一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组载脂蛋白J、制备方法及应用。

背景技术

载脂蛋白J(Clusterin)最早是从公羊的睾丸中分离的，因能促进Sertoli细胞的凝集，支持精子的成熟和发展，所以又被命名为凝集因子或丛集素，其在组织中广泛表达，是人体中发现的第一个分泌型大分子伴侣，与抑制细胞凋亡、灭活补体因子、脂质的回收和转运、细胞膜的保护以及维持细胞间或细胞与基质间的联系等多种生理和病理进程密切相关。

载脂蛋白J于1989年从人类血浆中首次分离得到，经mRNA指导前体多肽链合成后，酶解去除分泌信号肽并断裂形成α、β链，两条链反向平行由5个二硫键联接，经过糖基化修饰形成异二聚体硫酸化糖蛋白，包括449个氨基酸，包括糖基，其分子量约75-80kDa；载脂蛋白J作为大分子伴侣，可通过自身的双亲基团与体内变性蛋白非共价结合，使变性蛋白保持溶解状态并经由正常代谢渠道降解清除，维持体内蛋白质代谢的动态平衡。同时可结合特定蛋白而具有抗炎和抑制免疫反应的功能，并可能与细胞受体结合而参与调节细胞凋亡和增殖。

由于其自身的多功能特性，载脂蛋白J参与体内多种病生理过程，对许多早中期疾病的发展有抑制作用，例如对多种早中期蛋白淀粉样变疾病、心血管疾病、眼部疾病等都有缓解和治疗作用，被国内外主流科学家认为是一种潜在的治疗性药物。

虽然载脂蛋白J在人体内广泛存在，但提取至药用级别的成本极高。即使不考虑纯度等指标能否合格，仅提取单个药用剂量就可能需要几千公升的人血，显然无法实现规模化生产，因而载脂蛋白J的重组、体外表达成为国内外科学界研究重点。为了确保其生物活性，现有的重组载脂蛋白J均保留原有的5对二硫键，如申请号202010644415.8、201580074616.6公开的多肽序列，在纯化时易发生错配和被还原而形成杂质，复性难度大且最终纯化收率极低；若利用蛋白标签进行分离纯化，最终得到的带有标签的重组蛋白难以符合药规要求而无法成药，这是实现其工业化生产的最大障碍之一。

因此，如果能够开发一种具备商业化大规模生产潜力的保留原有功能的重组载脂蛋白J作为临床治疗药物，那么将在多种疾病的临床治疗上提供重要的药物治疗手段，对现有的临床医学产生重大影响。

发明内容

本发明解决的问题是克服了现有重组载脂蛋白J的结构复杂性，在保持了重组载脂蛋白J生物学功能的前提下，使得重组载脂蛋白J的后续纯化操作简单化，并可实现重组载脂蛋白J的产业化。

为解决上述问题，本发明提供一种重组载脂蛋白J，包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。

优选的，所述一级序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:1一致。

优选的，两个所述半胱氨酸中的一个位于SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位氨基酸位点中的一个上，另一个位于SEQ ID NO:1的第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点中的一个上。

优选的，所述SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位、第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸或半胱氨酸。

优选的，所述氨基酸一级序列包括SEQ ID NO:4-28。作为本发明的一个示例，所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上。或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第99位和第273位氨基酸位点上，或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第94位和第280位氨基酸位点上，或者所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第91位和第283位氨基酸位点上，所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第80位和第291位氨基酸位点上，优选的，所述SEQ ID NO:1第91位、第94位、第99位、第107位、263位、第273位、第280位、第283位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸，所述SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上为半胱氨酸。

优选的，所述重组载脂蛋白J还包括与SEQ ID NO:1的N端相连的信号肽序列，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。优选的，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2。

相对于现有技术，本发明所述重组载脂蛋白J具有下述有益效果：(1)所述重组载脂蛋白J仅保留一对二硫键使分离纯化工艺简单可靠，可重复性强，终产率高；不带有标签，可以纯化达到国家规定的药用纯度，其体外活性与真核表达载脂蛋白J相当，动物实验中针对多种适应症均表现出明显功能和疗效；(2)对于二硫键位置及信号肽序列进行研究，进一步改善其复性效果且表达量更高；(3)首次实现符合药规要求的的重组载脂蛋白J的工业化大批量生产。

