一种蛋白互作检测系统及其应用与检测蛋白互作的方法

技术领域

本发明属于蛋白互作技术领域，尤其涉及一种蛋白互作检测系统及其应用与检测蛋白互作的方法。

背景技术

蛋白质作为生命体的基本组分，是细胞功能的最终执行者。研究蛋白质—蛋白质相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)在细胞通讯中起着重要作用，蛋白质的磷酸化、乙酰化和降解都依赖于目标蛋白质与其修饰酶之间的物理相互作用。因此，建立的监测PPI的方法具有重要意义。

酵母双杂交是目前应用最广泛蛋白互作检测方法，由于其完全在酵母中进行，在植物细胞中不能反映真实情况，假阳性率高。对于体内相互作用，免疫共沉淀是最常用的检测方法，它需要高质量的抗体来免疫沉淀感兴趣的蛋白，并且不能排除间接蛋白互作的可能性，实验过程复杂。基于报告基因的重组分析极大地推进了体内蛋白互作的检测，主要有荧光共振能量转移(FRET)、双分子荧光互补(BiFC)和萤火虫荧光素酶互补成像(LCI)测定。FRET和BiFC需要特定的显微镜来检测荧光信号，并且难以量化相互作用强度，且BiFC测定会导致假阴性和假阳性的发生。LCI需要加入荧光素底物反应后发光，PPI强度需要通过活体分子成像系统检测荧光素酶活性的值来确定，荧光强度定量分析则需要荧光素酶活性检测试剂盒。总体来讲，由于目前蛋白互作的检测方法假阳性高、需要精密的仪器或特定的标记和对实验者的技术要求较高，因此，亟需提供一种成本低廉的可视化蛋白互作检测系统。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蛋白互作检测系统及其应用与检测蛋白互作的方法，利用该蛋白互作检测系统通过肉眼即可观察到蛋白是否互作，无需任何仪器。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种蛋白互作检测系统，所述检测系统包括35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒；

所述35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒的构建方法包括以下步骤：

(1)从pDR5:RUBY质粒上扩增出CYP76AD1-2A-DODA片段，使用同源重组方法将CYP76AD1-2A-DODA片段与pCAMBIA3301质粒连接，得到p35S:C2D质粒；

(2)从pYL322d1/N-eGFP质粒上扩增出P

(3)从pDR5:RUBY质粒上扩增出N-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将N-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D质粒连接，得到35S:NGlut质粒；

(4)从pDR5:RUBY质粒上扩增出C-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将C-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D连接，得到35S:CGlut质粒。

优选的，所述CYP76AD1-2A-DODA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述P

本发明还提供了一种上述蛋白互作检测系统在检测蛋白互作中的应用。

本发明还提供了一种利用上述的蛋白互作检测系统检测蛋白互作的方法，包括以下步骤：

S1、将待检测蛋白X连接到所述35S:NGlut质粒上，得到35S-NGlut-X质粒；将待检测蛋白Y连接到所述35S:CGlut质粒上，得到35S-CGlut-Y质粒；

S2、分别将35S-NGlut-X质粒和35S-CGlut-Y质粒转入到农杆菌感受态细胞，得到含有35S-NGlut-X的农杆菌a和含有35S-CGlut-Y的农杆菌b中；

S3、分别将农杆菌a和农杆菌b培养后混合，得到混合物A，将混合物A注射至本氏烟草中，通过甜菜红素的颜色变化来判断两个待测蛋白是否发生互作。

优选的，所述农杆菌a与农杆菌b的体积比为1:1。

优选的，所述待检测蛋白X连接到所述35S:NGlut质粒的限制性酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。

优选的，所述待检测蛋白Y连接到所述35S:CGlut质粒的限制性酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。

优选的，所述判断方法为如果注射烟草的位置产生红色，则两个待检测蛋白发生互作，如果注射烟草的位置不产生红色，则两个待检测蛋白不发生互作。

优选的，所述农杆菌包括GV3101，EHA105或LBA4404菌株。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种蛋白互作检测系统及其应用与检测蛋白互作的方法，本发明利用检测系统通过肉眼即可观察到蛋白是否互作，无需任何仪器。本发明借助本氏烟草，利用甜菜红素的颜色反应来判断待测蛋白是否互作，该检测蛋白互作的方法操作简单，可以进行活体内检测蛋白互作等优点，并且甜菜红素的颜色可以用肉眼直接观察，无需任何仪器，大大降低实验成本及对高精度仪器的依赖，对实验操作者没有特殊的要求。

