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”，其中X％是如本文叙述的百分比。在一些实例中，间充质谱系前体或干细胞可以形成克隆源性集落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有此活性。

在本公开的一实例中，间充质谱系前体或干细胞为间充质干细胞(MSC)。MSC可以是均质组合物或可以是富集在MSC中的混合细胞群体。可以通过培养粘附骨髓或骨膜细胞获得均质MSC组合物，并且可以通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定MSC。例如，在美国专利第5,486,359号中描述了一种用于获得富集在MSC中的细胞群体的方法。MSC的替代性来源包含但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。在一实例中，MSC是同种异体的。在一实例中，MSC是冷冻保存的。在一实例中，MSC是培养扩增且冷冻保存的。

在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞为CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+MSC。

分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以通过培养在体外扩增。分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以冷冻保存、解冻，并且随后通过培养在体外扩增。

在一个实例中，分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞以50,000个活细胞/cm

如本领域的技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施例中，其表达以下标志物中的一种或多种：CD44、NG2、DC146和CD140b。培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上也不同于体内细胞，与体内大部分非循环(静态)细胞相比，具有更高的增殖率。

在一个实例中，细胞群体从包括可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制剂中富集。在此方面，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不一定是。例如，如本文所描述的和/或例示的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如，间充质前体细胞)还表达STRO-1(并且可以是STRO-1bright)。因此，细胞为STRO-1+的指示并不意味着细胞仅通过STRO-1表达来选择。在一个实例中，至少基于STRO-3表达来选择细胞，例如，其为STRO-3+(TNAP+)。

提及细胞或其群体的选择不一定需要从特定组织来源中选择。如本文所描述的，STRO-1+细胞可以选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包括STRO-1+细胞(例如，间充质前体细胞)的任何组织或血管化组织或包括周细胞(例如，STRO-1+周细胞)的组织或本文所述的组织中的任何一种或多种组织中选择提供了支持。

在一个实例中，本公开中使用的细胞单独或共同表达一种或多种标志物，所述标志物选自由以下组成的组：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。

“单独地”意指本公开单独涵盖所述标志物或标志物组，并且尽管本文中可能未单独列出单独的标志物或标志物组，但所附权利要求可以将此类标志物或标志物组彼此单独和分开定义。

“共同地”意指本公开涵盖所述标志物或标志物组的任何数量或组合，并且尽管标志物或标志物组的此类数量或组合可能未在本文中具体列出，但所附权利要求可以将此类组合或子组合与任何其它标志物组合或标志物组单独和分开定义。

如本文所使用的，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，所述术语涵盖肝脏同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾脏同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP为BAP。在一个实例中，如本文所使用的TNAP是指可以与由根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》的规定以保藏登记号PTA-7282于2005年12月19日保藏在ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体结合的分子。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆源性CFU-F。

在一个实例中，显著比例的STRO-1+细胞能够分化成至少两个不同的种系。STRO-1+细胞可以定型为的谱系的非限制性实例包含：骨前体细胞；肝细胞祖细胞，所述祖细胞对胆管上皮细胞和肝细胞具有多能性；神经受限细胞，所述神经受限细胞可以产生胶质细胞前体，所述胶质细胞前体进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞；神经元前体，所述神经元前体进展为神经元；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其它谱系包含但不限于成牙质细胞、产生牙质的细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、如角质形成细胞等皮肤细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一实例中，间充质谱系前体或干细胞从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。

本公开所涵盖的间充质谱系前体或干细胞也可以在向受试者施用之前冷冻保存。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在向受试者施用之前进行培养扩增和冷冻保存。

在一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及其后代、源自其的可溶性因子和/或从其分离的胞外囊泡。在另一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及从其分离的胞外囊泡。例如，可以在适合将胞外囊泡分泌到细胞培养基中的条件下培养扩增本公开的间充质前体谱系或干细胞一定时间段。随后可以从培养基中获得分泌的胞外囊泡用于疗法。

如本文所使用的，术语“胞外囊泡”是指从细胞中自然释放的脂质颗粒，并且其大小范围为约30nm至大至10微米，但是其大小通常小于200nm。其可以含有来自释放细胞(例如，间充质干细胞；STRO-1

如本文所使用的，术语“外泌体”是指一种类型的胞外囊泡，所述胞外囊泡的大小通常在约30nm至约150nm的范围内，并且源自其从中贩运到细胞膜并且释放的哺乳动物细胞的核内体区室。其可以含有核酸(例如，RNA；微小RNA)、蛋白质、脂质和代谢物，并且可以通过从一个细胞分泌并被其它细胞吸收以递送其货物而在细胞间通讯中发挥作用。

细胞的培养扩增

在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体或干细胞培养基与新鲜分离的细胞的区别在于其已在细胞培养基中培养并传代(即次代培养)。在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4-10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5次传代、至少6次传代、至少7次传代、至少8次传代、至少9次传代、至少10次传代。例如，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至8次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至7次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于10次传代。在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于7次传代。在这些实例中，干细胞可以在被冷冻保存之前进行培养扩增以提供中度冷冻保存的MLPSC群体。在一实例中，本公开的方法培养来自中度冷冻保存的MLPSC群体的细胞。

在一实施例中，间充质谱系前体或干细胞可以从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。在一实例中，培养扩增过程包括：

i.通过传代扩增来扩增多个活细胞以提供至少约10亿个活细胞的制剂，其中传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体或干细胞的原代培养，并且然后连续建立从先前培养物中分离的间充质谱系前体或干细胞的第一非原代(P1)培养；

ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体或干细胞的P1培养扩增至间充质谱系前体或干细胞的第二非原代(P2)培养；以及

iii.制备和冷冻保存从间充质谱系前体或干细胞的P2培养中获得的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂；以及

iv.将冷冻保存的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂解冻并通过传代扩增来扩增处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂。

在一实例中，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂具有抗原谱和活性谱，所述抗原谱和活性谱包括：

i.小于约0.75％的CD45+细胞；

ii.至少约95％的CD105+细胞；

iii.至少约95％的CD166+细胞。

在一实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂能够将CD3/CD28活化PBMC的IL2Ra表达抑制至少约30％。

在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4-10次传代，其中间充质谱系前体或干细胞在被进一步培养扩增之前在至少2次传代或3次传代后被冷冻保存。在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代，冷冻保存，然后在根据本公开的方法培养之前进一步培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代。

可以使用本领域已知的任何设备和细胞处置方法进行间充质谱系前体或干细胞分离和离体扩增的过程。本公开的各种培养扩增实施例采用需要对细胞进行操控的步骤，例如，接种、进料、使粘附培养物解离或洗涤的步骤。任何操控细胞的步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体或干细胞在制备期间总体上可以承受一定量的损伤，但细胞优选地通过充分执行给定步骤同时最小化对细胞的损伤的处理程序和/或设备进行操控。

