导航：首页> 生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程>锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用

锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用

文献发布时间：2024-04-18 19:58:21

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用。

背景技术

免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构的球蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链通过二硫键连接组合而成的四聚体，其中，轻链由可变区(V 区)、连接区(J区)和恒定区(C区)组成，重链由可变区(V区)、铰链区(D 区)、连接区(J区)和恒定区(C区)组成，并且分别由对应的V、D、J和C 基因片段编码而成；在生物体内V、D和J基因片段均有多个拷贝，而在B淋巴细胞发育过程中，不同V、D和J基因片段随机组合形成具有功能的免疫球蛋白的过程即为基因重排。

在正常生理条件下，B淋巴细胞中携带的免疫球蛋白重排序列是相对均一的，不同序列占比相差不大，表现为“多克隆性重排”；在淋巴瘤发生过程中淋巴细胞失去正常功能而恶性增殖，该过程伴随其携带的特异的重排序列所占比例极大的增加，表现为“克隆性重排”，通过对基因重排进行检测，判断其为“多克隆性重排”或“克隆性重排”，即可以判断患者为正常的淋巴结肿大还是淋巴瘤。

在基因重排检测中，基于分子条形码技术进行高通量测序文库的构建会产生由于正向引物与反向引物的分子条形码序列相互结合并扩增的接头自连片段，即非特异性扩增产物，对后续高通量测序的结果产生极大干扰。

因此如何减少基因重排检测中的非特异性扩增产物，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提出了锁核酸修饰的分子条形码、反向引物、引物组、试剂盒和抑制非特异性扩增的方法及应用，有利于减少基因重排检测中的非特异性扩增产物的数量。

第一方面，本发明通过一实施例提供如下技术方案：

一种锁核酸修饰的分子条形码，用于抑制基因重排检测过程中非特异性扩增，所述分子条形码的碱基总数Q≥10，所述分子条形码含有m个锁核酸修饰的位点，m个锁核酸修饰的位点将所述分子条形码分为m+1段序列，其中，每段序列的碱基数量为2～4个，m≥2。

可选的，m满足：

[Q/4]≤m≤[Q/3]，

式中，Q表示分子条形码的碱基总数，[Q/3]表示不超过Q/3的最大整数， [Q/4]表示不超过Q/4的最大整数。

可选的，所述简并碱基N的数量≥8。

可选的，所述简并碱基N的数量为8～10。

可选的，所述分子条形码的至少两段序列的碱基数量相同。

可选的，所述分子条形码的相邻两段序列的碱基数量相同。

可选的，所述分子条形码的碱基总数Q为10，锁核酸修饰的所述位点包括沿分子条形码的5’端至3’端方向的第k位点和第k+4位点，其中，k＞2。

可选的，锁核酸修饰的所述位点包括第4位点和第8位点。

可选的，所述分子条形码的序列如SEQ ID NO.1所示。

可选的，锁核酸修饰的所述位点包括第3位点和第7位点。

可选的，所述分子条形码的序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，基于同一发明构思，本发明通过一实施例提供如下技术方案：

一种反向引物，所述反向引物包括第一方面所述的锁核酸修饰的分子条形码，所述反向引物包括接头引物、分子条形码和特异性引物。

可选的，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

或，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

第三方面，基于同一发明构思，本发明进一步通过一实施例提供如下技术方案：

一种引物组，所述引物组包括正向引物和第二方面所述的反向引物，所述正向引物包括FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物中的至少一种。

第四方面，基于同一发明构思，本发明进一步通过一实施例提供如下技术方案：

一种试剂盒，所述试剂盒包括：

DNA聚合酶，缓冲液，以及

第二方面所述的反向引物。

第五方面，基于同一发明构思，本发明进一步通过一实施例提供如下技术方案：

一种用于基因重排检测中抑制非特异性扩增的方法，所述方法采用第三方面所述的引物组进行扩增反应，所述方法包括：

对待扩增样品进行至少两轮的PCR扩增反应，得到扩增产物；

其中，第一轮PCR扩增反应所用的引物包括锁所述反向引物，第二轮PCR 扩增反应所用的引物包括FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物中的至少一种。