本发明还提供了一种药物组合物，包含上述的重组载脂蛋白J，及其药学上可接受的辅料。优选的，所述组合物为水溶液或冻干粉。

本发明还提供了一种被分离的多聚核苷酸分子，包含编码如上所述的重组载脂蛋白J的核苷酸序列。优选的，所述编码载脂蛋白J的核苷酸序列可操作地连接在一个启动子上，所述启动子是在真核细胞或原核细胞内发挥功能的基因启动子。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含编码如上所述重组载脂蛋白J的多聚核苷酸分子。优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选的，所述原核细胞为细菌细胞，所述真核细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞或酵母细胞。

本发明还提供了一种制备重组载脂蛋白J的方法，包括：步骤1)、表达编码如上所述重组载脂蛋白J的多聚核苷酸分子；步骤2)、从表达细胞中提取、纯化所表达的多肽。

优选的，步骤2)包括：S21菌体破碎并分离包涵体；S22、包涵体洗涤、溶解；S23、离子交换层析；S23、稀释复性；S24、超滤浓缩并换液或硫酸铵沉淀并换热；S25、分子筛层析。

本发明还提供了上述的重组载脂蛋白J在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。进一步的，所述疾病包括心血管疾病、蛋白淀粉样变性疾病、眼表疾病。

所述疾病还包括阿尔茨海默症、酒精中毒、男性不育等。其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化症、缺血性心脏病、冠心病、心脑梗、高血脂症、高胆固醇症、高血压、高血糖、慢性心力衰竭、缺血性心力衰竭、冠心病性心力衰竭、血管内斑块沉积等。所述蛋白淀粉样变性疾病，包括轻链(AL)、重链(AA)、血清淀粉样蛋白(SAA/AA)、甲状腺素转运蛋白(TTR)的原发和继发性蛋白淀粉样变性疾病、干眼症等眼部疾病。

更进一步的，所述疾病是基因缺陷型疾病。疾病的患者包括体内载脂蛋白J低于正常值的患者、体内载脂蛋白J出现遗传变异的患者、体内载脂蛋白J功能不全的患者、体内高密度脂蛋白(HDL)偏高或正常的患者、体内低密度脂蛋白(LDL)偏高或正常的患者、体内ApoA偏高或正常的患者、体内ApoA偏高或正常，ApoB偏高或正常的患者、体内ApoA偏高或正常，胆固醇偏高或正常的患者、体内ApoA偏高或正常，ApoB偏高或正常，胆固醇偏高或正常的患者、高密度脂蛋白或ApoA偏低的患者、体内低密度脂蛋白偏高或正常，以及/或ApoB偏高或正常，以及/或胆固醇偏高或正常，以及/或甘油三酯偏高或正常的患者、体内血糖偏高的患者、高血压患者、动脉粥样硬化患者、动脉硬化和小动脉硬化患者、心肌梗塞症状的患者、心肌梗塞发作之后的患者、脑血管梗塞症状的患者、脑血管梗塞发作之后的患者、冠心病或有冠心病症状的患者、慢性心力衰竭患者、心力衰竭症状的患者、阿尔茨海默症患者、酒精中毒患者、因乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶表达水平低下和/或功能缺失所导致的临床疾病患者、有生育障碍的患者。

再进一步的，所述的重组载脂蛋白J在制备治疗皮肤病、创口的药物以及长寿药、保健药以及提高免疫力药物上的应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中重组载脂蛋白J在稀释复性前、后的电泳图；