在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在包含细胞来源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口端口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于洗涤的细胞的最终产物袋和适当的管道的设备中洗涤，例如，如US 6251295中所描述的，所述文献特此通过引用并入。

在一实例中，根据本公开培养的间充质谱系前体或干细胞组合物在CD105阳性和CD166阳性和且CD45阴性方面是95％均质的。在一实例中，此均质性通过离体扩增持续存在；即虽然多次群体倍增。

在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在3D培养之前在2D培养中被培养扩增。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞是从主细胞库中培养扩增的。在一实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在接种于3D培养之前在2D培养中从主细胞库中培养扩增。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3D培养中之前在2D培养中从主细胞库中培养扩增至少3天。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3D培养中之前在2D培养中从主细胞库中培养扩增至少4天。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3D培养之前在2D培养中从主细胞库中培养扩增3天至5天。在这些实例中，2D培养可以在细胞工厂中进行。各种细胞工厂产物可商购获得(例如赛默飞世尔公司(Thermofisher)、西格玛公司(Sigma))。

细胞的修饰

根据本公开培养的间充质谱系前体或干细胞可以以此类方式改变，即在施用时，细胞的裂解被抑制。抗原的改变可以诱导免疫无应答或耐受性，从而预防诱导免疫应答的效应子阶段(例如，细胞毒性T细胞产生、抗体产生等)，所述效应子阶段最终导致正常免疫应答中对外来细胞的排斥。可以改变以实现此目标的抗原包含例如MHC I类抗原、MHC II类抗原、LFA-3和ICAM-1。

间充质谱系前体或干细胞也可以被基因修饰成表达对横纹骨骼肌细胞的分化和/或维持具有重要意义的蛋白质。示例性蛋白质包含生长因子(TGF-β、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、FGF)、生肌因子(例如，myoD、成肌素、生肌因子5(Myf5)、生肌调节因子(MRF))、转录因子(例如，GATA-4)、细胞因子(例如，嗜心素-1)、神经调节蛋白家族成员(例如，神经调节蛋白1、2和3)和同源盒基因(例如，Csx、tinman和NKx家族)。

细胞培养基

本公开的方法使用包括促进间充质谱系前体或干细胞增殖的生长因子的不含胎牛血清的干细胞培养基。在一实施例中，培养基是不含血清的干细胞培养基。在一实例中，除了下文讨论的粘附材料之外，本公开的方法中使用的细胞培养基包括：

基础培养基；

血小板源性生长因子(PDGF)；

成纤维细胞生长因子2(FGF2)。

如在本公开的上下文中使用的术语“培养基”(“medium”或“media”)包含细胞周围环境的组分。培养基有助于和/或提供适于允许细胞生长的条件。培养基可以是固态的、液态的、气态的或相和材料的混合物。培养基可以包含液态生长培养基以及不维持细胞生长的液态培养基。培养基还包含凝胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包含在培养皿或其它固态或半固态载体上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”还指代旨在用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触。

本公开的培养基可以通过使用基础培养基来制备。在本公开的上下文中，“基础培养基”是指适于暴露于细胞，例如间充质前体谱系或干细胞的未补充的培养基。基础培养基包含，例如，伊格尔氏最小必需(MEM)培养基、α改良MEM培养基、StemSpan

进一步地，本公开的细胞培养基可以包含任何组分，如脂肪酸或脂质、维生素、细胞因子、抗氧化剂、缓冲剂、无机盐等。

本公开中使用的细胞培养基含有所有必需氨基酸，并且还可以含有非必需氨基酸。通常，氨基酸被分类为必需氨基酸(Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、His)和非必需氨基酸(Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg、Pro)。

本领域的技术人员将理解，为了获得最佳结果，基础培养基必须适于具有可以足以增强细胞增殖的水平使用的关键营养物质的所关注的细胞系。例如，如果发现基础培养基中的葡萄糖(或其它能量源)已耗尽并因此限制了细胞增殖，则可能需要增加此能量源的水平，或在培养过程期间添加葡萄糖(或其它能量源)。在一实例中，溶解氧(DO)水平还可以是受控的。

在一实例中，本公开的细胞培养基含有人来源的添加剂。例如，可以向本公开的方法中使用的细胞培养基添加人血清和人血小板细胞裂解物。

在一实例中，本公开的细胞培养基仅含有人来源的添加剂。因此，在一实例中，细胞培养基是不含异种的。为避免疑问，在这些实例中，培养基是不含动物蛋白的。在一实例中，本公开的方法中使用的细胞培养基是不含动物组分的。

抗坏血酸

抗坏血酸是各种种类的细胞在培养中生长和分化的必需补充物。现在应当理解，特定抗坏血酸衍生物是“短效的”，因为其在溶液中不稳定，特别是在中性pH和37℃的正常细胞培养条件下。这些短效衍生物迅速氧化成草酸或苏糖酸。在37℃的培养基(pH7)中，氧化使这些短效抗坏血酸衍生物的水平在24小时内降低了大约80-90％。因此，在各种细胞类型的常规细胞培养中，短效抗坏血酸衍生物已经被更稳定的“长效”抗坏血酸衍生物取代。

在本公开的上下文中，术语“短效”涵盖在中性pH和37℃的培养条件下细胞培养24小时后大约80-90％被氧化的抗坏血酸衍生物。在一个实例中，短效L-抗坏血酸衍生物为L-抗坏血酸盐。例如，在本公开的上下文中，L-抗坏血酸钠盐为“短效”抗坏血酸衍生物。

相比之下，术语“长效”涵盖在中性pH和37℃的培养条件下细胞培养24小时后大约80％-90％未被氧化的抗坏血酸衍生物。在一个实例中，在本公开的上下文中，L-抗坏血酸-2-磷酸盐是“长效”抗坏血酸衍生物。长效抗坏血酸衍生物的其它实例包含四己基癸醇抗坏血酸酯、抗坏血酸磷酸镁和2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸。本公开的细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物、长效抗坏血酸衍生物或其混合物。

促有丝分裂因子

PDGF和FGF2在体外不含胎牛血清的细胞培养中协同促进干细胞增殖。

PDGF是与血小板源性生长因子受体(PDGFR)结合的细胞生长和分裂的调节剂。在化学术语中，PDGF是由两条A(-AA)或两条B(-BB)链或这两条链的组合(-AB)构成的二聚糖蛋白。PDGF-AB已显示与PDGFα和β受体亚基结合以形成PDGFαβ和αα受体二聚体。在本公开的上下文中，PDGF涵盖PDGF-BB和PDGF-AB。

碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)也被称为BFGF、FGFB，HBGF-2为成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员。FGF2还是细胞生长和分裂的调节剂。PDGF和FGF2都可归类为有丝分裂原，因为其促进细胞开始细胞分裂。

