一种液质测定淡水鱼、淡水虾中拟除虫菊酯类农药残留的方法

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种液质测定淡水鱼、淡水虾中拟除虫菊酯类农药残留的方法。

背景技术

拟除虫菊酯类杀虫剂对鱼类等水生生物属高毒级，虽然多使用于农田，但当它随径流流入水体时，也直接危害鱼类等水生经济动物。因为拟除虫菊酯具有疏水性，所以很容易被鱼鳃吸收；同时拟除虫菊酯还是一类亲脂很强的化合物，甚至在水中浓度很低时，也可被鱼鳞强烈吸收；另外由于鱼体内缺乏水解菊酯类物质的酶，所以拟除虫菊酯在鱼体内的代谢主要靠氧化作用，致使对鱼类的毒性作用远大于对哺乳动物和鸟类。淡水鱼、淡水虾对拟除虫菊酯类药物急性毒性症状主要表现为：过度活泼、平衡失调、呼吸频率加快、鳃痉挛、脊椎蜷曲、鳃由正常红色变为紫色、鳃分泌黏液增多等现象。药物中毒会直接影响到它们的游动、觅食、迁徙和繁殖，进而影响它们对生态环境的适应性。

拟除虫菊酯类农药在农田使用后，受江浙一带雨水气候影响，渗入或随雨水冲刷进入淡水鱼、淡水虾养殖区引起污染。亦或是商户在针对杀灭养殖水域中的微小寄生虫时，导致水体污染。同时部分水产品对于该类农药代谢能力较慢，造成药物残留的现象。

欧盟法规396/2005规定了拟除虫菊酯类农药在牛奶、鸡蛋、肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和蜂蜜中的最大残留限量(MRLs)。国家标准GB 2763-2021规定了食品中564种农药的最大残留限量，国家标准GB 2763.1-2022规定了食品中112种农药的最大残留限量，但是拟除虫菊酯类农药主要规定了植物源性食品中的最大残留限量和检测方法，其中水产品仅涉及滴滴涕(DDT)和六六六(HCH)两种农药杀虫剂。因此水产品中拟除虫菊酯菊酯类农药的检测标准存在一定的不足，尚缺乏科学系统的定性定量方法。近年来针对拟除虫菊酯趋向于气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)的测定，但具有效率低、前处理繁琐等缺陷，且可能存在假阳性。液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)是一种可用于分析拟除虫菊酯或拟除虫菊酯农药的替代技术，且具有灵敏度高、选择性强、准确度好、分析运行时间较短等优点，对于实际应用来说将是更为有利，GC/GC-MS分析时需要更复杂的实验方案，而LC-MS/MS可以对于更粗制提取物直接进行分析。另外，考虑到液质分析容易受到基质效应的影响，本发明同时引入同位素内标，综合研究开发出测定淡水鱼、淡水虾中拟除虫菊酯类农药残留超高效、准确的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种液质测定淡水鱼、淡水虾中拟除虫菊酯类农药残留的方法的技术方案。该方法能够超高效、便捷、准确的测定目标基质中拟除虫菊酯类农药的残留量。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种液质测定淡水鱼、淡水虾中拟除虫菊酯类农药残留的方法，其包括以下步骤：

1)将称取均质好的样品，经过乙腈充分提取后，对乙腈层进行净化处理；

2)采用超高效液相色谱-串联质谱法测定；

3)内标法定量；

所述超高效液相色谱-串联质谱法中色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相A为2mmol/L甲酸铵-甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱；

所述超高效液相色谱-串联质谱法中质谱条件为：ESI源，正离子模式；毛细管电压：3kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；雾化气流速：800L/Hr；碰撞气流速：150L/Hr；扫描模式：多反应监测。

进一步，所述拟除虫菊酯类农药为甲氰菊酯、氯菊酯、醚菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯，内标物分别为甲氰菊酯-D5、氯菊酯-D5、醚菊酯-D5、氰戊菊酯-D5、联苯菊酯-D5、氟胺氰菊酯-D5、溴氰菊酯-D6。

进一步，所述步骤1)中乙腈提取包括：称取均质好的样品至离心管中，加入去离子水和乙腈，并加入氯化钠，涡旋混合，超声提取，提取液离心，取乙腈层，待净化。

进一步，所述步骤1)中净化处理包括：将乙腈层加入含PSA和Z-Sep+粉末的离心管中，涡旋，离心，取上层清液过有机滤膜。

进一步，所述步骤2)中色谱条件中梯度洗脱程序为：

进一步，所述步骤2)中质谱条件中拟除虫菊酯类标物及其内标质谱参数为：

进一步，所述步骤3)中内标法定量具体包括：

(1)配置混标储备液：分别量取7种拟除虫菊酯类农药及其内标物的单标，用色谱级乙腈定容于10mL容量瓶中，配制成各物质浓度约为1mg/L的混标储备液；

(2)制作标准曲线：将配置的混标储备液量取，用色谱级乙腈逐级等倍稀释，得到0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/L的5个不同浓度的7种拟除虫菊酯类农药的混标样，5.0μg/L的内标浓度，依次对每一浓度的混标样进行检测，以拟除虫菊酯类药物内外标面积之比为纵坐标Y，拟除虫菊酯类物质质量浓度为横坐标X，绘制得到7条标准曲线；

(3)测定淡水鱼、淡水虾样品：取处理好的淡水鱼、淡水虾进样检测，将检测所得到的峰面积代入相应物质的标准曲线，分析计算得到7种拟除虫菊酯类药物在淡水鱼、淡水虾中的含量。