图2为本发明实施例2中经纯化后不同重组载脂蛋白J样品的电泳图；

图3为本发明实施例4中GST加入重组载脂蛋白J后在加热条件下的OD360结果；

图4为本发明实施例4中IgG加入重组载脂蛋白J在加热条件下的OD360结果；

图5为本发明实施例4中加入不同重组载脂蛋白J后人血清的电泳图；

图6为本发明实施例5中不同样品处理后的泪液分泌统计图；

图7为本发明实施例6中不同样品对应的角膜HE染色图；

图8为本发明实施例6中不同样品对应的结膜PAS染色图；

图9为本发明实施例7中不同样品对应的角膜上皮愈合率统计图；

图10为本发明实施例7中不同样品对应的角膜HE染色图；

图11为本发明实施例7中经不同样品处理后Ki67、E-cadherin、PMN、F4/80免疫荧光染色及统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。首先应说明的是，下述实验例中的数据是由发明人通过大量实验获得，限于篇幅，在说明书中只展示其中的一部分，且本领域普通技术人员可以在此数据下理解并实施本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些改动或修改同样落于本申请所保护的范围。

蛋白质的功能与其空间结构密切相关，而五对二硫键通常被认为是维持载脂蛋白J的空间结构所必需的，如申请号202010644415.8、201580074616.6中要求保护的氨基酸序列均还有10个半胱氨酸，其空间结构均形成五对二硫键使其提取、纯化难度极大，在原核表达时复性时易发生错配，而真核表达时二硫键易被还原存在产品一致性问题，尚无法实现工业化生产。目前市场上仅有带标签的高纯度载脂蛋白J，但因不符合药规而无法成药。

发明人意外的发现仅一对二硫键的重组载脂蛋白J(以下简称rClu)同样保留了天然载脂蛋白J的生物活性，同时能分离纯化至高纯度的药用级别(＞95％)并具备工业化生产的高产率(＞10％)特点。如本发明制备的仅存在一对二硫键的rClu在体外实验和动物实验中均表现出明显的功能和疗效，例如可抑制蛋白变性聚集沉淀以及抑制MMP9活性并在动物实验中表现出明显疗效，临床应用价值高。

具体的，将氨基酸序列SEQ ID NO:1中10个半胱氨酸通过点突变后仅保留2个半胱氨酸而成为rClu，对应形成二硫键的数量由5对变成1对，在真核表达时可避免二硫键被还原而形成混合物，而在原核表达时的复性率(＞50％)显著提高，同时降低了二硫键错配率。本申请所述的重组载脂蛋白J-rClu在真核表达时也将形成双亚基结构，但两个亚基之间将由一对链间二硫键联接；而在原核系统表达时形成单亚基，有一对链内二硫键形成环状结构。

实施例1重组载脂蛋白J的表达

根据SEQ ID NO:4-28及SEQ ID NO:2-3进行密码子优化后进行DNA序列合成并以粘性末端插入质粒pET-30a(+)中，将其导入宿主细胞BL21(DE3)中，利用IPTG进行诱导表达，菌体破碎后离心收集包涵体，经洗涤、抽提后跑电泳并进行灰度扫描以对其定量分析，并计算蛋白表达量，结果见表1。相关DNA合成、重组质粒构建及导入宿主细胞并表达均为现有技术，在此不进行赘述。

表1不同序列的表达量结果

由上表可知，在SEQ ID NO:4-28的N端添加SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，之后构建的重组质粒的表达量明显提高，且以同时含有SEQ ID NO:24及其N端连接SEQ ID NO:2的重组质粒，最终的蛋白表达量最高；根据其他序列构建的重组质粒导入宿主细胞进行表达时，具有类似结果。

实施例2重组载脂蛋白J的制备

一种重组载脂蛋白J的制备方法，包括:

S1、菌体破碎并分离包涵体

(1)将菌体(SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:24)按照1g/10mL的50mM pH 8.0的Tris-HCl溶液充分重悬，低温(如4℃)环境下以8000rpm离心15min，弃上清；(2)再次以1g/10mL加入上述溶液进行重悬操作，之后将菌悬液置于超声破碎仪探头进行破碎操作15min，操作参数为：功率400W，超声3s，间歇6s，在低温(如4℃)环境下以15000rpm离心30min，收集沉淀。

S2、包涵体洗涤、溶解；

(1)向收集的沉淀中以1g/10ml加入洗涤溶液，所述洗涤液为：50mM Tris-HCl，2MNaCl，2mM EDTA，pH 8.0，低温(如4℃)下震荡孵育1h，之后以15000rpm离心30min，再次收集沉淀；(2)按照1g/10ml加入溶解液进行溶解变性40min，所述溶解液为8M尿素+20mM二硫代苏糖醇，之后以15000rpm离心20min，收集上清液。