在一实例中，本公开的方法包括在包括血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的不含胎牛血清的细胞培养基中培养干细胞群体，其中FGF2水平小于约6ng/ml。例如，FGF2水平可以小于约5ng/ml、小于约4ng/ml、小于约3ng/ml、小于约2ng/ml、小于约1ng/ml。在其它实例中，FGF2水平小于约0.9ng/ml、小于约0.8ng/ml、小于约0.7ng/ml、小于约0.6ng/ml、小于约0.5ng/ml、小于约0.4ng/ml、小于约0.3ng/ml、小于约0.2ng/ml。

在另一实例中，FGF2的水平介于约1pg/ml与100pg/ml之间。在另一实例中，FGF2水平介于约5pg/ml与80pg/ml之间。在另一实例中，FGF2水平介于约10pg/ml与40pg/ml之间。在另一实例中，FGF2水平为至少约10pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约11pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约12pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约13pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约14pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约15pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约16pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约17pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约18pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约19pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约20pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约21pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约22pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约23pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约24pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约25pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约26pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约27pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约28pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约29pg/ml。在另一实例中，FGF2水平为至少约30pg/ml。

在一实例中，PDGF为PDGF-BB。在一实例中，PDGF-BB水平介于约1ng/ml与150ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-BB水平介于约7.5ng/ml与120ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-BB水平介于约15ng/ml与60ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约10ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约15ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约20ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约21ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约22ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约23ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约24ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约25ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约26ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约27ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约28ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约29ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约30ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约31ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约32ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约33ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约34ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约35ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约36ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约37ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约38ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约39ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约40ng/ml。

在另一实例中，PDGF为PDGF-AB。在一实例中，PDGF-AB水平介于约1ng/ml与150ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-AB水平介于约7.5ng/ml与120ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-AB水平介于约15ng/ml与60ng/ml之间。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约10ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约15ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约20ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约21ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约22ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约23ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约24ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约25ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约26ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约27ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约28ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约29ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约30ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约31ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约32ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约33ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约34ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约35ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约36ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约37ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约38ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约39ng/ml。在另一实例中，PDGF-AB水平为至少约40ng/ml。

在其它实例中，可以向的细胞培养基中添加另外的因子。在一实例中，本公开的方法包括在进一步包括EGF的不含胎牛血清的细胞培养基中培养干细胞群体。EGF是为通过与其受体EGFR结合刺激细胞增殖的生长因子。在一实例中，本公开的方法包括在进一步包括EGF的不含胎牛血清的细胞培养基中培养干细胞群体。在一实例中，EGF水平介于约0.1ng/ml与7ng/ml之间。例如，EGF水平可以为至少约5ng/ml。

在另一实例中，EGF水平介于约0.2ng/ml与3.2ng/ml之间。在另一实例中，EGF水平介于约0.4ng/ml与1.6ng/ml之间。在另一实例中，EGF水平为约0.2ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.3ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.4ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.5ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.6ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.7ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.8ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约0.9ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约1.0ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约1.1ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约1.2ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约1.3ng/ml。在另一实例中，EGF水平为至少约1.4ng/ml。

在一实例中，PDGF-BB水平为至少约3.2ng/ml，EGF水平为至少约0.8ng/ml，并且FGF2水平为至少约0.002ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约9.6ng/ml，EGF水平为至少约0.24ng/ml，并且FGF2水平为至少约0.006ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约16ng/ml，EGF水平为至少约0.40ng/ml，并且FGF2水平为至少约0.01ng/ml。在另一实例中，PDGF-BB水平为至少约32ng/ml，EGF水平为至少约0.80ng/ml，并且FGF2水平为至少约0.01ng/ml。

在一实例中，培养基包括3.2ng/ml PDGF-BB、0.08ng/ml EGF和0.002ng/ml FGF。在另一实例中，培养基包括9.6ng/ml PDGF-BB、0.24ng/ml EGF和0.006ng/ml FGF。在另一实例中，培养基包括16ng/ml PDGF-BB、0.4ng/ml EGF和0.01ng/ml FGF。在另一实例中，培养基包括32ng/ml PDGF-BB、0.8ng/ml EGF和0.02ng/ml FGF。在这些实例中，如αMEM或StemSpan

在其它实例中，可以向本公开的细胞培养基中添加另外的因子。例如，细胞培养基可以补充有一种或多种刺激因子，所述一种或多种刺激因子选自由以下组成的组：表皮生长因子(EGF)、1α,25-二羟基维生素D3(1,25D)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-lβ(IL-lβ)和基质源性因子lα(SDF-lα)。在另一实施例中，还可以在存在量足以支持细胞的生长的至少一种细胞因子的情况下培养细胞。在另一实施例中，可以在存在肝素或其衍生物的情况下培养细胞。例如，细胞培养基可以含有约50ng/ml的肝素。在其它实例中，细胞培养基含有约60ng/ml的肝素、约70ng/ml的肝素、约80ng/ml的肝素、约90ng/ml的肝素、约100ng/ml的肝素、约110ng/ml的肝素、约110ng/ml的肝素、约120ng/ml的肝素、约130ng/ml的肝素、约140ng/ml的肝素、约150ng/ml的肝素或其衍生物。在一实例中，肝素衍生物为硫酸盐。各种形式的硫酸肝素在本领域是已知的，并且包含硫酸肝素2(HS2)。HS2可以来自各种来源，包含例如雄性和/或雌性哺乳动物的肝脏。因此，示例性的硫酸肝素包含雄性肝硫酸肝素(MMLHS)和雌性肝硫酸肝素(FML HS)。

在另一实例中，本公开的细胞培养基促进干细胞增殖，同时将干细胞维持在未分化状态。当干细胞尚未成为特定分化谱系时，其被视为未分化。如以上讨论的，干细胞显示出区别于分化细胞的形态特征。此外，未分化的干细胞表达可以用作用于检测分化状态的标志物的基因。多肽产物还可以用作用于检测分化状态的标志物。因此，本领域的技术人员可以使用常规形态学、遗传学和/或蛋白质组学分析容易地确定本公开的方法是否将干细胞维持在未分化状态。

血清

通常，干细胞使用补充有至少约10–15v/v％血清，通常为胎牛血清(FBS)，也被称为胎小牛血清(FCS)的培养基维持在细胞培养中。本公开的方法中使用的细胞培养基为不含胎牛血清的细胞培养基。在一实施例中，细胞培养基补充有非胎儿血清。例如，培养基可以补充有新生儿血清或成人血清。

在另一实施例中，细胞培养基补充有人血清。在一实例中，细胞培养基可以补充有人非胎儿血清。例如，细胞培养基可以补充有至少约1v/v％、至少约2v/v％、至少约3v/v％、至少约4v/v％、至少约5v/v％、至少约6v/v％、至少约7v/v％、至少约8v/v％、至少约9v/v％、至少约10v/v％、至少约11v/v％、至少约12v/v％、至少约13v/v％、至少约14v/v％、至少约15v/v％、至少约16v/v％、至少约17v/v％、至少约18v/v％、至少约19v/v％、至少约20v/v％、至少约21v/v％、至少约22v/v％、至少约23v/v％、至少约24v/v％、至少约25v/v％人非胎儿血清。

