一株蜡样芽孢杆菌菌株Y9及其组合物在黄连根腐病防治中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌菌株Y9及其组合物在黄连根腐病防治中的应用。

背景技术

黄连(Coptidis rhizoma)是我国常用大宗药材，主要分布于重庆市东部、湖北省西部、湖南、陕西、贵州等地，现主产于重庆市石柱县和湖北省利川市。重庆石柱素有“黄连之乡”美誉，为鸡爪黄连(Coptis chinensis Franch.)的道地产区。在石柱，黄连是高山地区的主导产业，超过80％的农民以种植黄连为生，黄连种植收入约占农业收入的70％。近年来，黄连根腐病已严重制约石柱黄连产业的发展，平均发病率达40％，严重地块达80％-90％。病害从春季开始，夏季达到高峰，阻碍根系的生长，造成维管组织坏死，最终导致植株萎蔫死亡。受感染的黄连植物生长发育迟缓，大部分须根和主根为黑褐色，严重感染的植物枯萎坏死。据报道，黄连根腐病可由镰刀菌属(Fusarium spp.)、间座壳属(Diaporthespp.)、腐霉属(Pythium spp.)、土赤壳属(Ilyonctric spp.)等真菌引起，其中腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和燕麦镰刀菌(F.avenaceum)是报道较多的病原。

对于黄连根腐病的防治目前主要还是化学防治，而且黄连根腐病早期症状不明显，很多连农不能及时发现，在实际生产中往往出现重化学防治却轻预防的现象。但随着公众对药品安全、农药残留和环境污染认知水平的不断提升，对环境友好、绿色无公害的生物防治技术成为重要研究方向。芽孢杆菌和木霉都是研究和应用最多的生防菌剂，对很多病原真菌都有一定抑制作用。关于利用芽孢杆菌和木霉进行根腐病等土传病害的防治已有成功案例，但目前对黄连根腐病的生物防治还鲜有报道。

发明内容

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌Y9及其组合物在黄连根腐病防治中的应用，以解决目前使用化学农药防治导致的黄连农药残留问题。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一株蜡样芽孢杆菌菌株Y9及其组合物在黄连根腐病防治中的应用

所述菌株Y9于2023年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.26960；所述组合物为不同配比的HY、LY、HYJ、LYJ或HLYJ，其中，HY为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和Y9按种子菌液体积比1:5、1:2、1:1、2:1或5:1组合发酵而成；LY为深绿木霉(Trichoderma atroviride)和Y9按种子菌液体积比1:5、1:2、1:1、2:1或5:1组合发酵而成；HYJ为哈茨木霉、Y9和解淀粉芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)按种子菌液体积比1:1:1或4:1:1组合发酵而成；LYJ为深绿木霉、Y9和解淀粉芽孢杆菌按种子菌液体积比1:1:1或4:1:1组合发酵而成；HLYJ为哈茨木霉、深绿木霉、Y9和解淀粉芽孢杆菌按种子菌液体积比1:1:1:1或2:2:1:1组合发酵而成。

本发明优选的，所述哈茨木霉或深绿木霉的种子菌液浓度约为10

本发明优选的，所述哈茨木霉、深绿木霉、Y9和解淀粉芽孢杆菌的种子菌液制备过程为：

1)菌株活化：将Y9、解淀粉芽孢杆菌菌株分别接种于NA培养基上，30℃培养1-2天；将哈茨木霉、深绿木霉菌株分别接种于PDA培养基上，25℃培养5-7天；

2)发酵种子液：将步骤1)制备的活化菌株分别接种于BP液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养48h，制得种子菌液。

本发明优选的，所述发酵过程为：按体积比1：100的比例将哈茨木霉或/和深绿木霉种子菌液接种到BP液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养48h；再按相应组合比例接种Y9或/和解淀粉芽孢杆菌种子菌液，30℃、160rpm振荡培养48h，过滤收集发酵液即得。

本发明优选的，所述Y9分离自健康黄连根；所述解淀粉芽孢杆菌购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1.15674。