附图说明

图1为构建p35S:C2D质粒的电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1～2为CYP76AD1-2A-DODA片段扩增结果；泳道3～4为pCAMBIA3301质粒Nco I单酶切回收结果；b中M为DL2000，泳道1～8为含p35S:C2D质粒的菌液PCR产物的检测结果，泳道9为阳性对照，泳道10为阴性对照；

图2为构建P35S-eGFP-p35S:C2D质粒电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1为P

图3为构建35S:NGlut质粒电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1为N-Glucosyltransferase片段扩增结果；泳道2为P35S-eGFP-p35S:C2D质粒Sma I单酶切回收结果；b中M为DL2000，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3～10为含35S:NGlu的菌液PCR产物的检测结果；

图4为构建35S:CGlut质粒电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1～3为C-Glucosyltransferase片段扩增结果；泳道4为P35S-eGFP-p35S:C2D质粒Sma I单酶切回收情况；b中M为DL2000，泳道1～8为含35S:CGlut质粒的菌液PCR产物的检测结果，泳道9为阳性对照，泳道10为阴性对照；

图5为构建35S-NGlut-AtCIPK9质粒电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1为AtCIPK9基因片段扩增结果；泳道2为35S:NGlut质粒Sma I单酶切回收情况；b中M为DL2000，泳道1～5为含35S-NGlut-AtCIPK9质粒的菌液PCR产物的检测结果，泳道6为阳性对照，泳道7为阴性对照；

图6为构建35S-CGlut-AtCBL3质粒电泳图，其中a中M为DL2000，泳道1为AtCBL3基因片段扩增结果；泳道2为35S:CGlut质粒Sma I单酶切回收情况；b中M为DL2000，泳道1～9为含35S-CGlut-AtCBL3质粒的菌液PCR产物的检测结果，泳道10为阳性对照，泳道11为阴性对照；

图7为利用实施例1所述的检测系统检测AtCIPK9蛋白和AtCBL3蛋白互作的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种蛋白互作检测系统，所述检测系统包括35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒；

所述35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒的构建方法包括以下步骤：

(1)从pDR5:RUBY质粒上扩增出CYP76AD1-2A-DODA片段，使用同源重组方法将CYP76AD1-2A-DODA片段与pCAMBIA3301质粒连接，得到p35S:C2D质粒；

(2)从pYL322d1/N-eGFP质粒上扩增出P

(3)从pDR5:RUBY质粒上扩增出N-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将N-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D质粒连接，得到35S:NGlut质粒；

(4)从pDR5:RUBY质粒上扩增出C-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将C-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D质粒连接，得到35S:CGlut质粒。

在本发明中，从pDR5:RUBY质粒上扩增出CYP76AD1-2A-DODA片段，使用同源重组方法将CYP76AD1-2A-DODA片段与pCAMBIA3301质粒连接，利用化转法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序，将测序正确的质粒命名为p35S:C2D。本发明采用PCR方法进行扩增，所述PCR扩增程序如下：预变性95℃5min；变性95℃30s，55℃30s，72℃2.5min，32个循环；72℃10min。所述CYP76AD1-2A-DODA片段优选的连接到pCAMBIA3301质粒上的NcoⅠ酶切位点和NOS终止子之间，替换pCAMBIA3301质粒上的GUS片段。所述CYP76AD1-2A-DODA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.9所示。

在本发明中，从pYL322d1/N-eGFP质粒上扩增出P

在本发明中，从pDR5:RUBY质粒上扩增出N-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将N-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D质粒连接，利用热击法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序，将测序正确的质粒命名为35S:NGlut。本发明采用PCR方法进行扩增，所述PCR扩增程序如下：预变性95℃5min；变性95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，32个循环；72℃10min。所述N-Glucosyl transferase片段优选的连接到P35S-eGFP-p35S:C2D质粒的多克隆位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。所述N-Glucosyl transferase片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.11所示。