在另一实例中，细胞培养基可以补充有人新生儿血清。例如，细胞培养基可以补充有至少约1v/v％、至少约2v/v％、至少约3v/v％、至少约4v/v％、至少约5v/v％、至少约6v/v％、至少约7v/v％、至少约8v/v％、至少约9v/v％人新生儿血清。在一实例中，人新生儿血清是从脐带血“脐血”中获得的。

在另一实例中，细胞培养基可以补充有人成人血清。例如，培养基可以补充有至少约1v/v％、至少约2v/v％、至少约3v/v％、至少约4v/v％、至少约5v/v％、至少约6v/v％、至少约7v/v％、至少约8v/v％、至少约9v/v％、至少约10v/v％、至少约11v/v％、至少约12％、至少约13v/v％、至少约14v/v％、至少约15v/v％、至少约16v/v％、至少约17v/v％、至少约18v/v％、至少约19v/v％、至少约20v/v％、至少约21v/v％、至少约22v/v％、至少约23v/v％、至少约24v/v％、至少约25v/v％人成人血清。

在一实例中，人成人血清为人AB血清。例如，细胞培养基可以补充有至少约1v/v％、至少约2v/v％、至少约3v/v％、至少约4v/v％、至少约5v/v％、至少约6v/v％、至少约7v/v％、至少约8v/v％、至少约9v/v％人AB血清。在一实例中，细胞培养基补充有至少约3％人AB血清。

本公开的细胞培养基还可以含有已知的血清替代物。血清替代物可以为，例如，白蛋白(例如，富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'-硫醇甘油、血小板裂解物、富含血小板的血浆或适当地含有血清等物的那些血清替代物。这种血清替代物可以通过例如国际公开WO 93/30679中描述的方法制备，并且还可以使用可商购获得的产物。

在一实施例中，培养基是不含血清的。在一实施例中，3D培养是不含FBS血清的。在一实施例中，3D培养基补充有以上提到的不含异种的血清。在一实施例中，3D培养是不含血清的。

粘附材料和微载体

“粘附材料”是指合成的、天然存在的或其组合的非细胞毒性(即，生物相容性)材料，其具有可以将细胞保持在表面上或允许细胞附着到表面上的化学结构(例如，带电的表面暴露基团)。在一实例中，所述粘附材料为微载体。“微载体”是允许贴壁细胞在生物反应器中生长的支持基质。在一实例中，微载体为125-250微米的球体。在一实例中，微载体的密度足以在温和搅拌下保持悬浮。微载体可以由许多不同的材料制成，包含DEAE葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白和藻酸盐。在一实例中，微载体是多孔的。在另一实例中，所述微载体是大孔的。例如，微载体的孔径可以大于约50nm。例如，微载体的孔径可以为约50nm至约500nm。在其它实例中，微载体的孔径为约50nm至约250nm、约50nm至约150nm、约50nm至约100nm。在一实例中，微载体是可溶性颗粒。在一实例中，微载体包括糖蛋白。在一实例中，糖蛋白是合成的。在一实例中，微载体包括纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质凝胶、胞外基质组分、胶原蛋白、聚-L-乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、二氧化硅、玻璃、壳聚糖或植物海绵。在一实例中，微载体包括纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或层粘连蛋白中的一种或多种。例如，微载体可以用纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或层粘连蛋白中的一种或多种包被。在其它实例中，微载体是带静电的。在一实例中，微载体用糖蛋白包被。在其它实例中，微载体用胶原蛋白或明胶包被。在其它实例中，微载体用胶原蛋白或玻连蛋白包被。在一实例中，微载体用玻连蛋白(例如人玻连蛋白)包被。在一实例中，微载体用衍生的玻连蛋白(例如人玻连蛋白)包被。在一实例中，包衣是合成的。在一实例中，包衣是不含异种的。

在一实例中，微载体是可降解的。例如，微载体可以是可酶降解的。在一实例中，微载体是可降解的且多孔的。在一实例中，微载体是可降解的且大孔的。在一实例中，微载体具有可降解芯。在另一实例中，微载体具有聚合物芯。例如，微载体可以具有碳水化合物聚合物芯。例如，微载体可以具有合成碳水化合物聚合物芯。在一实例中，碳水化合物聚合物以钙依赖性方式连接。在这些实例中，微载体芯可以是包被的。示例性包衣如以上所讨论的。例如，微载体芯可以具有胶原蛋白或玻连蛋白包衣。

在一实例中，微载体的密度介于0.5g/ml至3g/ml之间。在另一实例中，微载体的密度介于0.5g/ml与2g/ml之间。在一实例中，微载体的密度为约1g/ml。

微载体的其它实例由Chen等人2020《生物技术快报(Biotechnology Letters.)》,42:1-10概述。

适用于本公开的微载体的实例包含Cultispher-G微载体和康宁DMC微载体。在一实例中，这些微载体可以用不含异种的包衣包被。在一实例中，用糖蛋白包被这些微载体。例如，微载体可以用胶原蛋白或如玻连蛋白等粘连蛋白或其合成衍生物包被。

在一实例中，作为本文公开的方法的一部分，使本文公开的粘附材料和微载体降解。本领域的技术人员将理解，用于使粘附材料或微载体降解的方法将由其组成决定。例如，粘附材料或微载体可以通过酶消化降解。例如，玻连蛋白包被的微载体可以使用rPectinase降解。在这些实例中，可以通过向培养基中添加酶来使粘附材料或微载体降解。根据所需的降解的性质，合适酶的其它实例包含TrypLE和胶原酶。

在一实例中，培养基包括介于0.5g/L与12g/L之间的微载体。在另一实例中，培养基包括介于0.5g/L与10g/L之间的微载体。在另一实例中，培养基包括介于0.5g/L与5g/L之间的微载体。在另一实例中，培养基包括介于0.5g/L与3g/L之间的微载体。在另一实例中，培养基包括1g/L的微载体。例如，培养基可以包括1g/L的胶原蛋白包被的微载体。在另一实例中，培养基可以包括1g/L的玻连蛋白包被的微载体。

3D培养和生物反应器

在一些实施例中，根据本公开的培养在3D培养中实现。例如，3D培养可以在生物反应器中进行。这种生物反应器的实例包含但不限于塞流式生物反应器、连续搅拌釜生物反应器和固定床生物反应器。例如，三维塞流式生物反应器(如美国专利第6,911,201号中所描述的)能够支持本文所描述的贴壁细胞的生长和长期维持。在此生物反应器中，将贴壁基质细胞接种在以上讨论的微载体上，填充在柱中，由此使得能够以相对小的体积繁殖大细胞数量。在本公开中可以使用其它3D生物反应器。另一实例是连续搅拌釜生物反应器。各种搅拌釜生物反应器可商购获得。本领域的技术人员将理解，叶轮位置可能需要优化。其它实例包含固定床生物反应器、气升式生物反应器、细胞接种灌注生物反应器和径流灌注生物反应器。可以根据本公开使用的其它生物反应器在美国专利第6,277,151号、第6,197,575号、第6,139,578号、第6,132,463号、第5,902,741号和第5,629,186号中描述。在另一实例中，生物反应器为搅拌釜生物反应器。在另一实例中，所述生物反应器为填充床生物反应器。在一实例中，填充床生物反应器为搅拌釜、一次性使用的容器。在一实例中，填充床生物反应器是由艾本德公司(Eppendorf)制造的BioBLU系列容器。

