一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂

本申请是申请日为2020年12月22日、申请号2020115303638，发明名称为“一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，具体地，涉及一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂。

背景技术

我国是家禽养殖大国，每年家禽产品的产量居世界前列，现统计得到，2018年禽蛋产量和禽肉产量分别位居世界第一和第二。而且我国家禽地方品种资源丰富，但地方品种的繁殖力较低下，农民投入增加，产出减少，这造成了地方品种资源流失问题。广东省粤西地区具有多种家禽地方品种，其中雷州黑鸭就是主要分布在雷州半岛的地方品种，其属于蛋肉兼用型黑羽鸭，体格小，肉质鲜美，具有高产蛋率，耐粗饲、抗病力强和环境适应力强等优点，广受当地人民的喜欢，但目前其相关研究较少。有研究使用产蛋曲线拟合的方法得出雷州黑鸭产蛋高峰期为27周龄至41周龄，而且高峰期产蛋率在90％以上；雷州黑鸭蛋重高于其他地方品种，如缙云麻鸭、淮南麻鸭、连成白鸭、攸县麻鸭等；雷州黑鸭肉用和蛋用价值丰富，富含多种微量元素，尤其是人体所需的Fe元素，营养含量高。

中国专利201810410892.0一种与蛋鸭产蛋性能相关的分子标记及其在育种中的应用，公开了一个与鸭开产日龄、34周龄产蛋量及72周龄产蛋量存在显著相关分子标记。但是由于产蛋性状是数量性状，数量性状通常受多个基因控常受多基因控制，更多影响相关性状的分子标记的发现能更准确的对产蛋性状进行判断。

组氨酸解氨酶(Histidine Ammonia-Lyase,HAL)也称组氨酸酶(Histidase)或组氨酸脱氨酶，是属于碳氮裂解酶家族的一员，催化组氨酸分解代谢的第一反应，即催化组氨酸脱氨生成尿刊酸。先前的研究表明HAL基因的突变与组氨酸血症、非黑色素瘤皮肤癌的风险以及冠心病发病率有关。HAL基因在产蛋性能方面的作用尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂。

本发明的第一个目的是提供一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂。

本发明的第二个目的是提供所述试剂在制备评价雷州黑鸭产蛋性能试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述试剂在评价雷州黑鸭产蛋性能中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种评价雷州黑鸭产蛋性能的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供所述试剂、或所述的试剂盒中的一种或两种在评价雷州黑鸭产蛋性能中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明发现雷州鸭HAL基因内含子1和2中的7个SNP位点，分别是SNP位点1、SNP位点2、SNP位点3、SNP位点4、SNP位点5、SNP位点6和/或SNP位点7：

其中，SNP位点1位于第一内含子的第288个碱基处C突变成T(I1-288C>T)，CC基因型的样本的开产体重显著高于TT基因型的样本，而CC基因型的样本的300d产蛋数则显著低于TT基因型的样本；

SNP位点2位于第一内含子的第373个碱基处T突变成G(I1-373T>G)，TT基因型的样本的300d产蛋数显著高于GG型基因型的样本；

SNP位点3位于第一内含子的第438个碱基处A突变成G(I1-438A>G)，AA基因型的样本的开产日龄极显著低于AG基因型的样本；

SNP位点4位于第二内含子的第16个碱基处C突变成A(I2-16C>A)，AA基因型的样本的开产日龄显著低于AC基因型的样本；

SNP位点5位于第二内含子的第123个碱基处A突变成T(I2-123A>T)，TT基因型的样本的开产日龄显著低于AT基因型的样本，TT基因型的样本的300d产蛋数则显著高于AT基因型的样本；

SNP位点6位于第二内含子的第141个碱基处G突变成A(I2-141G>A)，AA基因型的样本的开产日龄显著低于GG基因型的样本，AG基因型的样本的开产体重则极显著高于GG型基因型的样本，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG基因型的样本；

SNP位点7位于第二内含子的第168个碱基处A突变成G(I2-168A>G)，GG基因型的样本的开产日龄极显著低于AA型，AG基因型的样本的开产体重则显著高于GG型，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG型。

进一步发现，SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产日龄显著高于SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体，和SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体；

SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体和所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产体重显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体；

SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体的300d产蛋数显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体。

