检测不同程度认知障碍标志物丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断认知障碍产品中的应用

技术领域

本发明涉及微生物和基因工程技术领域，具体而言，涉及检测不同程度认知障碍标志物丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断认知障碍产品中的应用。

背景技术

认知功能由学习、记忆、计算、时间和空间定向、执行能力、语言理解和表达应用等多个认知域构成，认知功能障碍泛指各种原因导致的不同程度的认知功能损害，神经认知障碍(Neurocognitive Disorders,NCDs)涵盖了不同病因导致的认知水平下降的一系列认知障碍。最新的国际诊疗指南根据认知障碍严重程度和疾病进展，将神经认知障碍分为重度神经认知障碍(Major NCD)和轻度神经认知障碍(Mild NCD)。

其中，重度NCD是以大脑实质性病变导致认知功能下降为主要特征的疾病，阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是其中典型代表；轻度NCD主要指与年龄相关的认知下降。轻度NCD和重度NCD世界范围内患病率分别约为10％-20％和5％-7％，在65岁或65岁以上的人群中，至少有10％会出现认知障碍，随着年龄的增长，其发生率呈指数增长。在轻度NCD中，认知能力下降，但变化不足以显著影响个人的日常生活活动，但35％的轻度NCD患者在3年内进展为重度NCD。尽管并非所有重度NCD患者最终都会转变为AD，但其风险更大。因此，早期发现和干预NCD对于推迟向AD的转变，减少患者面临的痛苦以及家庭和社会的负担至关重要。

肠道内的微生物群、肠道和大脑之间广泛的通讯网络——微生物群-肠-脑轴(Microbiota-gut-brain axis,MGBA)受到越来越多的关注，微生物群的多样性对于大脑结构、发育和功能至关重要。微生物群和大脑通过不同的途径进行交流，例如迷走神经支配、微生物代谢物和微生物衍生的神经递质(γ-氨基丁酸、5-羟色胺、儿茶酚胺和乙酰胆碱)。此外，研究表明全身炎症状态与肠道菌群之间存在关联，菌群失调会使肠道通透性增加，外周促炎细胞因子升高、肠道中的慢性炎症及炎症介质的全身释放，导致神经炎症和神经元细胞丢失。在衰老过程中，微生物群发生变化，病原菌增加而有益菌被破坏，肠道菌群多样性降低，菌群失调导致慢性炎症，与脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophicfactor,BDNF)有关的细菌代谢物如短链脂肪酸合成减少。肠道菌群的组成比例发生改变，同样与神经系统的疾病发生有关。年龄与肠道菌群相关性的研究显示，随着年龄增加，肠道菌群的分布会逐渐由非致病菌转为致病性的兼性厌氧菌。

目前，关于肠道菌群与不同程度神经认知障碍患者的关系的研究未见相关报道。除年龄和心脑血管疾病两个危险因素外，神经认知障碍的发生可能还与生活方式、疾病史、用药情况、家族史等因素有关，肠道菌群在神经认知障碍发生发展过程中的作用并不明确。探究肠道菌群在神经认知障碍发生发展过程中的作用机制，寻找可用来进行神经认知障碍早期诊断的微生物标志物具有重要的意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于针对现有神经认知障碍标志物应用存在的缺陷，血液、脑脊液检测具有侵入性，神经影像检查价格昂贵。从肠道菌群角度提供一种不同程度神经认知障碍标志物的检测方法，为神经认知障碍的辅助诊断与疗效监测提供参考。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于检测重度认知障碍标志物丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断认知障碍产品中的应用，重度认知障碍标志物以肠道菌群为标志物，肠道菌群选自肠厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)和盐单胞菌属(Halomonas)中的至少一种。、

本发明首次发现，上述特定菌群在重度认知障碍中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现神经认知障碍的诊断或辅助诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断，操作简单、特异性高、敏感性强。

在本发明的方案中，在将以上肠道菌群用于重度认知障碍标志物时，实施该用途时，通过直接检测上述菌属即可实现是否重度认知障碍的结果判断，而并非一定能要检测到具体的微生物种才能实现相关的结果判断。

上述丰度即为微生物丰度(Microbial community abundance)，是指微生物的群落结构与多样性。可以直接反映某个生态位中不同微生物所占的比例。

在一种可选的实施方式中，肠道菌群选自宠大厌氧棒状菌(Anaerostipeshadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)和肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)中的至少一种。ROC曲线上，这四种菌种的AUC值均高于0.7，具有较高的特异性和敏感性，应用于预测重度神经认知障碍具有较高的准确性。

在一种可选的实施方式中，肠道菌群选自宠大厌氧棒状菌(Anaerostipeshadrus)，该菌群为最主要的致病菌种。

第二方面，本发明还提供了一种用于检测轻度认知障碍标志物丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断认知障碍产品中的应用，轻度认知障碍标志物以肠道菌群为标志物，肠道菌群选自肠月形单胞菌科(Selenomonadaceae)、巨单胞菌属(Megamonas)、细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)中的至少一种。