在一实例中，细胞在3D培养中培养至少5天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养至少6天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养至少7天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养至少8天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养至少9天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养至少10天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养5天至10天。在另一实例中，细胞在3D培养中培养6天至8天。本领域的技术人员将理解，通常将细胞培养至峰细胞密度。达到峰细胞密度的时间可以由接种的细胞的数量决定。因此，在另一实例中，细胞以约10,000个细胞/ml接种，并且在3D培养中培养至少6天。在另一实例中，细胞以约10,000个细胞/ml接种，并且在3D培养中培养至少7天。在另一实例中，细胞以约10,000个细胞/ml接种，并且在3D培养中培养6天至8天。

在一实例中，每24小时更换60％至80％的培养基。在另一实例中，每24小时更换65％至75％的培养基。在一实例中，每24小时更换约70％的培养基。在这些实例中，可以通过将培养基灌注到生物反应器中和之外来更换培养基。在这些实例中，从在生物反应器中培养的第3天开始更换培养基。

峰细胞密度

在执行本公开的方法时，在一实例中，细胞在3D培养中被培养至峰细胞密度。例如，可以将细胞在生物反应器中培养至峰细胞密度。在一实例中，根据本公开的方法进行培养使活细胞数量在达到峰细胞密度后趋于平稳。在一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后24小时大于75％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后24小时大于80％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后24小时大于85％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后24小时大于90％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后24小时大于95％。在一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后48小时大于75％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后48小时大于80％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后48小时大于85％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后48小时大于90％。在另一实例中，活细胞数量在达到峰细胞密度后48小时大于95％。

在一实例中，本公开的方法在50L生物反应器中产生150亿个至200亿个细胞。在另一实例中，本公开的方法在50L生物反应器中产生150亿个至180亿个细胞。在另一实例中，本公开的方法在50L生物反应器中产生150亿个至200亿个细胞，其中起始培养基体积为40L。在另一实例中，本公开的方法在50L生物反应器中产生150亿个至180亿个细胞，其中起始培养基体积为40L。在这些实例中，如本领域的技术人员将理解的，起始培养基将需要随时间推移进行更换，并且因此，用于达到指定数量的细胞的培养基的总体积将大于40L。

组合物

本公开涵盖组合物，所述组合物包括间充质谱系前体或干细胞的群体和细胞培养基，其中所述细胞培养基是不含血清的并且包括粘附材料、PDGF和FGF2，并且其中所述间充质谱系前体或干细胞附着到所述粘附材料上。在一实例中，粘附材料是以上提到的微载体。

在一实例中，组合物可以任选地包装在具有用于期望目的，如将组合物与细胞培养基混合以提供特定浓度的书面说明的合适的容器中。

在一实例中，组合物在生物反应器中提供。

本领域的技术人员将理解的是，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在特定实施例中示出的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。

本文所讨论和/或提到的所有出版物以其整体并入本文。

对已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。

本申请要求于2020年6月11日提交的AU2020901931的优先权，所述申请通过引用并入本文。

实例：

实例1：培养基调配

人血小板裂解物

人血小板裂解物(hPL)在已发表的干细胞文献中被广泛报告为相比于胎牛血清(FBS)对间充质谱系细胞(MLC)生长更有效的刺激物。在96孔板中进行的短期增殖测定中，对来自4个不同供应商的两个批次的hPL刺激三个不同批次的MLC(每个批次均源自不同供体)的增殖的能力进行筛选。基于此初步筛选，检查了来自单个供应商的另外七个批次的hPL在一个批次的MLC上的性能。结果表明MLC响应于hPL的浓度增加的剂量依赖性刺激在大约5体积/体积％时达到平稳。根据已发表的文献，在最佳hPL浓度下，增殖是相同测定中由10％ FBS诱导的增殖的多于2倍(数据未示出)。基于这些数据，使用hPL作为在密理博Mobius 50L CellReady生物反应器中的三次重复BioR运行中的FBS的替代物，所述生物反应器使用与先前运行中使用的相同的具有包括FBS的培养基的MLC库。这三次运行是使用Solohill胶原蛋白包被的微载体(胶原蛋白包被的聚苯乙烯微载体)进行的。

图1中示出了在补充有5体积/体积％和7.5体积/体积％的hPL的培养基中进行的运行。这些运行表明细胞增殖速率显著增加，其中在运行终止的那些天，MLC达到110亿(第7天)至247亿(第10天)的细胞数量。这三次运行在括号中规定的那些天产生了107亿个(第11天)、112亿个(第9天)和199亿个(第10天)MLC的峰数量。总的来说，这些数据表明培养基组成是确保用于制造MLC的高产率生物反应器(BioR)过程的关键。FBS显然是对MLC在密理博Mobius 50L SUB中在微载体上的生长的非常差的刺激，而hPL表示更有效的刺激，这与其在2-D中对MLC增殖的影响一致。

V2.2培养基

然而，在商业规模上使用hPL来制造MLC的一个重要担忧是足够数量的可用度。缺乏全面的供应链分析来评估可用于细胞疗法产物制造的供应。此外，hPL的批次大小目前很小，并且需要从多个供体汇集。最后，关于消除人类病原体传播的可能性所需的最适当的病原体耗竭策略，目前尚未达到共识。出于这些原因，开发了V2.2培养基。此培养基是不含动物组分的，并且含有用于MLC增殖的重组有丝分裂原的靶向组合。V2.2培养基包括补充有FGF2、PDGF和EGF以及用于细胞生长的其它所需物质的基础培养基。因此，V2.2培养基消除了供应约束和限制hPL的使用的安全问题。

再次用与先前实验中使用的相同的MLC细胞库进行了对V2.2的测试，以消除作为变量的MLC，并允许将数据与其它变化的变量进行交叉比较。再一次将细胞以6亿个接种在密理博Mobius 50L Cell Ready生物反应器中，所述生物反应器含有15g/L的Solohill胶原蛋白包被的微载体。如图2中所示，在3次重复运行中，V2.2支持非常稳健的MLC增殖，所述增殖在所有3次重复中在第8天迅速扩增达到峰密度，此时的峰细胞密度在152亿个细胞至177亿个细胞之间变化。此后，在接下来的24-48小时内，细胞数量出现了急剧且有问题的下降。