因此，SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体可作为雷州黑鸭群体筛选低开产日龄、低开产体重、高产蛋量个体的最优选择。

因此，本发明要求保护一种检测与雷州黑鸭产蛋性状具有相关性的SNP位点的基因型的试剂，所述试剂用于检测SNP位点1、SNP位点2、SNP位点3、SNP位点4、SNP位点5、SNP位点6和/或SNP位点7的基因型；

所述SNP位点1位于HAL基因第一内含子的第288个碱基处，CC基因型的样本的开产体重显著高于TT基因型的样本，而CC基因型的样本的300d产蛋数则显著低于TT基因型的样本；

所述SNP位点2位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，TT基因型的样本的300d产蛋数显著高于GG型基因型的样本；

所述SNP位点3位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，AA基因型的样本的开产日龄极显著低于AG基因型的样本；

所述SNP位点4位于HAL基因第二内含子的第16个碱基处，AA基因型的样本的开产日龄显著低于AC基因型的样本；

所述SNP位点5位于HAL基因第二内含子的第123个碱基处，TT基因型的样本的开产日龄显著低于AT基因型的样本，TT基因型的样本的300d产蛋数则显著高于AT基因型的样本；

所述SNP位点6位于HAL基因第二内含子的第141个碱基处，AA基因型的样本的开产日龄显著低于GG基因型的样本，AG基因型的样本的开产体重则极显著高于GG型基因型的样本，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG基因型的样本；

所述SNP位点7位于HAL基因第二内含子的第168个碱基处，GG基因型的样本的开产日龄极显著低于AA型，AG基因型的样本的开产体重则显著高于GG型，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG型。

优选地，检测SNP位点3、SNP位点4、SNP位点5和SNP位点6。

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产日龄显著高于SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体，和SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体；

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体和所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产体重显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体；

所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体的300d产蛋数显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体。

更优选地，所述试剂为引物。

进一步更优选地，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

SEQ ID NO.1：5’-GAATGGCACCTGAGTTAGCA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CCTGTTCTGGTTCTCGGTATTTGCT-3’。

本发明还要求保护任一所述试剂在制备评价雷州黑鸭产蛋性能试剂盒中的应用。

本发明还要求保护任一所述试剂在评价雷州黑鸭产蛋性能中的应用。

进一步，本发明还要求保护一种评价雷州黑鸭产蛋性能，包括所述的试剂。

优选地，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物。

最优选地，一种评价雷州黑鸭产蛋性能的试剂盒，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物、2×Green Taq Mix；

使用方法如下：

1、提取样本DNA；

2、PCR扩增

PCR反应体系20μL：2×Green Taq Mix 10μL，上/下游引物(核苷酸序列如SEQ INNO.1～2所示)各0.4μL，模板1μL，ddH

PCR反应程序：95℃热变性5min，95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

3、PCR产物测序

1％琼脂糖凝胶进行电泳、回收、送测序公司测序；

结果判读：

SNP位点1位于HAL基因第一内含子的第288个碱基处，即扩增产物5’端的250个碱基处，存在C/T单核苷酸多态；

SNP位点2位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，即扩增产物5’端的335个碱基处，存在T/G单核苷酸多态；

SNP位点3位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，即扩增产物5’端的410个碱基处，存在A/G单核苷酸多态；

SNP位点4位于HAL基因第二内含子的第16个碱基处，即扩增产物5’端的489个碱基处，存在C/A单核苷酸多态；

SNP位点5位于HAL基因第二内含子的第123个碱基处，即扩增产物5’端的596个碱基处，存在A/T单核苷酸多态；

SNP位点6位于HAL基因第二内含子的第141个碱基处，即扩增产物5’端的614个碱基处，存在G/A单核苷酸多态；

SNP位点7位于HAL基因第二内含子的第168个碱基处，即扩增产物5’端的641个碱基处，存在A/G单核苷酸多态。

所述SNP位点1，CC基因型的样本的开产体重显著高于TT基因型的样本，而CC基因型的样本的300d产蛋数则显著低于TT基因型的样本；

所述SNP位点2，TT基因型的样本的300d产蛋数显著高于GG型基因型的样本；

所述SNP位点3，AA基因型的样本的开产日龄极显著低于AG基因型的样本；

所述SNP位点4，AA基因型的样本的开产日龄显著低于AC基因型的样本；

所述SNP位点5，TT基因型的样本的开产日龄显著低于AT基因型的样本，TT基因型的样本的300d产蛋数则显著高于AT基因型的样本；

所述SNP位点6，AA基因型的样本的开产日龄显著低于GG基因型的样本，AG基因型的样本的开产体重则极显著高于GG型基因型的样本，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG基因型的样本；