S3、离子交换层析

采用色谱柱POROS HQ进行上柱层析，用缓冲液A(50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mMDDT，pH 9.0)进行洗涤，再用缓冲液B(50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mM DDT，1MNaCl，pH9.0)进行洗柱并收集流出液；收集液经脱盐换液后采用色谱柱POROS XS进行上柱层析，用缓冲液C(20mM醋酸钠，8M尿素，10mM DDT，pH 5.5)进行洗涤，再用缓冲液D(20mM醋酸钠，8M尿素，10mM DDT，1M NaCl，pH 5.5)进行洗柱并收集流出液。

S4、稀释复性；

取步骤S3获取的收集液，加入15倍(V/V)的稀释缓冲液后，在4℃下孵育24小时。所述稀释缓冲液为1％CHAPS+500mM NaCl+500mMArg+0.5％山梨醇+0.01mM GSSH+50mM Tris-HCl pH 9.0，或者为500mMArg+0.5％山梨醇+0.00001mM CuCl

原核表达蛋白复性后形成聚合体与单体，复性率用蛋白质电泳灰度扫描单体进行初步评判，再由第三方的二硫键定位分析和自由巯基分析结果来最终确定复性率。如图1所示，具有五对二硫键的rClu-即样品rAJ-1通过稀释复性的复性率约为8％，带有二对二硫键的rClu-即样品rAJ-3通过稀释复性的复性率约为10％，本申请制备rAJ-6-1样品通过稀释复性的复性率≥50％，复性率显著提高；具有两对以上二硫键的rClu通过稀释复性易发生错配，生物活性极低；若采用G25柱上复性，其收率更低。需要说明的是：其中还原处理就是加入大量巯基乙醇使蛋白样品二硫键完全打开，非还原处理则是不加巯基乙醇。

S5、换液后分子筛层析；

步骤S4得到的复性后溶液经过硫酸铵沉淀或超滤浓缩后置换为磷酸盐缓冲体系(pH7.4)并进行分子筛柱层析，分子筛凝胶填料采用GE Superdex S200，或博格隆Chromda200PG，得到样品rAJ-6-1。

经分析，样品rAJ-6-1的纯度＞95％，纯化总得率为10.2％；样品rAJ-6-2(SEQ IDNO:25)、AJ-6-3(SEQ ID NO:26)经上述步骤纯化后具有相类似的结果。需要说明的是：通过密码子优化得到含有两对二硫键的rClu-即rAJ-3以及含五对二硫键的的rClu(如SEQ IDNO:1)--即rAJ-1在表达后通过上述方法纯化最终样品的收率分别为0.55％、0.25％，纯度分别为61.6％、62.4％远低于本申请且为混合物，无法成药，电泳结果见图2。

真核表达蛋白无需进行复性，可直接由重组载脂蛋白J宿主细胞(例如CHO)培养液提纯，经由上述离子交换和分子筛柱层析纯化，得到分子量不均一的真核表达载脂蛋白J混合物。

实施例3二硫键位置对复性结果的影响

分别以SEQ ID NO:8、12、16、20、24构建重组质粒，表达后按照实施例2的方法进行稀释复性，结果见表2。

表2二硫键位置对复性率的影响

通常蛋白的空间结构能够影响其生物活性及免疫原性，而在上述位点形成的五对二硫键是天然rClu维持蛋白质空间结构发挥其生物活性所必需的；而本申请首次发现，通过将氨基酸序列中十个半胱氨酸中的八个突变成甘氨酸后，形成具有一对二硫键的rClu仍能够具有良好的生物活性；同时二硫键的位置能够显著影响稀释复性的复性率，当半胱氨酸在第107位、第263位时-即SEQ ID NO:24的rClu复性率最高，效果最好。

实施例4体外活性实验

4.1对谷胱甘肽巯基转移酶(GST)热聚集的抑制作用

载脂蛋白J作为人体内主要分泌型大分子伴侣之一，其首要功能即为与变性蛋白结合，保持变性蛋白的溶解状态，从而清除变性蛋白。本实施例采用的方法是国内外广泛使用的载脂蛋白J体外活性测试标准方法。