当使用主细胞库(MCB)MCB006与来自两个另外的供体MCB010和MCB020的MLC并行进行测试时，V2.2支持所有三种细胞的增殖。然而，对于测试的两个另外的供体，还观察到先前在MCB006达到峰细胞密度之后观察到的细胞数量的快速下降(图3)。

总之，V2.2表现出在密理博Mobius 50L CellReady生物反应器中当在胶原蛋白包被的微载体上生长时支持来自多个供体的MLC的稳健增殖的能力。然而，在每次运行中达到峰细胞密度后，细胞数量迅速下降。暴跌时对乳酸盐和铵水平的测量未表现出毒性水平，葡萄糖水平或重组细胞因子的水平也未限制。在试图通过增加大约在下降时介质交换的频率来防止细胞数量的这种暴跌的另外的运行中，未能防止暴跌。然而，如下文实例3中所示，通过改变微载体和生物反应器设计，实现了峰细胞密度的稳定平台期。

实例2：优化微载体的种子制备和接种

以下一组实验强调了使用V2.2培养基的BioR过程开发的其它组分，旨在优化微载体的接种和种子本身的制备。如上所述，使用6亿个细胞的种子在密理博Mobius50LCellReady生物反应器中在FBS、hPL和V2.2中直至此时进行了所有实验。为了确定用于将Solohill胶原蛋白包被的微载体接种在V2.2培养基中的最优接种密度，在康宁125mL旋转器烧瓶中进行了实验。

检查了接种细胞密度对第7天收获时回收的MLC最终数量的影响(数据未示出)。向含有100mL V2.2和15g/L的胶原蛋白包被的微载体的旋转器(一式三份)接种100,000个至2百万个MLC，这相当于1,000MLC/mL、2,000MLC/mL、5,000MLC/mL、8,000MLC/mL、10,000MLC/mL和20,000MLC/mL的接种密度。在终点收获的细胞的数量逐步增加至10万个至50万个接种的细胞，在约80万个细胞时达到平台期。基于这些数据，在所有随后的小规模和大规模的实验中，每mL接种的细胞的数量为10,000/mL。

如上提到的，每mL的最优种子密度被确定为在供体细胞库阶段为10,000MLC。对于40L BioR体积，这相当于4亿个细胞。为了确定在一个CF10细胞工厂中在V2.2培养基中由单个MCB小瓶的内容物可再现地产生此数量的细胞所需的最优培养基交换/收获时间，用来自两个不同供体的始终产生高或低产率的MCB进行了初步实验。将每个供体的单个小瓶的内容物接种到3个CF10细胞工厂中，并且进行以下V2.2培养基交换/收获时间方案，以鉴定哪些条件在收获时产生>4亿个细胞：

第3天培养基交换/第5天收获

第4天培养基交换/第6天收获

第3天和第5天培养基交换/第7天收获

B组(第4天培养基交换/第6天收获)(D4MX/D6H)呈现为由慢速且高产率的MCB产生此细胞数量所需的最低条件。然后在旋转器中对来自D4MX/D6H策略和来自其它两组的细胞进行测试，所述细胞以10,000/mL和20,000/mL接种在100mL 15g/l的V2.2+胶原蛋白包被的MC中。值得注意的是，培养基交换/收获方案似乎对MLC在旋转器中的产率没有影响，如图4所示。

图5中示出了此D4MX/D6H方案对来自8个不同供体的MCB的应用。除一个MCB外，其它所有MCB均为获得的4亿个细胞的最低目标数量。基于这些数据，对其余实例采用了D4MX/D6H方案来制备种子。

实例3：微载体选择和生物反应器设计

在先前的实例中，所有运行，无论是旋转器还是50L规模的运行，都是使用Solohill胶原蛋白包被的微载体进行的。使用这些聚苯乙烯载体的一个问题是需要在过程的下游加工阶段在运行结束时将这些载体去除。此外，需要使用15g/L，其相当于50L生物反应器中0.75kg，影响商品的成本。

鉴于MLC与胶原蛋白结合良好，对Cultispher-G微载体进行了评估。Cultispher-G微载体是由来自Percell Biolytica公司(Percell Biolytica)的猪胶原蛋白构成的大孔微载体。除了由这些载体提供的较大表面积之外，另一个优点是在运行结束时，这些载体可以简单地通过明胶的酶消化而被去除。在初步实验中，确定了2X最终浓度的TryPLE足以使载体完全溶解，并且此浓度和持续时间的消化对MLC的活力没有不利影响。

此外，还评估了另外的生物反应器平台，即艾本德公司制造的BioBLU系列容器。使用在旋转器和中间规模(BioBLU 3c)下的Cultispher-G微载体进行了一系列实验。图6中示出了代表性实验。将MCB019在含有Cultispher-G微载体(1g/L)或Solohill胶原蛋白包被的微载体(15g/L)的V2.2中以10,000/mL以全容器体积(2.5L)接种到一式三份BioBLU 3c容器中。在第4天和之后的每天，用新鲜的V2.2更换70％体积的培养基(分批过程)。Cultispher-G微载体和BioBLU容器的组合使MLC数量/mL稳定增加，在约第7天时达到稳定平台期，其中三次运行的峰数量为738,000/mL、637,000/mL和708,000/mL。相比之下，用Solohill载体进行的运行之一在第5天达到仅382,000/mL的峰细胞密度，之后是稳定平台期，而在第二运行中，细胞数量直至第9天逐渐增加(635,000/mL)，但在接下来的24小时内表现出数量显著下降至441,000/mL。这些数据表明，使用如Cultispher-G微载体等糖蛋白包被的微载体和/或BioBLU容器设计可以防止先前使用Solohill微载体于密理博Mobius BioR容器中的组合时看到的细胞数量急剧暴跌。使用BioBLU 3c的另外的实验的结果(数据未示出)进一步支持了这种印象，其证实了使用Cultispher-G微载体/BioBLU容器设计的组合与在达到峰细胞密度后细胞数量的稳定平台期的产生一致相关联，并且似乎消除了用Solohill微载体/密理博Mobius组合观察到的细胞数量的显著下降。

为了以全规模对这一假设进行测试，进行了3次运行，其中在BioBLU 50c容器(40L规模)中出于比较的目的使用与利用Solohill载体和Mobius 50L生物反应器的早期PD运行中的相同的MLC库MCB006对Cultispher-G(1g/L)载体进行了测试。这3次运行在V2.2中进行，并且将细胞以10,000/mL接种。通过分批过程进料，其中从运行的第4天开始直至其终止更换70％的培养基。

如图7所示，使用Cultispher-G微载体与BioBLU 50c的组合使所有3次重复运行中的细胞数量稳定指数式增加，在第7天达到峰值，平均值为191亿个细胞。最重要的是并且与BioBLU 3c规模的数据完全一致(图6)，在所有3次运行中直到第10天运行结束时细胞数量都处于稳定平台期，这与特征在于用密理博Mobius 50L/Solohill胶原蛋白包被的微载体组合进行的先前运行的细胞数量的急剧下降形成鲜明对比(图2和图3)。