可选的，至少两轮的所述PCR扩增反应中，最后一轮PCR扩增反应所用的引物为接头引物。

可选的，所述反向引物的浓度为9μmol/L～11μmol/L，所述反向引物的加入量为5μL～7μL。

可选的，所述待扩增样品中DNA总重量≥100ng。

第六方面，基于同一发明构思，本发明进一步通过一实施例提供如下技术方案：

一种第一方面所述的锁核酸修饰的分子条形码在制备基因重排检测的试剂中的应用。

本发明实施例提供的锁核酸修饰的分子条形码，通过控制分子条形码的碱基总数Q≥10，控制锁核酸修饰的位点数量≥2，控制分子条形码中每段序列的碱基数量，使得锁核酸修饰的位点将分子条形码的序列均匀分隔开，由于锁核酸修饰后的碱基是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，结构中核糖的2，-O，4， -C位通过不同的缩水作用形成氧亚基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，从而连接成环形，而这个环形桥锁定了呋喃糖C3，-内型的N构型，降低了核糖或脱氧核糖结构的柔韧性，且增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，同时经锁核酸修饰后的碱基跟DNA或RNA具有相同的磷酸盐骨架，因此经锁核酸修饰后的碱基跟靶标基因上的碱基的识别能力和结合能力较未经锁核酸修饰的碱基强，也就是说在引物的分子条形码中进行锁核酸修饰，使得经过锁核酸修饰后的引物中碱基跟靶标基因的碱基的识别能力和结合能力较互补的引物的强，因此能避免扩增引物的接头引物之间的直接结合，从而能抑制正向引物和反向引物之间的接头自连，减少了正向引物和反向引物之间因接头自连而产生的非特异性扩增产物的数量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：

图1示出了本发明实施例提供的锁核酸修饰后的分子条形码用于基因重排检测过程中的示意图；

图2示出了本发明实施例提供的非特异性扩增的原理示意图；

图3示出了本发明实施例提供的一种用于基因重排检测中抑制非特异性扩增的方法的流程图；

图4示出了本发明实施例提供的一种用于基因重排检测中抑制非特异性扩增的方法的详细流程图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明的创造性思维为：传统的淋巴瘤诊断方法主要包括组织病理学、免疫学等，但是检出率低，容易误判，而免疫球蛋白基因重排检测能够辅助淋巴瘤诊断，提高诊断准确率，并且通过基因重排检测重链和轻链基因，淋巴瘤检出率和诊断准确率均超过90％。

在基因重排检测中，PCR-高通量测序法因分辨率高，同时能够确定每个克隆的具体序列，因此检测准确率高；但是PCR-高通量测序法依赖于多重PCR 进行文库构建，而文库过程中导致的扩增偏倚对检测结果存在极大干扰，会导致部分样本诊断错误，虽然目前通过分子条形码测序技术能消除PCR扩增反应导致的偏倚，提高测序均一度和灵敏度，但是，如图2所示，基于分子条形码技术进行高通量测序文库的构建会产生由于正向引物与反向引物的分子条形码序列相互结合并扩增的接头自连片段，即非特异性扩增产物，对后续高通量测序的结果产生极大干扰。

在本发明的一个实施例中，提供一种锁核酸修饰的分子条形码，该分子条形码用于抑制基因重排检测过程中非特异性扩增，分子条形码的碱基总数Q≥10，分子条形码含有m个锁核酸修饰的位点，m个锁核酸修饰的位点将分子条形码分为m+1段序列，其中，每段序列的碱基数量为2～4个，m≥2。

在本发明实施例中，分子条形码的碱基可以是碱基A、碱基T、碱基C、碱基G、简并碱基R、简并碱基Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V、简并碱基D和简并碱基 N。