本发明首次发现，上述特定菌群在轻度认知障碍中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现神经认知障碍的诊断或辅助诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断或辅助诊断，操作简单、特异性高、敏感性强。

在本发明的方案中，在将以上肠道菌群用于重度认知障碍标志物时，实施该用途时，通过直接检测上述菌属即可实现是否轻度认知障碍的结果判断，而并非一定能要检测到具体的微生物种才能实现相关的结果判断。

尤其是肠道菌群选自细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)和鸟肠球菌(Enterococcus avium)中的至少一种时，在ROC曲线上，这5种菌的AUC值均高于0.7，具有较高的特异性和敏感性。将上述肠道菌群应用于预测轻度神经认知障碍具有较高的准确性，可以根据该模型对神经认知障碍的患病风险进行预测。

在一种可选的实施方式中，肠道菌群选自细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)，该菌群为最主要的致病菌种。

第三方面，本发明还提供了一种检测不同程度认知障碍标志物丰度的试剂在制备诊断或辅助诊断认知障碍产品中的应用，认知障碍标志物包括重度认知障碍标志物和轻度认知障碍标志物的肠道菌群，重度认知障碍标志物选自肠厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacteriumcallanderi)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属638菌种(Enterobactersp.638)和盐单胞菌属(Halomonas)中的至少一种。

轻度认知障碍标志物选自肠月形单胞菌科(Selenomonadaceae)、巨单胞菌属(Megamonas)、细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)中的至少一种。

在一种可选的实施方式中，重度认知障碍标志物选自宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacteriumcallanderi)和肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)中的至少一种。

在一种可选的实施方式中，重度认知障碍标志物选自宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)。

在一种可选的实施方式中，轻度认知障碍标志物选自细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)和鸟肠球菌(Enterococcus avium)中的至少一种。

在一种可选的实施方式中，肠道菌群选自细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂选自引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体；

上述引物包括不限于用于检测菌株16srDNA的引物、巢式引物、LAMP引物、寡核苷酸引物等类型。在一种可选的实施方式中，上述引物还具有修饰，例如MGB修饰、C3间隔臂修饰、磷酸化修饰、地高辛修饰、生物素修饰或次黄嘌呤修饰。

在一种可选的实施方式中，检测认知障碍产品选自试剂盒、芯片、磁珠或微孔板。

第四方面，本发明还提供了一种诊断或辅助诊断认知障碍的试剂盒，其包括检测上述的重度认知障碍标志物、上述的轻度认知障碍标志物、或者上述的不同程度认知障碍标志物的试剂；

在一种可选的实施方式中，试剂盒包括肠道菌群DNA提取试剂、文库构建试剂和测序试剂。

第五方面，本发明还提供了一种检测上述的重度认知障碍标志物、上述的轻度认知障碍标志物、或者上述的不同程度认知障碍标志物的试剂在如下任意一项中的应用：

(1)制备神经认知障碍患病风险评估试剂盒；

(2)制备神经认知障碍预后的监测试剂盒。

上述神经认知障碍相关的致病菌属，可以作为神经认知障碍辅助诊断的指标，还可以结合相应的诊断模型，对神经认知障碍进行进一步诊断，或者对神经认知障碍患病风险进行评估，或者用于神经认知障碍预后的监测。此外，神经认知障碍患者可以通过补充缺失的有益菌，调节肠道菌群平衡，辅助神经认知障碍的治疗。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：

1)以待测样本的粪便DNA构建肠道菌群宏基因DNA测序文库，然后进行文库的高通量测序；

2)根据测序结果对肠道菌群中的肠道微生物的相对丰度进行检测，得到相对丰度值；

3)将得到的肠道微生物相对丰度值与设定值进行比较。

在一种可选的实施方式中，设定值为正常组得到的肠道微生物的相对丰度值。正常组即为健康正常人。根据肠道微生物相对丰度结果，绘制神经认知障碍患者组与健康对照组在上述模型公式的受试者工作特征(ROC)曲线，以评估模型在区分轻度认知障碍患者与健康对照组之间的能力、区分重度认知障碍患者与健康对照组之间的能力。根据ROC曲线，当曲线下面积(AUC)>0.7时，判定为轻度认知障碍。

数学模型如下：

TP(True Positive)：正例预测对；FP(False Positive)：负例预测错。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述步骤2)包括：