所述SNP位点7，GG基因型的样本的开产日龄极显著低于AA型，AG基因型的样本的开产体重则显著高于GG型，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG型。

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产日龄显著高于SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体，和SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体；

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体和所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产体重显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体；

所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体的300d产蛋数显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体。

所述试剂、或所述评价雷州黑鸭产蛋性能中的一种或两种在评价雷州黑鸭产蛋性能中的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现雷州鸭HAL基因的7个SNP位点，其基因型与产蛋性状均显著相关，尤其是SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体可作为雷州黑鸭群体筛选低开产日龄、低开产体重、高产蛋量个体的最优选择。这为雷州黑鸭分子标记辅助育种及建立优势高产群体提供了理论基础。

附图说明

图1为雷州鸭HAL基因扩增产物电泳图；1～4泳道分别为不同个体的PCR扩增产物。

图2为HAL基因SNP位点1的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为CT的个体；图Ⅱ是基因型为CC的个体；图Ⅲ是基因型为TT的个体。

图3为HAL基因SNP位点2的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为TG的个体；图Ⅱ是基因型为GG的个体；图Ⅲ是基因型为TT的个体。

图4为HAL基因SNP位点3的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为AG的个体；图Ⅱ是基因型为AA的个体；图Ⅲ是基因型为GG的个体。

图5为HAL基因SNP位点4的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为CA的个体；图Ⅱ是基因型为CC的个体；图Ⅲ是基因型为AA的个体

图6为HAL基因SNP位点5的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为AT的个体；图Ⅱ是基因型为TT的个体；图Ⅲ是基因型为AA的个体。

图7为HAL基因SNP位点6的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为GA的个体；图Ⅱ是基因型为AA的个体；图Ⅲ是基因型为GG的个体。

图8为HAL基因SNP位点7的3种基因型的测序图谱；图Ⅰ是基因型为AG的个体；图Ⅱ是基因型为AA的个体；图Ⅲ是基因型为GG的个体。

图9为HAL基因的奶牛群体SNPs位点连锁反应。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

主要试剂：全基因组血液DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，购自博格林生物有限公司。

主要仪器：PCR仪购自杭州朗基科学仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统；天美电子天平分析天平FA1204B购自上海精科。

实施例1DNA混池构建PCR扩增

1、实验方法

(1)试验动物

本试验选取来自于湛江市某养殖场的F4代雷州黑鸭基础群。取300d雷州黑鸭93只，颈静脉采血2mL，用肝素抗凝管收集后，并置于-20℃保存备用以提取血液基因组DNA。

(2)血液基因组DNA提取

采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，步骤参照试剂盒说明书，使用浓度分析仪检测DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。

(3)DNA混池构建

随机选择30～40个DNA样品进行等量混合，制备成DNA混池样品。

(4)引物设计

根据Ensemble数据库提供的HAL基因组序列(编号：(ENSAPLG00000003775.2)，使用Primer 5.0软件进行HAL基因的引物设计，引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成：

上游引物：5’-GAATGGCACCTGAGTTAGCA-3’(SEQ IN NO.1)；

下游引物：5’-CCTGTTCTGGTTCTCGGTATTTGCT-3’(SEQ IN NO.2)。

(5)目的基因PCR扩增及验证

PCR反应体系20μL：2×Green Taq Mix 10μL，上/下游引物(核苷酸序列如SEQ INNO.1～2所示)各0.4μL，模板1μL，ddH

PCR反应程序：95℃热变性5min，95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

1％琼脂糖凝胶进行电泳验证后，送至上海生工生物有限公司测序。

2、实验结果

PCR扩增雷州黑鸭HAL基因产物经1％凝胶电泳检测，结果如图1所示，PCR产物扩增特异性良好，无杂带，条带清晰，可直接用于测序鉴定。

HAL基因内含子1和2中发现了7个SNP位点，其中，SNP位点1、SNP位点2和SNP位点3均位于HAL基因内含子1，SNP位点4、SNP位点5、SNP位点6和SNP位点7均位于HAL基因内含子2，7个SNPs的每种基因型测序结果如图2到图8所示，