在本发明实施例中，分子条形码的碱基总数、简并碱基的数量以及锁核酸修饰的位点数量之间可能的分布情况如下：

1、分子条形码的碱基总数Q为10个，简并碱基N的数量为4个或5个或6个或7个或8个，锁核酸修饰的位点为2个，其余的碱基可以是简并碱基 R、简并碱基Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V或简并碱基D；

2、分子条形码的碱基总数Q为12个，简并碱基N的数量为4个或5个或6个或7个或8个或9个，锁核酸修饰的位点为4个或3个，其余的碱基可以是简并碱基R、简并碱基Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V或简并碱基D；

3、分子条形码的碱基总数Q为14个，简并碱基N的数量为8个或9个或10个，锁核酸修饰的位点为4个，剩余的碱基可以是简并碱基R、简并碱基 Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V或简并碱基D；

4、分子条形码的碱基总数Q为15个，简并碱基N的数量为8个或9个或10个，锁核酸修饰的位点为5个或4个，剩余的碱基可以是简并碱基R、简并碱基Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V或简并碱基D；

5、分子条形码的碱基总数Q为18个，对应的简并碱基N为8个或9个或10个，锁核酸修饰的位点为6个或5个，剩余的碱基可以是简并碱基R、简并碱基Y、简并碱基M、简并碱基K、简并碱基S、简并碱基W、简并碱基H、简并碱基B、简并碱基V或简并碱基D。

控制锁核酸修饰后的每段分子条形码的碱基数量为2～4个，一方面，由于锁核酸修饰后的每段序列需要维持简并碱基的数量，使得分子条形码和靶标基因随机结合的种类充足，从而使得产物数量的足够，因此若某段序列的碱基数量过少，则扩增引物之间随机结合的种类数量将不足，难以维持产物的数量足够，会导致锁核酸修饰的位点不满足要求，另一方面，由于锁核酸修饰后的每段序列的碱基数量超过4个时，该段序列所在的引物将有可能同互补的引物之间直接结合，会产生非特异性扩增产物。

从扩增反应阶段来看，由于分子条形码能抑制正向引物和反向引物之间的非特异性扩增，因此能促使正向引物和反向引物分别同靶标基因进行充分的扩增，从而能提升扩增反应的效率。

在一些可选的实施方式中，m满足：

[Q/4]≤m≤[Q/3]，

式中，Q表示分子条形码的碱基总数，[Q/3]表示不超过Q/3的最大整数， [Q/4]表示不超过Q/4的最大整数。

本发明实施例提供的技术方案中，通过控制锁核酸修饰的位点与分子条形码的碱基总数的关系，控制m满足[Q/4]≤m≤[Q/3]的关系，使得锁核酸修饰后的分子条形码能有效地抑制正向引物和反向引物之间的非特异性扩增。具体来说，如果m的取值过小，则会使得分子条形码中某段序列的碱基数量过多，从而一定程度上增强含有该分子条形码的引物跟非靶标基因的片段和区域的结合能力，使得正向引物和反向引物之间将直接结合，一定程度上会增加非特异性扩增产物的数量，如果m的取值过大，会使得分子条形码中某段序列的碱基数量过少，一定程度上会造成随机标签的种类数量过少，一定程度上导致锁核酸修饰的位点不满足要求。

在一些可选的实施方式中，所述简并碱基N的数量≥8。

本发明实施例提供的技术方案中，通过控制分子条形码的简并碱基N的数量≥8，可以达到满足简并碱基N的数量充足的同时使得锁核酸修饰的位点在2 个以上，由于简并碱基N代表的是碱基A、C、T和G中的任一种，使得分子条形码可选择的种类足够多，从而使得分子条形码同靶标基因随机结合的方式足够多，使分子条形码的功能正常。