测试原理：谷胱甘肽巯基转移酶(GST)受热易聚集致使其溶液OD360升高，加入Clu或rClu可使GST的热聚集被抑制，以GST受热时OD360的变化来反映Clu对GST热聚集的抑制程度，从而得出Clu的体外活性。

实验过程：分别取rAJ-1、rAJ-3、rAJ-6-1以及市售rAJ产品(真核生物表达，含his-tag标签，北京百普赛斯生物科技有限公司)进行实验，相关检测方法参考申请号202010101385.6中实施例1中1.1、1.2，结果见表3及图3。

表3加热条件下不同样品的吸光度

实验发现，当GST与rClu质量比为1.0：0.4时，GST的热聚集基本上可被rAJ-6-1完全抑制，而相同条件下，样品rAJ-1、rAJ-3、真核rAJ样品对GST的热聚集抑制效果较差，其中真核rAJ为市售高纯度带标签产品。

通过加热方式使蛋白变性以模拟人体内蛋白代谢失调而发生的蛋白变性，申请人发现rClu可抑制多种天然蛋白的热聚集，如人免疫球蛋白IgG。采用类似实验方法发现，恒定终浓度(1mg/ml)和终体积的人IgG受热反应体系(IgG+磷酸盐缓冲液pH7.4)，当加入rClu后同样对IgG加热至80℃持续5分钟的热聚集存在有效抑制，如图4所示。

4.2对MMP9酶活性的抑制作用

人体内炎症反应可导致MMP9分泌量上升，对局部组织结构会产生破坏作用；MMP9也是角膜表面主要的基质降解酶之一，在眼表疾病如干眼症患者的泪液中观察到MMP-9的密度和活性增加，在小鼠和人类中被认为是干燥应激导致眼表屏障破坏的原因介质。而载脂蛋白J是MMP9的天然抑制剂，可抑制MMP9酶活性，因而载脂蛋白J是人体内应对炎症反应的天然措施之一。

采用酶谱法(Zymography)利用MMP9测试试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)来测定MMP9酶活性来反映rClu的抑制作用，以人血清为对照，将加入rAJ-6-3、rAJ-1的人血清在含有明胶的SDS-Page凝胶中电泳，之后将凝胶与酶反应缓冲体系孵育，激活MMP9降解电泳胶上的明胶，再进行凝胶染色和脱色。有MMP9活性的条带由于明胶被降解而形成透亮区域，而分布于其它位置没有被降解的明胶形成深色背景，从而可对透亮条带进行扫描而换算出MMP9酶活性，结果见表4、图5。

具体实验方法同《优化明胶酶谱法检测自发性高血压大鼠血浆MMP-2和MMP-9活性》，李炳蔚等，2013，基础医学与临床，845-848页。

表4不同样品对MMP-9灰度峰面积的影响

由上表可知，本发明制备的样品rAJ-6-3对MMP9酶活性的抑制作用至少与样品rAJ-1相当，生物活性好甚至更优。

实施例5体内活性实验一-东莨菪碱诱发干眼症

载脂蛋白J是人泪液中的蛋白成分之一，对眼表组织有保护作用。在发生眼表疾病如干眼症时，泪液中天然载脂蛋白J总量严重下降，难以承担原有的保护作用。在发生眼表疾病时，本发明重组载脂蛋白J可作为滴眼液补充眼表组织的天然载脂蛋白J，通过与泪膜粘蛋白结合，对粘蛋白层进行修补，并可能通过眼角结膜上皮细胞表面受体调节细胞凋亡和/或细胞增殖信号通路，促进眼角结膜上皮细胞增殖，进而改善和治疗眼表疾病如各种不同病因的干眼症和眼角结膜损伤。

选取6周龄雌性C57/BL6Shijh小鼠连续5天接受低湿环境联合皮下注射东莨菪碱(2次/天，0.75mg/mL，0.3mL/只/次)诱导进行干眼造模，首次造模当天记为D