具体地，SNP位点1位于扩增产物5’端的250个碱基处，存在C/T单核苷酸多态；

SNP位点2位于扩增产物5’端的335个碱基处，存在T/G单核苷酸多态；

SNP位点3位于扩增产物5’端的410个碱基处，存在A/G单核苷酸多态；

SNP位点4位于扩增产物5’端的489个碱基处，存在C/A单核苷酸多态；

SNP位点5位于扩增产物5’端的596个碱基处，存在A/T单核苷酸多态；

SNP位点6位于扩增产物5’端的614个碱基处，存在G/A单核苷酸多态；

SNP位点7位于扩增产物5’端的641个碱基处，存在A/G单核苷酸多态。

实施例2HAL基因7个SNP位点的群体遗传特性分析

1、实验方法

利用SeqMan软件进行序列比对，统计每一个个体的SNP位点和基因型，并计算每个SNP位点的等位基因的基因频率、基因型频率、遗传杂合度(H)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)和卡方检验值χ

2、实验结果

结果如表1所示，在SNP位点1到SNP位点7中优势基因型分别是CT、TG、AA、CC、AT、GA和AG，优势等位基因分别为C、T、A、C、T、A和G，其频率均大于0.50；7个SNPs的基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)均处在0.25～0.5范围内，这表明为该群体多态性属于中度多态性，χ2检验说明，7个SNP在该雷州黑鸭群体中均处于哈代温伯格平衡(P>0.05)。

表1HAL基因7个SNPs的群体遗传特性

实施例3HAL基因SNPs与雷州黑鸭产蛋性能的相关性分析

1、实验方法

利用SPSS 22.0软件的单因素方差中的多重比较分析对雷州黑鸭的产蛋性状和基因型与单倍型之间的关联进行差异显著性检验，结果以“平均数±标准误”表示，当P<0.05时表示差异显著，P<0.01时表示差异极显著。

2、实验结果

结果见表2所示。因此可知，SNP位点1的CC基因型的个体的开产体重显著高于TT型基因型的个体，而CC基因型的个体的300d产蛋数则显著低于TT基因型的个体(P<0.05)；在SNP位点2的TT基因型的个体的300d产蛋数相对GG基因型的个体显著升高(P<0.05)；SNP位点3的AA基因型的个体的开产日龄极显著低于AG基因型的个体(P<0.01)；SNP位点4的AA型的开产日龄显著低于AC基因型的个体(P<0.01)；同样，在SNP位点5的TT基因型的个体的开产日龄相对AT基因型的个体显著降低，而TT基因型的个体的300d产蛋数则显著高于AT基因型的个体(P<0.05)；SNP位点6的AA基因型的个体的开产日龄显著低于GG基因型的个体(P<0.05)，AG基因型的个体的开产体重则极显著高于GG基因型的个体(P<0.01)，而AG基因型的个体的300d产蛋数显著低于GG基因型的个体(P<0.05)；同样，在SNP位点7的GG基因型的个体的开产日龄极显著低于AA基因型的个体(P<0.01)，AG基因型的个体的开产体重则显著高于GG基因型的个体(P<0.05)，而AG基因型的个体的300d产蛋数显著低于GG型(P<0.05)。7个SNPs均与开产蛋重无显著影响(P>0.05)。

表2HAL基因7个SNPs与雷州鸭产蛋性能相关性分析

由以上结果可见，除SNP位点1和SNP位点2外，其余SNPs位点均与雷州黑鸭开产日龄显著相关，推测其余5个SNPs位点能作为雷州黑鸭开产日龄性状的分子标记位点；SNP位点1、SNP位点6和SNP位点7，这3个位点均与雷州黑鸭开产体重显著相关，这说明这3个SNPs可能对提高开产体重有重要指导作用；除了SNP位点3和SNP位点4外，其余位点均与雷州黑鸭300d产蛋量显著关联，这表明其余位点可作为提高雷州黑鸭产蛋量的重要标记。