在一些可选的实施方式中，所述简并碱基N的数量为8～10。

本发明实施例提供的技术方案中，通过控制简并碱基N的数量，使得分子条形码和靶标基因随机结合的种类数量足够多，促使产物的数量足够，且可以降低分子条形码和靶标基因的非特异性扩增的风险。具体来说，如果简并碱基 N的数量取值过小，会使得分子条形码和靶标基因的随机结合的种类数量不足，可能无法满足产物数量的要求，如果简并碱基N的数量取值过大，一方面，会使得分子条形码的序列长度太长，而过长的分子条形码一定程度会提高分子条形码所在引物和靶标基因之间DNA错配的风险，会增加非特异性扩增产物的数量，另一方面，简并碱基N的数量增多，锁核酸修饰的位点可能无法满足每段分子条形码的碱基数量为2～4个的这一要求，某段分子条形码的碱基数量可能会超过4个，会造成该段分子条形码所在的引物和互补的引物之间直接结合，产生非特异性扩增的产物。

在一些可选的实施方式中，分子条形码中至少两段序列的碱基数量相同。

在一些可选的实施方式中，分子条形码中相邻两段序列的碱基数量相同。

本发明实施例提供的技术方案中，控制分子条形码中两段序列的碱基数量相同，或者控制相邻两端序列的碱基数量相同，使得分子条形码中至少有两段是均匀排布的，而均匀分隔的分子条形码在跟靶标基因互补配对过程中能同靶标基因稳定结合，增强分子条形码和靶标基因的结合程度，避免了分子条形码所在的引物跟互补的引物之间直接结合，抑制了正向引物和反向引物之间的接头自连。

在一些可选的实施方式中，分子条形码的碱基总数Q为10，锁核酸修饰的位点包括分子条形码的5’端至3’端方向的第k位点和第k+4位点，其中，k可以是3或者4，对应的锁核酸修饰的位点可以是第3位点和第7位点，也可以是第4位点和第8位点。

本发明实施例提供的技术方案中，通过控制分子条形码的碱基总数为10，并且锁核酸修饰的位点包括两个位点，且控制两个位点之间的间隔的碱基数量为4个，使得分子条形码中的序列保持一定程度上的间隔，同时将10个碱基的分子条形码大致均匀的分隔开，均匀分隔的分子条形码在跟靶标基因互补配对过程中能同靶标基因稳定结合，避免了分子条形码所在的引物跟互补的引物之间直接相互结合，抑制了正向引物和反向引物之间的接头自连。

需要说明是，这些锁核酸修饰的位点的碱基可以从碱基A、碱基T、碱基 C和碱基G中进行具体的选择，具体的锁核酸修饰的位点的碱基需要由分子条形码所在引物的互补引物决定。

当锁核酸修饰的位点是第4位点和第8位点时，第4位点或第8位点的碱基可以从碱基A、碱基T、碱基C和碱基G中进行具体的选择，也就是说，第 4位点或第8位点的碱基可以是碱基A、碱基T、碱基C和碱基G，具体的选择需要由分子条形码所在引物的互补引物所决定。当第4位点选择的碱基为碱基A，同时第8位点的碱基为T时，得到的分子条形码的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

同理，当第3位点选择的碱基为碱基C，同时第7位点选择的碱基为碱基 A时，得到的分子条形码的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一个实施例中，提供一种反向引物，反向引物包括但不限于接头引物、锁核酸修饰的分子条形码和特异性引物。

本发明实施例提供的技术方案中，通过对分子条形码所在的引物进行控制，由于反向引物结合靶标基因的区域较正向引物的少，因此对反向引物进行设计，通过设计的反向引物中的分子条形码，能够提高反向引物和靶标基因的结合程度，进而抑制扩增引物中正向引物和反向引物之间的非特异性扩增。

在本发明的一个实施例中，提供一种引物组，引物组包括：

正向引物，以及

反向引物；

正向引物包括但不限于FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物中的至少一种，其中，正向引物可以是FR1正向引物、FR2正向引物、FR3正向引物，也可以是FR1正向引物和FR2正向引物的混合正向引物，也可以是FR2 正向引物和FR3正向引物的混合正向引物，也可以是FR1正向引物和FR3正向引物的混合正向引物，也可以是FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物的混合正向引物。