进一步，所述PSA和Z-Sep+质量比为1:1。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱仪，分析淡水鱼、淡水虾中7种拟除虫菊酯类药物残留量的方法。该方法具有前处理简便高效，准确性好，基质干扰效应小，回收率高，稳定性好等优点，攻克了传统分析技术上的壁垒和难点，同时为解决水产品乃至动物性食品中拟除虫菊酯类药物的测定提供基础实验思路。

(2)本发明使得7种拟除虫菊酯类药物在15min内实现分离，在0.5-10μg/L的检测范围内线性关系良好，线性相关系数R

(3)7种拟除虫菊酯类药物重现性良好，在淡水鱼和淡水虾两种基质中，相对标准偏差RSD为0.94-8.13％。

(4)因LCMS/MS相较于GCMS/MS更易受到基质效应的干扰，同时从离子化技术上分析，ESI相较于APCI更易受到离子抑制作用。本方法针对基质效应的干扰做出改进，通过引入同位素内标物从而消除影响。

(5)采用PSA和Z-Sep+进行基质净化处理，减少基质干扰，提高检测精度。

附图说明

图1为实施例1中7种净化粉配比回收率；

图2为实施例2中基质为淡水鱼和淡水虾的谱图及标准曲线；

图3为实施例2中样品中检出物质质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：净化吸附剂的选择

淡水鱼、淡水虾富含营养物质，基质成分复杂，需要在低温离心的基础上再次进行净化。目前，常见的分散萃取净化吸附剂主要有PSA、GCB、C

优化阶段实验设置了7种净化材料配比，分别为①100mg C

结果显示，⑥号净化粉50mg PSA和50mg Z-Sep

实施例2

主要仪器和试剂：

Waters UPLC I-Class/Xevo TQ-s超高效液相色谱-串联质谱仪(美国waters公司)，Milli-Q超纯水仪，高速冷冻离心机ST16R(Thermos公司)，涡旋混合器VG3 S025(IKA公司)，高速匀浆机T25(IKA公司)，刀式研磨仪GM200(Retsch公司)。

甲氰菊酯、氯菊酯、醚菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯，购于Dr.Ehrenstorfer，浓度均为1000mg/L。甲氰菊酯-D5、氯菊酯-D5、醚菊酯-D5、氰戊菊酯-D5、联苯菊酯-D5、氟胺氰菊酯-D5、溴氰菊酯-D6，购于Dr.Ehrenstorfer，浓度均为100mg/L。乙腈，色谱纯，德国Merk公司；甲酸铵，色谱纯，阿拉丁试剂有限公司；甲酸，色谱纯，Thermofisher(美国)；氯化钠，分析纯，无锡市展望化工试剂有限公司；PSA、C18，welchmaterials,inc.(美国)；Z-Sep+，Supelco(美国)。

样品：浙江地区市场抽检淡水鱼、淡水虾共10批次。

样品制备：取样品可食用部分，用研磨仪制成匀浆备用。称取处理好的样品5g(精确至0.01g)至50mL离心管中，加入5.0mL去离子水和10.0mL乙腈，并加入2.0g氯化钠，涡旋混合1min，超声提取30min，提取液于4 000r/min离心10min，取乙腈层，待净化。将1.0mL上述提取液加入含50mg PSA和50mg Z-Sep+粉末的离心管中。涡旋1min，4 000r/min离心5min，取上层清液过0.22μm有机滤膜，待上机。

超高效液相色谱-串联质谱检测：

色谱条件：

色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1100mm，1.7μm。柱温：40℃。进样量：5L。流动相A为2mmol/L甲酸铵-甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱详见表1。

表1流动相梯度洗脱程序

质谱条件：ESI源，正离子模式；毛细管电压：3kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；雾化气流速：800L/Hr；碰撞气流速：150L/Hr；扫描模式：多反应监测(MRM)。拟除虫菊酯类标物及其内标质谱参数详见表2。

表2化合物主要质谱参数

待测样品中7种拟除虫菊酯类农药的定量：

(1)配置混标储备液：分别量取7种拟除虫菊酯类农药及其内标物的单标，用色谱级乙腈定容于10mL容量瓶中，配制成各物质浓度约为1mg/L的混标储备液。

(2)制作标准曲线：将配置的混标储备液量取，用色谱级乙腈逐级等倍稀释，得到0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/L的5个不同浓度的7种拟除虫菊酯类农药的混标样，5.0μg/L的内标浓度，依次对每一浓度的混标样进行检测，以拟除虫菊酯类药物内外标面积之比为纵坐标Y，拟除虫菊酯类物质质量浓度为横坐标X，绘制得到7条标准曲线。具体参数见表3，谱图及标准曲线见图2。

表3基质标准曲线

由上表可知：所述淡水鱼、淡水虾中7种拟除虫菊酯类物质在15min内实现分离，在0.5-10μg/L的检测范围内具有良好的线性关系，其相关系数R

(3)测定淡水鱼、淡水虾样品：取处理好的淡水鱼、淡水虾进样检测，将检测所得到的峰面积代入相应物质的标准曲线，分析计算得到7种拟除虫菊酯类药物在淡水鱼、淡水虾中的含量。检出样品质谱谱图见图3所示，结果如下表4所示。

表4样品中7种拟除虫菊酯类药物的含量(单位：μg/L)

(备注：ND表示未检出)

由上表4可知，甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯在所述10批次淡水鱼、淡水虾中被检测到，其余4种拟除虫菊酯类药物未检出。其中检出浓度最高达到18.309μg/L，折算样品中被测物残留量36.618μg/kg。