实施例4 7个SNP位点与雷州鸭产蛋性能相关性分析

1、实验方法

使用HaploView 4.2软件对7个SNP位点进行连锁分析。

2、实验结果

结果见图9和表3所示，结果发现SNP位点3、SNP位点4、SNP位点5、SNP位点6这4个位点存在强连锁遗传，4个位点构成了一个结构域，共有10种不同的单倍型，其中只有7种单倍型有生物学统计意义(个体数大于3)分别为H1H1(AA-CC-TT-AA)、H1H2(AG-CA-TA-AG)、H1H3(AA-CC-TA-AG)、H1H4(AA-CC-TT-AG)、H2H2(GG-AA-AA-GG)、H2H3(AG-CA-AA-GG)、H3H4(AA-CC-TA-GG)。

使用SPSS 22.0单因素方差分析7种单倍型与雷州黑鸭产蛋性能的相关性，结果见表4所示。由此可知，H1H2单倍型的开产日龄显著高于H1H1、H1H3单倍型(P<0.05)；H1H2和H1H4单倍型的开产体重显著高于H1H1单倍型(P<0.05)；而H1H1单倍型的300d产蛋数显著高于H1H3单倍型(P<0.05)。其余单倍型与雷州黑鸭产蛋性能均无显著差异(P>0.05)。

表3HAL基因单倍型频率

表4HAL基因单倍型与雷州鸭产蛋性能相关性分析

注：同列同一指标中标有字母完全不同者表示差异显著(P<0.05)；未标字母者表示差异不显著(P>0.05)。

实施例5一种评价雷州黑鸭产蛋性能的试剂盒

一、组成

核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示引物、2×Green Taq Mix。

二、使用方法

1、提取样本DNA；

2、PCR扩增

PCR反应体系20μL：2×Green Taq Mix 10μL，上/下游引物(核苷酸序列如SEQ INNO.1～2所示)各0.4μL，模板1μL，ddH

PCR反应程序：95℃热变性5min，95℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

3、PCR产物测序

1％琼脂糖凝胶进行电泳、回收、送测序公司测序。

三、结果判读

SNP位点1位于HAL基因第一内含子的第288个碱基处，即扩增产物5’端的250个碱基处，存在C/T单核苷酸多态；

SNP位点2位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，即扩增产物5’端的335个碱基处，存在T/G单核苷酸多态；

SNP位点3位于HAL基因第一内含子的第438个碱基处，即扩增产物5’端的410个碱基处，存在A/G单核苷酸多态；

SNP位点4位于HAL基因第二内含子的第16个碱基处，即扩增产物5’端的489个碱基处，存在C/A单核苷酸多态；

SNP位点5位于HAL基因第二内含子的第123个碱基处，即扩增产物5’端的596个碱基处，存在A/T单核苷酸多态；

SNP位点6位于HAL基因第二内含子的第141个碱基处，即扩增产物5’端的614个碱基处，存在G/A单核苷酸多态；

SNP位点7位于HAL基因第二内含子的第168个碱基处，即扩增产物5’端的641个碱基处，存在A/G单核苷酸多态。

所述SNP位点1，CC基因型的样本的开产体重显著高于TT基因型的样本，而CC基因型的样本的300d产蛋数则显著低于TT基因型的样本；

所述SNP位点2，TT基因型的样本的300d产蛋数显著高于GG型基因型的样本；

所述SNP位点3，AA基因型的样本的开产日龄极显著低于AG基因型的样本；

所述SNP位点4，AA基因型的样本的开产日龄显著低于AC基因型的样本；

所述SNP位点5，TT基因型的样本的开产日龄显著低于AT基因型的样本，TT基因型的样本的300d产蛋数则显著高于AT基因型的样本；

所述SNP位点6，AA基因型的样本的开产日龄显著低于GG基因型的样本，AG基因型的样本的开产体重则极显著高于GG型基因型的样本，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG基因型的样本；

所述SNP位点7，GG基因型的样本的开产日龄极显著低于AA型，AG基因型的样本的开产体重则显著高于GG型，AG基因型的样本的300d产蛋数显著低于GG型。

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产日龄显著高于SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体，和SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体；

所述SNP位点3的基因型为AG、SNP位点4的基因型为CA、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体和所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AG的个体开产体重显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体；

所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TT，且SNP位点6的基因型为AA的个体的300d产蛋数显著高于所述SNP位点3的基因型为AA、SNP位点4的基因型为CC、SNP位点5的基因型为TA，且SNP位点6的基因型为AG的个体。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。