最后，将完全合成的不含动物组分的可溶性微载体(DMC)调配物与Cultispher-G和Solohill胶原蛋白包被的聚苯乙烯微载体的那些调配物进行比较，以研究这些载体在旋转器规模下的性能。DMC调配物包含用不含异种的胶原蛋白或合成的柔性玻连蛋白基肽底物Synthemax包被的康宁DMC颗粒。对DMC调配物进行评估以解决这样的担忧，即如果用包括猪胶原蛋白的Cultispher-G微载体进行过程，尽管这些载体有明显的优势，但过程整体显然是不含动物蛋白的。

所有组均使用一式三份旋转器在V2.2中进行，并且将来自MCB MB006的细胞以10,000细胞/mL接种。培养基更换是通过分批过程进行的，在所述分批过程中从第4天到第7天更换70％的培养基。

在第7天收获时，MLC达到介于570,000/mL(Solohill)与730,000/mL(康宁DMC-Synthemax；Cultispher-G)之间的密度。胶原蛋白包被的康宁DMC和用合成玻连蛋白肽Synthemax包被的康宁DMC都表现出比使用Solohill载体获得的产率显著更高的产率。通过康宁DMC-胶原蛋白或康宁DMC-Synthemax调配物获得的产率与由Cultispher-G微载体支持的产率之间没有显著差异(图8)。在旋转器烧瓶中获得的产率与跨一系列不同细胞库的康宁DMC-Synthemax的比较证明了通常在MLC供体之间观察到的预期差异(图9)。重要的是，均表现出高水平的增殖。例如，440,000个细胞/mL的MCB019外推至在BioBLU 50c中在40L规模下约170亿个细胞，这是接近于在50c运行中用此cMLC细胞库实际获得的数字的值(参见图10)。基于康宁DMC-Synthemax在这些旋转器烧瓶培养中表现出的性能，接下来评估其在BioBLU 50c中的性能。

用于在BioBLU 50c中进行培养基更换的基于灌注的方法也得到了优化。此方法避免了分批进料过程的缺点，并且与分批过程一样，从第3天开始每24小时更换容器中70％的体积(数据未示出)。

用于使用康宁DMC-Synthemax在运行结束时收获细胞的方案也得到优化，并且包含康宁推荐的用于微载体溶解的方案以及短暂使用TryPLE来破坏细胞与细胞的接触。将所产生的细胞悬浮液收集到袋(Flex Concepts)中，并且传递到kSep 400中以在产物冷冻保存之前进行洗涤和浓缩。进行了七次运行，所述运行结合了基于灌注的培养基交换策略和下游收获方法连同kSep洗涤和浓缩步骤。运行是用单个MCB(MCB019)进行的。在4次运行中维持了溶解氧(DO)，而在其余3次运行中未对其进行控制。种子如上所述制备，以10,000个细胞/mL接种到含有1g/L康宁Synthemax DMC的40L V2.2培养基中。每日测量分析物和细胞计数。在第7天进行1L收获，并且在第8天完全收获其余细胞。

图10展示了在BioBLU 50c中在康宁DMC-Synthemax上在40L规模下获得的MLC的高度可再现产率。在14.3+0.9亿的平均值下，在不存在DO对照的情况下的产率与在1.56+0.86下在有DO对照的情况下获得的产率没有显著差异(p＝0.176)。

鉴于以上，注意到如康宁DMC-Synthemax等糖蛋白包被的颗粒和BioBLU生物反应器的使用本身是出乎意料地有利的，特别是在培养达到峰细胞密度后中止细胞数量的快速下降方面。因此，这些数据支持在MLPSC的3D培养中使用利用如Synthemax等粘连蛋白肽包被的微载体。

上述实例还将艾本德BioBLU 50c生物反应器、康宁DMC-Synthemax微粒和V2.2培养基的组合鉴定为不含动物组分的BioR过程，所述过程支持在第7天可再现地高水平的MLC产率。

实例4：在V2.2/2-D缩减规模过程中产生的MSC产物的扩展表征

为了研究如上概述的增殖的MLC是否表现出适当的同一性、纯度和效力标志物，将从每次运行中收获的细胞冷冻保存，并且在解冻后进行一系列全面的生物分析，以确定对细胞的关键质量属性(CQA)的任何影响。扩展表征分析包含解冻后活力和恢复、细胞大小、增殖能力、同一性、纯度、细胞因子分泌和通过抑制T细胞增殖的能力测量的免疫调节潜力。

解冻后活力和恢复

根据RD.SOP.04.06对来自7个测试样品中的每个测试样品的冷冻保存的MLC解冻，并且根据PR-031中所述的方法通过台盼蓝排除法(Trypan Blue exclusion)测量立即解冻后的活力。解冻后活力在范围介于96％与97％之间的所有样品之间极其一致，无显著差异+DO调节(图11)。

解冻后MSC直径

使用已知大小的微珠作为参考标准品，通过流式细胞术对8个冷冻保存的测试物品中的每个测试物品在解冻后在悬浮液中的MLC大小。微珠大小是由制造商使用扫描电子显微术和美国国家标准与技术研究所(National Institute of Standards andTechnology，NIST)可追溯颗粒确定的。将来自Spherotec公司(Spherotec)的微珠用作以下细胞直径的参考物：2μm、3μm、5μm、7μm、10μm和14.5μm，而将来自Bangs实验室(BangsLaboratories)的微珠用于20μm、25μm、30μm和更大的细胞大小。通过绘制微珠大小对其通过流式细胞术确定的前向散射(FS)信号(线性或对数峰最大值，FS中值)，由一系列参考标准品(通常跨越5-30μm)生成标准曲线。因此，使用样品的FS中值由标准曲线确定ceMSC测试样品的大小。测试是在新鲜解冻的样品上进行的。如图12所示，在BioBLU 50c中在V2.2中在康宁DMC-Synthemax载体上产生的所有7个测试物品均表现出非常相似的细胞直径，范围为21μm(运行#8)至24.8μm。在不存在DO对照的情况下产生的那些测试物品表现出22.6+1.63μm的平均细胞直径，而在有DO对照的情况下产生的那些测试物品表现出22.6±0.36μm的平均直径(p＝0.477)。

解冻后增殖能力

对来自冷冻保存的MLC在解冻后在培养中的增殖动力学的分析提供了对MSC功能的定量测量，而非对细胞活力的即时测量。将在生物反应器运行中产生的MLC的7个批次中的每个批次一式三份以每孔2,000个细胞接种在96孔板中的血清补充的生长培养基中。将扩增至传代5并接种在含10％胎牛血清(FBS)的最小必需培养基α(αMEM)中的间充质谱系细胞(MLC)批次用作适合性对照。此适合性对照可靠地展示了在此测定中峰增殖活性；因此，其在每次实验运行中的活性用于表示测试程序中使用的基本试剂、材料和装备的适合性。此外，作为阴性对照，将包含适合性对照的每个样品接种在不含血清的(基础)培养基中。将培养在装配到设置为5％CO