在本发明中，从pDR5:RUBY质粒上扩增出C-Glucosyl transferase片段，使用同源重组方法将C-Glucosyl transferase片段与P35S-eGFP-p35S:C2D质粒连接，利用热击法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序，将测序正确的质粒命名为35S:CGlut。所述C-Glucosyl transferase片段优选的连接到P35S-eGFP-p35S:C2D质粒的多克隆位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。所述C-Glucosyl transferase片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供了一种上述蛋白互作检测系统在检测蛋白互作中的应用。

本发明还提供了一种利用上述的蛋白互作检测系统检测蛋白互作的方法，包括以下步骤：

S1、将待检测蛋白X连接到所述35S:NGlut质粒上，得到35S-NGlut-X质粒；将待检测蛋白Y连接到所述35S:CGlut质粒上，得到35S-CGlut-Y质粒；

S2、分别将35S-NGlut-X质粒和35S-CGlut-Y质粒转入到农杆菌感受态细胞，得到含有35S-NGlut-X的农杆菌a和含有35S-CGlut-Y的农杆菌b中；

S3、分别将农杆菌a和农杆菌b培养后混合，得到混合物A，将混合物A注射至本氏烟草中，通过甜菜红素的颜色变化来判断两个待测蛋白是否发生互作。

在本发明中，所述农杆菌a与农杆菌b的体积比为1:1。所述待检测蛋白X连接到所述35S:NGlut质粒的多克隆位点处的限制性酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。所述待检测蛋白Y连接到所述35S:CGlut质粒的多克隆位点处的限制性酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ之间。所述判断方法优选为如果注射烟草的位置产生红色，则两个待检测蛋白发生互作，如果注射烟草的位置不产生红色，则两个待检测蛋白不发生互作。所述农杆菌优选的包括GV3101，EHA105或LBA4404菌株。

在本发明中，本发明借助烟草瞬时表达系统，将含有融合蛋白的表达载体转化农杆菌后注射烟草叶片。24～48小时后，利用肉眼即可观察到甜菜红素的颜色变化，以判定未知蛋白是否发生互作，同时可以利用水溶液提取甜菜红素，通过分光光度计测定吸光度，计算甜菜红素的含量，以此判定蛋白互作的强弱。本发明的检测蛋白互作的方法只需要构建载体，肉眼观察及一台普通的分光光度计即可完成。因此，本发明所述检测方法花费低廉，不需要精密和高端的仪器，对实验操作者没有特殊的要求。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下的实施例中，所述pDR5:RUBY质粒由南京农业大学和玉兵馈赠，pYL322d1/N-eGFP质粒及pCAMBIA3301质粒均购自addgene网站。

实施例1

一种蛋白互作检测系统，所述检测系统包括35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒。

其中，所述35S:NGlut质粒和35S:CGlut质粒的构建方法包括以下步骤：

(1)设计用于同源重组的嵌合引物P1和P2(具体序列参见表1)，利用PCR的方法从pDR5:RUBY质粒上扩增出CYP76AD1-2A-DODA片段，目的片段长度2410bp，50μLPCR体系包括：ddH

将步骤(1)制备得到的CYP76AD1-2A-DODA片段与pCAMBIA3301质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，将阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图1所示，含有p35S:C2D质粒的菌液中成功扩增出CYP76AD1-2A-DODA片段。

通过测序结果，所述CYP76AD1-2A-DODA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

(2)设计用于同源重组的嵌合引物P3和P4(具体序列参见表1)，使用PCR方法从pYL322d1/N-eGFP质粒上扩增出P

将步骤(2)制备得到的P35S-eGFP-T35S片段与p35S:C2D质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，将阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图2所示，含有P35S-eGFP-p35S:C2D质粒的菌液中成功扩增出P

通过测序结果，所述P

(3)设计用于同源重组的嵌合引物P5和P6(具体序列参见表1)，使用PCR方法从pDR5:RUBY质粒上扩增出N-Glucosyl transferase片段，目的片段长度1029bp，50μL PCR体系包括：ddH