在治疗前(0d)与给药治疗后的第5d、10d、15d分别对各组小鼠用2ul 0.5％荧光素钠溶液滴眼后，并在眨眼后用生理盐水冲洗掉，通过裂隙灯拍照观察角膜荧光素钠的染色情况，每组取六只动物眼进行染色并求平均值，结果见表4。所述rClu样品利用PB缓冲液稀释rAJ-6-1、rAJ-1进行制备，相关实验及检测方法为现有技术，在此不进行赘述。

表5不同样品对荧光素钠染色评分的影响

由上表可知，本发明制备的含1对二硫键的重组rClu(rAJ-6-1)荧光染色评分下降幅度大于含5对二硫键的rAJ-1，并与市售环孢霉素滴眼液相当，对东莨菪碱联合低湿环境诱导的小鼠角膜荧光素钠染色评分升高的均表现出一定的抑制作用，作为治疗干眼症的潜在药物具有显著优势。

实施例6-体内活性实验二-苯扎氯氨诱发干眼症

载脂蛋白J是人泪液中的蛋白成分之一，对眼表组织有保护作用。在发生眼表疾病如干眼症时，泪液中天然载脂蛋白J总量严重下降，难以承担原有的保护作用。在发生眼表疾病时，本发明重组载脂蛋白J可作为滴眼液补充眼表组织的天然载脂蛋白J，通过与泪膜粘蛋白结合，对粘蛋白层进行修补，并可能通过眼角结膜上皮细胞表面受体调节细胞凋亡和/或细胞增殖信号通路，促进眼角结膜上皮细胞增殖，进而改善和治疗眼表疾病如各种不同病因的干眼症和眼角结膜损伤。

取6周龄雌性C57/BL6小鼠20只作为受试小鼠，在IVC系统中适应环境3天，0.075％苯扎氯铵(in1％PBS)局部点眼，5uL/眼，每天2次，连续7天；受试小鼠共20只，持续造模第7天结束后，对所有受试小鼠进行裂隙灯拍照和荧光染色评估，筛选造模成功小鼠15只进入后期实验。

将造模成功的15只小鼠随机分成三组，于第8天开始给药，其中组1、组2、组3分别使用PB缓冲液、玻璃酸钠滴眼液、rAJ-6-1样品(60μg/ml，通过PB缓冲液稀释制备)。每天9：00，17：00继续点用0.075％BAC，每天9：30、12：30、15：30、18：30每只眼睛滴入供试品共4次，每次每只眼睛滴入供试品2μl，持续给药7天，至第14天结束后停止给药。

分别在第1天未造模之前、第7天、第14天结束后同一时间段采用酚红棉线法测试所有受试小鼠水性泪液分泌结果见图6；实验第14天眼表检测结束后对实验小鼠实施安乐死，随即解剖取下右眼全眼并制备石蜡切片并进行HE染色、PAS染色，结果见图7、图8，所述HE染色为现有技术。

由图6可知，与造模前相比，苯扎氯铵点眼7天后小鼠泪液分泌均明显下降，表明苯扎氯铵点眼可以显著降低泪液分泌，验证了苯扎氯铵点眼诱导小鼠干眼模型构建成功。在点眼治疗7天后，组2和组3小鼠的泪液分泌量与用药之前相比较均有明显增加，且比组1显著增多，表明本发明制备的rAJ-6-1样品及玻璃酸钠滴眼液可以促进小鼠泪液分泌增多，但磷酸盐缓冲液则不会改变小鼠泪液分泌情况。

由图7可知，组1、2中角膜上皮厚度变薄，上皮细胞层数为2-3层，但组3中角膜上皮的层数仍然保持5-6层且厚度明显高于组1、组2，表明本发明制备的重组载脂蛋白J显著可以促进损伤的小鼠角膜上皮恢复。

结膜杯状细胞主要分泌黏蛋白MUC5Ac等，成为眼表泪膜的重要组成成分，使眼睑与眼球间保持一定润滑程度，减少眼睑结膜与眼球表面之间活动的摩擦力，维持结膜和角膜上皮湿润的微环境。由图8可知，与对照组相比，造模7天(D7)的杯状细胞数明显减少，在治疗7天(D14)后，组1、2、的杯状细胞数较对照组也有所下调，但与造模7天的杯状细胞数相比差异不大；组3的杯状细胞数与对照组相比差异没有统计学意义，但与造模7天(D7)相比明显增多；而在治疗第7天(D14)，组2、3与组1相比杯状细胞数有所增加，其中以组3增加最为明显，这些结果表明本发明制备的重组载脂蛋白J可显著的促进结膜杯状细胞生成。