在本发明的一个实施例中，提供一种试剂盒，包括但不限于反向引物、DNA 聚合酶、缓冲液和纯化用的磁珠。

在本发明的一个实施例中，如图3所示，提供一种用于基因检测中抑制非特异性扩增的方法，包括：

S1.对待扩增样品进行至少两轮的PCR扩增反应，得到扩增产物；

其中，第一轮PCR扩增反应所用的引物包括反向引物，所述第二轮PCR 扩增反应所用的引物包括FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物中的至少一种。

本发明实施例提供的技术方案中，前两轮PCR扩增反应需先进行第一轮 PCR扩增反应再进行第二轮PCR扩增反应，而第一轮PCR扩增反应所用引物为带有锁核酸修饰的分子条形码的反向引物，可以使得带有分子条形码的反向引物同靶标基因进行扩增，促使第一轮扩增产物中均带有分子条形码，再通过正向引物进行第二轮PCR扩增反应，可使得第一轮扩增产物进一步扩增，促使正向引物对第一轮扩增产物进一步进行扩增，可使得扩增后的产物总量足够，方便后续的基因重排检测。

在一些可选的实施方式中，至少两轮的PCR扩增反应中，最后一轮PCR 扩增反应所用的引物为接头引物。

本发明实施例提供的技术方案中，控制最后一轮PCR扩增反应所用的引物为接头引物，利用接头引物补全整个扩增产物的DNA片段，方便后续的基因重排检测。

需要说明的是，一般情况下，进行两轮PCR扩增反应后，就可以进行最后一轮PCR扩增反应。而采用上述的至少两轮的PCR扩增反应，可以避免直接投入含有正向引物和反向引物的引物组，因为在PCR扩增反应阶段该引物组中正向引物和反应引物之间会直接结合，因此采用不同轮次PCR扩增反应，将反向引物和正向引物分别进行PCR扩增反应，能抑制正向引物和反向引物之间的非特异性扩增，减少非特异性扩增的产物数量。

在一些可选的实施方式中，反向引物的浓度为9μmol/L～11μmol/L，反向引物的加入量为5μL～7μL。

本发明实施例提供的技术方案中，控制反向引物的浓度和反向引物的加入量，一般是为了使反向引物能够将待扩增样品充分的进行第一轮PCR扩增反应，促使第一扩增产物的数量足够，为第二轮PCR扩增反应提供充足的模板。

为了更好的方便扩增反应体系的使用，因此需要控制引物的加入量，而控制了反向引物的加入量后，对应的也要控制反向引物的浓度，促使第一扩增产物的数量足够。

在一些可选的实施方式中，待扩增样品中DNA总重量≥100ng。

本发明实施例提供的技术方案中，控制待扩增样品中DNA总重量，可使得DNA片段的数量足够多，而足够多的DNA片段能使得扩增产物中的数量充足，因此控制DNA总重量，能为第一轮PCR扩增反应和第二轮PCR扩增反应提供充足的产物，从而使得最终得到的扩增产物数量的充足，方便后续的基因重排检测操作。

在本发明的一个实施例中，提供一种所述锁核酸修饰的分子条形码在制备基因重排检测的试剂中的应用，包括但不限于，将分子条形码用于制备基因重排检测的正向引物或探针中。

实施例1

基于同一发明构思，实施例1提供一种锁核酸修饰的分子条形码，分子条形码的碱基数量为10，锁核酸修饰的位点为第4位点和第8位点，其中，第4 位点的碱基为碱基A，第8位点的碱基为碱基T，锁核酸修饰的分子条形码的序列如SEQ ID NO.1所示，为5’-NNA*NNNT*NN-3’，其中，*表示锁核酸(LNA) 修饰的位点。