根据种水平的分类单位对测序序列进行分类，将样本根据其基因组的大小和比对上的总微生物读长进行标准化后，计算肠道菌群样本中的物种多样性和肠道微生物相对丰度值。

在一种可选的实施方式中，步骤3)还包括按照MoCA量表评分将神经认知障碍分为轻度神经认知障碍和重度神经认知障碍。

在一种可选的实施方式中，在筛选本发明中的标志物组合时，上述MoCA量表评价后还包括：肠道菌群采用线性判别分析计算LDA效应值，分析微生物种类差异。

第六方面，本发明还提供了利用上述的重度认知障碍标志物或上述的轻度认知障碍标志物诊断或辅助诊断认知障碍的系统，包括测序模块、相对丰度计算模块和比较模块。

相对丰度的计算方法如下：在种(Species)水平对测序序列进行分类，将每个样本根据其基因组的大小及比对上总的微生物读长进行标准化后，计算微生物相对丰度，用每个微生物种类中比对上的总的读长的比例来表示。相对丰度＝X/Y。X：微生物基因组大小；Y：总微生物读长。

测序模块对肠道菌群DNA样本进行测序，以获得测序结果；

相对丰度计算模块，根据测序结果，对肠道菌群中的肠道微生物的相对丰度进行检测，得到相对丰度值；

比较模块，将得到的肠道微生物相对丰度值与设定值进行比较。

第七方面，本发明还提供了一种检测上述的重度认知障碍标志物、上述的轻度认知障碍标志物、或者上述的不同程度认知障碍标志物的试剂在制备筛选治疗或预防神经认知障碍的药物的用途。

本发明具有以下有益效果：

本发明针对现有神经认知障碍肠道菌群标志物应用存在的缺陷，从肠道菌群角度提供了一种不同程度神经认知障碍标志物，为神经认知障碍的辅助诊断与疗效监测提供参考。本发明发现，特定菌群在轻度认知障碍、重度认知障碍或不同程度神经认知障碍中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现神经认知障碍的诊断或辅助诊断。使用本发明的微生物标志物进行诊断或辅助诊断，具有操作简单、特异性高、敏感性强的优势。基于本发明提供的神经认知障碍肠道菌群标志物，可以开发相应的检测试剂、试剂盒。

上述神经认知障碍标志物还可以结合相应的诊断模型，对神经认知障碍进行进一步诊断。本发明的提出，有助于对神经认知障碍患病风险进行评估，可以用于神经认知障碍预后的监测，还可以用于筛选治疗或预防神经认知障碍的药物，对于早期发现和干预NCD对于推迟向AD的转变具有重要意义。本发明的提出还有助减少患者面临的痛苦以及家庭和社会的负担。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明不同程度神经认知障碍患者与健康对照组肠道菌群的LEfse结果示意图；

图2为本发明宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)和肠杆菌属638菌种(Enterobactersp.638)四种菌种在重度神经认知障碍中诊断的ROC曲线示意图；

图3为本发明细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)和鸟肠球菌(Enterococcus avium)五种菌种联合诊断在轻度神经认知障碍患者中的ROC曲线示意图。

图1中：Normal代表正常神经认知功能组，Mild NCD代表轻度神经认知障碍组，Major NCD代表重度神经认知障碍组；图1展示了LDA score大于2.5有差异的物种，即具有统计学差异的biomaker；

图2中：Anaerostipes hadrus表示宠大厌氧棒状菌、Bacteroides ovatus表示卵形拟杆菌、Eubacterium callanderi表示卡氏真杆菌、Enterobactersp.638表示肠杆菌属638菌种；

图3中：Megamonas funiformis表示细绳形巨单胞菌、Ruminococcus gnavus表示活泼瘤胃球菌、Escherichia coli表示大肠埃希氏菌、Porphyromonas asaccharolytica表示不解糖卟啉单胞菌、Enterococcus avium表示鸟肠球菌。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

不同程度神经认知障碍肠道菌群标志物的筛选。

一、研究对象和样本收集：

研究在澳门特区不同长者综合服务中心收集的轻度神经认知障碍患者11例、重度认知障碍患者9例和认知正常的健康对照组8例，各组研究对象在年龄、性别及受教育程度上相互匹配。

分别收集实验对象的粪便样本，将样本冰冻并保存在-80℃冰箱内。详细记录研究对象的社会人口学信息，包括性别、年龄等。本研究经澳门大学伦理委员会审核与批准，并获得患者的知情同意。

二、肠道菌群宏基因组测序

1.基因组DNA提取

按试剂盒说明书操作步骤，利用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit(QIAamp，51804)提取微生物DNA。

2.基因组DNA质检

使用Nanodrop检验DNA质量和浓度。

3.宏基因组DNA测序文库构建

取100ng DNA作为起始量，使用超声破碎将其打断为300-400bp的DNA片段，按照VAHTS Nano DNA Library Prep Kit for Illumina文库构建试剂盒说明进行DNA测序文库的构建。