将步骤(3)制备得到的N-Glucosyl transferase片段与35S:NGlut质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图3所示，含有35S:NGlut质粒的菌液中成功扩增出N-Glucosyl transferase片段。

通过测序结果，所述N-Glucosyl transferase片段的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

(4)设计用于同源重组的嵌合引物P7和P8(具体序列参见表1)，使用PCR方法从pDR5:RUBY质粒上扩增出C-Glucosyl transferase片段，目的片段长度939bp，50μL PCR体系包括：ddH

表1引物序列信息

将步骤(4)制备得到的C-Glucosyl transferase片段与35S:CGlut质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图4所示，含有35S:CGlut质粒的菌液中成功扩增出C-Glucosyl transferase片段。

通过测序结果，所述C-Glucosyl transferase片段的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

实施例2

本实施例所采用的待检测蛋白为AtCIPK9片段和AtCBL3片段，所述AtCIPK9片段的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述AtCBL3片段的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。其中AtCIPK9和AtCBL3能够互作。

一种利用实施例1所述的检测系统检测蛋白互作的方法，包括以下步骤：

(1)设计用于同源重组的嵌合引物P9和P10(具体序列参见表2)，使用PCR方法从拟南芥cDNA上扩增出AtCIPK9片段，目的片段长度1373bp，50μLPCR体系包括：ddH

将步骤(1)制备得到的AtCIPK9片段与35S-NGlut-AtCIPK9质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图5结果表明，35S-NGlut-AtCIPK9质粒成功扩增出AtCIPK9基因片段。

通过测序结果，所述AtCIPK9基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

(2)设计用于同源重组的嵌合引物P11和P12(具体序列参见表2)，使用PCR方法从使用PCR方法从拟南芥cDNA上扩增出AtCBL3片段，目的片段长度710bp，50μL PCR体系包括：ddH

将步骤(2)制备得到的AtCBL3片段与35S-CGlut-AtCBL3质粒连接产物转化DH5α大肠杆菌，37℃复苏1h，取100μL菌液涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基过夜生长，通过菌液PCR验证阳性转化子，菌液PCR验证阳性转化子，阳性转化子扩大培养，提取质粒，取10μL质粒，交由华大基因进行测序。

由图6结果表明，35S-CGlut-AtCBL3质粒成功扩增出AtCBL3基因片段。

通过测序结果，所述AtCBL3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

分别将质粒35S-NGlut-AtCIPK9和35S-CGlut-AtCBL3利用热击法转入农杆菌GV3101感受态细胞，具体转化过程是：取1管-80℃保存的农杆菌感受态细胞，冰上溶解，取3μg的质粒加入到100μL GV3101感受态细胞中，轻轻用枪吸打3～4下混匀。冰浴20min，将感受态细胞迅速轻轻放到飘板上，液氮中放置5min，迅速拿出飘板，放入37℃水浴5min，然后迅速放入冰中，冰浴5min，然后加入600μL LB液体培养基，28℃，170rpm培养4h，常温6000rpm离心2分钟，去上清600μL，用剩余的液体轻轻混匀沉淀，全部涂板在含50mg/L Kana和50mg/L利福平的LB平板上，28℃倒置培养48～72h，出现单菌落，挑单菌落摇菌做菌液PCR检测阳性克隆。将两种鉴定阳性的农杆菌摇菌到OD

表2引物序列

图7的结果表明，将含有35S-NGlut-AtCIPK9质粒的农杆菌和含有35S-CGlut-AtCBL3质粒的农杆菌，等量混合，注射本氏烟草叶片，由于AtCIPK9和AtCBL3互作，导致35S-NGlut-AtCIPK9质粒上的NGlut片段和35S-CGlut-AtCBL3质粒上的CGlut片段距离拉近，重新产生葡糖基转移酶活性，同时35S-NGlut-AtCIPK9和35S-CGlut-AtCBL3质粒上又有CYP76AD1和DODA酶，当烟草叶片中同时存在着三种酶的时候，就能合成甜菜红素，产生红色，因此，本发明的系统可以检测蛋白互作。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。