实施例2

基于同一发明构思，实施例2提供了一种反向引物，在实施例1的基础上，反向引物包括接头引物、锁核酸修饰的分子条形码和特异性引物，具体序列如 SEQ ID NO.3所示。

实施例3

基于同一发明构思，实施例3提供了一种引物组，包括正向引物和实施例 2的反向引物，其中，正向引物包括FR1正向引物、FR2正向引物或FR3正向引物，具体的引物组如表1所示。

表1引物组序列情况表

注：*代表锁核酸(LNA)修饰的位点。

实施例4

基于同一发明构思，实施例4提供了一种试剂盒，包括实施例2的反向引物、DNA聚合酶、缓冲液和磁珠。

实施例5

基于同一发明构思，实施例5提供了一种用于基因重排检测中抑制非特异性扩增的方法，如图4所示，包括：

S1.对待扩增样品进行第一轮PCR扩增反应，具体扩增反应体系如表2所示，扩增反应程序如表3所示，扩增后的产物需要进行磁珠纯化，才能得到第一扩增产物；其中，磁珠纯化中磁珠和扩增反应体系的体积比为0.8；

S2.对第一扩增产物进行第二轮PCR扩增反应，具体扩增反应体系如表4 所示，扩增反应程序如表5所示，每种FR正向引物单独作为正向引物进行扩增，扩增后的产物需要进行进一步的磁珠纯化，得到第二扩增产物；其中，磁珠纯化中磁珠和扩增反应体系的体积比为0.6；

S3.对第二扩增产物进行第三轮PCR扩增反应，具体扩增反应体系如表6 所示，扩增反应程序如表7所示，扩增后的产物需要进行进一步的磁珠纯化，才能得到第三扩增产物；其中，磁珠纯化中磁珠和扩增反应体系的体积比为0.8；

第一轮PCR扩增反应所用的引物为SEQ ID NO.2所示的反向引物，第二轮PCR扩增反应所用的引物为FR1正向引物、FR2正向引物和FR3正向引物，第三轮PCR扩增反应所用的引物为Illumina-R接头引物。

表2第一轮PCR扩增反应体系情况表

注：表中0＜X≤18μL。

表3第一轮PCR扩增反应程序情况表

表4第二轮PCR扩增反应体系情况表

表5第二轮PCR扩增反应程序情况表

表6第三轮PCR扩增反应体系情况表

表7第三轮PCR扩增反应程序情况表

实施例6

基于同一发明构思，实施例6提供了另外一种锁核酸修饰的分子条形码，分子条形码的碱基数量为10，锁核酸修饰的位点为第3位点和第7位点，其中，第3位点的碱基为碱基C，第7位点的碱基为碱基A，分子条形码的序列如SEQ ID NO.2所示，为5’-NNC*NNNA*NNN-3’，其中，*表示锁核酸(LNA) 修饰的位点。

实施例7

基于同一发明构思，实施例7提供了一种反向引物，在实施例6的基础上，反向引物包括接头引物、锁核酸修饰的分子条形码和特异性引物，具体序列如 SEQ ID NO.4所示。

实施例8

基于同一发明构思，实施例8提供了一种引物组，包括正向引物和实施例 7的反向引物，其中，正向引物包括FR1正向引物、FR2正向引物或FR3正向引物，具体的引物组如表1所示。

实施例9

基于同一发明构思，实施例9提供了另外一种用于基因重排检测中抑制非特异性扩增的方法，为简要描述，实施例部分未提及之处，可参考前述方法实施例中相应内容；与实施例5相比，实施例9的区别仅在于采用的反向引物中是含有实施例6的分子条形码。

对比例1

基于对照原则，对比例1提供了一种未经锁核酸修饰的分子条形码，具体序列为5’-NNNNNNNNNN-3’。

该分子条形码对应的反向引物的序列如表1所示，其余序列和方法的工艺条件均同前述实施例1。