4.宏基因组DNA测序

在Illumina HiSeq2500测序平台进行宏基因组测序，应用HiSeq PE Cluster Kitv4和HiSeq SBS V4 250 Cycle Kit(Illumina)测序试剂盒，每个样品深度为10-50Mreads。

5.测序文件质控

下机fastq文件(raw reads)通过Fast QC工具质控，使用Fastx toolkit去除低质量、重复的读长以及可能的接头序列。使用Hi SAT2和Decon Seq软件去除人类的读长从而获得非人类的序列。

6.测序文件分析

使用BWA0.7.5a将非人的序列在预构建微生物参考基因组数据库中进行比对。在种(species)水平对测序序列进行分类，将每个样本根据其基因组的大小及比对上总的微生物读长进行标准化后，计算微生物相对丰度，用每个微生物种类中比对上的总的读长的比例来表示。

相对丰度＝X/Y

X：微生物基因组大小；Y：总微生物读长。

三、数据分析

采用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 9.0软件进行数据分析，绘图使用R 3.6.0软件完成。样本间微生物种类差异通过LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA)EffectSize)计算LDA效应值，使用wilcox秩和检验对三组中任意两组的不同水平上的物种水平进行检验，估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，以P<0.05为差异有统计学意义。

四、结果

LDA score大于2.5有差异的物种的结果参照图1所示，结果显示，与健康人群相比，重度神经认知障碍患者在厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacteriumcallanderi)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)和盐单胞菌属(Halomonas)水平呈现显著性差异；轻度神经认知障碍患者在月形单胞菌科(Selenomonadaceae)、巨单胞菌属(Megamonas)、细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)水平呈现显著性差异(P＜0.05)。

根据LEfSe分析结果(图1)，并结合t-test检验结果，分析得出，厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)和盐单胞菌属(Halomonas)是重度神经认知障碍主要致病菌属，可以作为重度神经认知障碍相关的生物标志物，其中宠大厌氧棒状菌(Anaerostipeshadrus)为最主要的致病菌种；月形单胞菌科(Selenomonadaceae)、巨单胞菌属(Megamonas)、细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)是轻度神经认知障碍主要致病菌属，可以作为轻度神经认知障碍相关的生物标志物，其中细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)为最主要的致病菌种。

重度神经认知障碍相关菌种的ROC曲线如图2所示，宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacteriumcallanderi)和肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)四种菌种的AUC值均高于0.7，具有较高的特异性和敏感性，将这四种菌种应用于预测重度神经认知障碍具有较高的准确性。

轻度神经认知障碍相关菌种的ROC曲线如图3所示，细绳形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)和鸟肠球菌(Enterococcus avium)五种菌种的AUC值均高于0.7，具有较高的特异性和敏感性，应用于预测轻度神经认知障碍具有较高的准确性，可以根据该模型对神经认知障碍的患病风险进行预测。

实验例1

鉴定重度神经认知障碍。

以宠大厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、卡氏真杆菌(Eubacterium callanderi)和肠杆菌属638菌种(Enterobacter sp.638)四种菌种为标志物。

(1)采集受检者的粪便标本进行宏基因测序，获取上述4种肠道菌种的相对丰度；

(2)将个4种肠道菌种的相对丰度与各自相应的LDA值相乘，并将相乘后的各个结果相加，得到风险指数，当风险指数超过正常人群定点值即可判断受检者患有重度神经认知障碍，判定值为28.75，计算数值见表1。

实验例2

鉴定轻度神经认知障碍。

以细绳形巨单胞菌(Megamonas funiformis)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)和鸟肠球菌(Enterococcus avium)五种菌种为标志物。

(1)采集受检者的粪便标本进行宏基因测序，获取上述4种肠道菌种的相对丰度；

(2)将个4种肠道菌种的相对丰度与各自相应的LDA值相乘，并将相乘后的各个结果相加，得到风险指数，当风险指数超过正常人群定点值即可判断受检者患有轻度神经认知障碍，判定值为8.79，计算数值见表2。

基于此，本发明提供的神经认知障碍标志物可以构建个体患病风险检测试剂盒，用于神经认知障碍患病风险的评估。试剂盒由肠道菌群DNA提取试剂，文库构建试剂和测序试剂组成，可以构建用于神经认知障碍预后监测的检测试剂盒。

综上，物种多样性、相对丰度以及神经认知障碍相关致病菌属，可以作为神经认知障碍辅助诊断的指标，还可以结合诊断模型，对神经认知障碍进行进一步诊断，或者对神经认知障碍患病风险进行评估，或者用于神经认知障碍预后的监测；再次，神经认知障碍患者可以通过补充缺失的有益菌，调节肠道菌群平衡，辅助神经认知障碍的治疗。另外，神经认知障碍肠道菌群标志物还可以应用于筛选治疗或预防神经认知障碍的药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。