实施例7角膜上皮损伤修复实验

载脂蛋白J是人泪液中的蛋白成分之一，对眼表组织有保护作用。在发生眼表疾病如眼角结膜损伤时，本发明重组载脂蛋白J可作为滴眼液补充眼表组织的天然载脂蛋白J，可能通过眼角结膜上皮细胞表面受体调节细胞凋亡和/或细胞增殖信号通路，促进眼角结膜上皮细胞增殖，并抑制炎症反应，进而改善和治疗眼表疾病如各种不同病因的眼角结膜损伤。

7.1实验方法

受试小鼠共25只，造模前一天先进行荧光染色，裂隙灯观察，挑选20只角膜正常且荧光染色阴性小鼠，随机分成B

造模后小鼠给药两天，每天每只眼睛滴入供试品4次，每天上午9点、12点、下午3点、6点给药，B

7.2检测与结果

7.2.1荧光素钠染色

分别在刮除后0h、12h、24h、36h用2μl 0.1％荧光素钠溶液滴眼后，并在眨眼后用生理盐水冲洗掉；通过裂隙灯拍照观察角膜荧光素钠的染色情况，采用ImageJ软件根据荧光素染色图像对伤口表面积进行定量测定，上皮创面愈合率计算为不同时间点创面闭合百分比，结果见图9。

由图9可知，与0h组相比，经过不同药物滴眼治疗12h后，五组小鼠角膜上皮创口愈合率分别为22.88％、30.17％、25.91％、26.68％、18.34％，B1-B4组小鼠角膜上皮创口愈合率无显著差异(P>0.05)，其中B2组小鼠角膜上皮创口愈合率最高，而B5组小鼠角膜上皮创口愈合率最低；治疗24h后，五组小鼠角膜上皮创口愈合率分别为81.26％、87.91％、81.89％、83.53％、69.47％，其中B5组小鼠角膜上皮创口愈合率最低，与其他组小鼠相比具有显著差异(P<0.05)；治疗36h后，五组小鼠角膜上皮创口基本完全愈合，B1-B4组小鼠角膜表面光滑，而B5组小鼠存在角膜表面粗糙，荧光素钠染色阳性的情况。上述结果表明，经治疗后，B1-B4供试品对角膜上皮损伤小鼠起到一定的修复作用，其中B2供试品治疗效果最佳。

7.2.2HE染色及免疫荧光染色

在实验第4天眼表检测结束后对小鼠实施安乐死，随即取下每组小鼠左右眼全眼球及附属组织制备冰冻切片并分别进行HE染色和免疫荧光染色，结果见图10、图11。

所述免疫荧光染色方法为：1)玻片从-80℃冰箱中取出晾干，置于冷丙酮中固定10min；2)用1×PBS冲洗三遍，每次5min；3)将0.2％TritonX-100滴加至玻片组织上，透膜20min；4)用1×PBS冲洗三遍，每次5min；5)将2％BSA滴加在玻片组织上，室温下封闭1h；6)用1％BSA稀释相应的一抗(Ki67、E-cadherin、PMN、F4/80)，待封闭结束后，滴加一抗，置于湿盒中4℃孵育过夜；7)用1×PBS冲洗三遍，每次10min；8)用1％BSA稀释相应的二抗，滴加二抗，置于湿盒中室温下避光孵育1h；9)用1×PBS冲洗三遍，每次10min；10)用DAPI复染封片。

由图10可知，与对照组相比，B

由图11可知，在滴眼治疗后，五组小鼠角膜上皮均出现了不同程度的Ki67、E-cadherin阳性表达，B

在滴眼治疗后，五组小鼠角膜基质中出现了不同程度的PMN、F4/80阳性表达，与对照组相比，五组小鼠角膜基质中PMN、F4/80阳性细胞数量均有所增加，其中B

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。