对MLC的同一性和纯度的流式细胞术分析

将新鲜解冻的测试样品与针对人CD146、STRO-4(作为MLC同一性的标志物)的单克隆抗体和针对CD45、CD31、CD80、CD86和HLA-DR(作为MLC纯度的标志物)的抗体以及非结合性同种型匹配的阴性对照抗体一起温育。所使用的抗体直接与荧光染料R-藻红蛋白(PE)缀合。将DAPI用来区分活细胞与死细胞。对于纯度标志物(CD80CD86，HLA-DR)中的每种纯度标志物，将阳性对照细胞系与ceMSC样品平行运行，以确证实测定的系统适合性。通过流式细胞术分析样品。在通过DAPI染色排除基于光散射特性的碎屑和死细胞后，通过比较抗体染色的样品与其同种型阴性对照的荧光确定了每种标志物的表达水平。图15示出了这些分析的结果。来自7次BioR运行的所有测试物品均表达水平>86.8％的纯度标志物CD146，以及介于96％与99.9％之间和介于99.76％与99.9％之间的STRO-4。对于所分析的5个纯度标志物中的每个纯度标志物，染色在任一个样品中不超过1.3％，并且大多数低于1％。

实例5：MLC的功能活性

MLC在一系列治疗适应症中的多模式机制下的关键属性是其分泌多种旁分泌活性的能力，这些活性共同介导细胞的修复功能和免疫调节功能。检查了七个批次的MLC对几种促血管生成因子的分泌，作为MLC通过促进新血管发育刺激组织修复的作用的量度。作为其免疫调节特性的量度，还评估了细胞抑制T细胞增殖的能力。

SDF-1α

间充质谱系细胞分泌稳健水平的多种生长因子，这些生长因子在新血管的形成中发挥因果作用已得到充分证明。这些生长因子包含SDF-1α、VEGF-A和血管生成素-1(ANGPT1)。解冻后，将各种测试物品以相等的活细胞密度接种在培养中，并且使其在不含血清的条件下产生条件培养基。收集条件培养基后，通过ELISA(R&D系统公司(R&D Systems))对所关注的蛋白质中的每种蛋白质进行定量。

条件培养基中的SDF-1α水平在7个MLC测试物品批次之间有所不同，范围为大约3198pg/mL至6022pg/mL(平均值为4246+802pg/mL)(图16)。在分别为4069+203pg/mL和4379+1027pg/mL下，在不存在与存在DO维持的情况下分泌的SDF-1α的平均水平没有显著差异(p＝0.34)。

还对SDF-1α在用于SDF-1α浓度的ELISA测量的相同测试物品条件培养基样品中的生物活性进行了测量。对于SDF-1α生物测定，将表达高水平的CXCR4的细胞系(U937)接种到跨孔插入物中，并将不含血清的MLC条件培养基置于24孔板的下孔中。允许细胞迁移到MLC条件培养基或重组人SDF-1α中持续3小时。将未进行调理且不含可测量水平的SDF-1α的不含血清基的础培养基用作阴性对照，并且将3ng/ml的重组人SDF-1α用作系统适合性测定对照。在指定的3小时时间点之后，将已迁移至底室的细胞收集并与CountBright绝对计数珠(英杰公司，C36950)混合，并且使用流式细胞术针对添加到每个管的计数珠的标准数量来对迁移的细胞的数量进行定量。

图17示出了来自迁移测定的数据。U937细胞迁移至MLC条件培养基的各个样品的观察到的水平非常接近地反映了在对应样品中通过ELISA测量的SDF-1α的水平。跨所有7个样品(70,610+9067个细胞)观察到的迁移的平均水平接近于在2-D/FBS方法中制造的用作这些测定的适合性对照的MLC的水平。

VEGF-A

通过ELISA类似地测量了条件培养基样品中的VEGF的水平。除了一个离群值，即分泌VEGF的运行#9的水平为4204pg/mL之外，由其余6次运行中产生的MLC分泌的VEGF的水平与平均值2290+148pg/mL非常一致(图18)。

ANGPT1

条件培养基中的ANGPT1的水平显示出运行与运行之间的中度变化，其中跨所有7次运行的分泌的平均水平为4269+672pg/mL(图19)。对于在不存在DO对照的情况下进行的3次运行，ANGPT水平显示出最小变化(平均值为3794+187pg/mL)，但是在有DO对照的情况下进行的运行，水平稍微更易变(4625+684)，但是尽管存在这些差异，在不存在DO维持对存在DO维持的情况下分泌的ANGPT1的平均水平没有显著差异(p＝0.073；p<0.05时不显著)。

实例6：免疫调节活性

评估在七次生物反应器运行中的每次生物反应器运行中产生的MLC抑制活化T细胞增殖的能力，作为其免疫抑制能力和细胞质量的直接量度。简而言之，对于此测定，将PBMC用CD3和CD28抗体进行刺激并且与MLC以不同比率(1:5、1:10和1:20)共培养，并且通过EdU掺入和多色流式细胞术测量活化T细胞增殖。此测定的对照包含单独的未经刺激的PBMC、单独的经刺激的PBMC以及如上所述在FBS中制造的MLC批次(适合性对照)。

如图20所示，在BioBLU 50c生物反应器中在康宁DMC-Synthemax上在V2.2中产生的7/7MLC测试物品在1:10比率下表现出非常强的抑制T细胞增殖的能力，其中3/7抑制>90％的增殖，这是非常接近于抑制到92％的水平的适合性对照的水平的水平。对于其余四个BioR产生的样品，达到的抑制的水平仍然非常高，并且范围为73％–88％。

实例7：总结

图21示出了生物反应器过程的示意图，其表示本公开中概述的工作的终点。开始于单个小瓶的主细胞库(MCB)，将其转移到单个CF10细胞工厂，并且用于在上述条件下在6天内产生所需的4亿个种子。然后将收获的种子转移到含有40L V2.2和1g/L的康宁DMC-Synthemax的BioBLU 50c中。MLC在血管中生长另外7天(总活动时间为13天)，其中在第3天开始通过灌注更换培养基，每24小时更换V2.2的70％体积。每次BioBLU 50c运行使用总计160L V2.2培养基。细胞的收获发生在容器中，并且随后载体沉降并去除35L用过的培养基。这之后添加EDTA和果胶酶(用于使康宁DMC-Synthemax溶解)和2xTrypLE持续30分钟，之后通过蠕动泵通过袋(FlexConcepts)将容器的内容物转移到kSep400以进行洗涤和浓缩。将经洗涤和经浓缩的产物进行填料、精加工和目视检查，之后冷冻保存。