本发明优选的，所述黄连根腐病主要由腐皮镰刀菌(Fusarium solani)或/和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)引起。

本发明优选的，所述NA培养基的配制方法为：牛肉浸粉3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明优选的，所述PDA培养基的配制方法为：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体至烧杯中，加葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，补蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明优选的，所述BP液体培养基的配制方法为：牛肉浸粉3.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明优选的，所述芽孢杆菌菌株Y9组合物的田间使用方法为：按体积比1：10的比例将组合物稀释后，用喷雾器抵根喷淋黄连植株，施用量为10L稀释液/5m

本发明的有益效果：

本发明所述蜡样芽孢杆菌(Bacilus cereus)Y9是从健康黄连根组织中分离所得，蜡样芽孢杆菌Y9对腐皮镰刀菌和燕麦镰刀菌都有较强的抑制作用，且与哈茨木霉和解淀粉芽孢杆菌组合后，对黄连根腐病的田间防效远高于哈茨木霉可湿性粉剂。说明蜡样芽孢杆菌Y9有作为生防菌的潜力，可用于黄连根腐病的防治，有良好的应用开发前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为Y9与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的拮抗效果比较；图中，a：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和Y9与2株黄连根腐病病原菌(Fusarium solani、Fusarium avenaceum)的平板对峙结果，b：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和Y9对2株黄连根腐病病原菌菌丝生长的抑制率。

图2为Y9对其它真菌的拮抗效果，图中，a：Y9与7株病原真菌(Fusariumoxysporum，Fusarium graminearum，Fusarium fujikuroi，Clonostachys rosea，Collteotrichum fructicola，Collteotrichum gloeosporiodies and Pestalotiopsisolivacea)的平板对峙结果，b：Y9对7株病原真菌的菌丝生长的抑制率。

图3为Y9形态鉴定，图中，a：Y9在MYP平板上的形态，b：Y9在NA平板上的形态，c：Y9的革兰氏染色，d：Y9的芽孢染色。

图4为基于16S rRNA、gyrA和rpoB基因构建的芽孢杆菌分离株的系统发育树。B.mycoides-蕈状芽孢杆菌；B.toyonensis-东京芽孢杆菌；B.cereus-蜡样芽孢杆菌；B.thuringiensis-苏云金芽孢杆菌；B.wiedmannii-维兹曼芽孢杆菌；B.mobilis-运动芽孢杆菌；B.licheniformis-地衣芽孢杆菌；B.amyloliquefaciens-解淀粉芽孢杆菌；Brevibacillus laterosporus-侧孢短芽孢杆菌。

图5为Y9对黄连根腐病的盆栽防效，图中，a：不同处理组黄连的表型，b-e：分别为Mock、Fs、Fs+Y9和Y9处理30天后的黄连根，f：不同处理30天后的黄连病情指数。

图6为拮抗菌之间的相容性，图中，a：“+”表示相容的组合，“-”表示不相容的组合，JDF为解淀粉芽孢杆菌，HC为哈茨木霉，SL为深绿木霉，LS为里氏木霉；b：平板上Y9与哈茨木霉菌株相容的示例；c：平板上Y9与里氏木霉菌株不相容的示例。

图7为蜡样芽孢杆菌Y9的组合物处理后田间黄连的表型，从左至右分别为清水、HY、HYJ、HLYJ、哈茨木霉可湿性粉剂处理，连续施用3次药剂后于2023年7月2日取样拍照。

生物保藏：

将本发明分离的菌株Y9送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，命名为Y9，Y9保藏日为2023年3月30日，保藏号为CGMCC No.26960，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

菌种选择：腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)分离自石柱黄连根腐病根(First report of root rot caused by Fusarium avenaceumon Coptis chinensis in Chongqing,China，Mei et al.2021)，哈茨木霉和深绿木霉为本实验室分离保存，解淀粉芽孢杆菌购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1.15674，枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)，蜡样芽孢杆菌(CMCC(B)63303)，苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)。

主要试剂与培养基的配制：

PDA培养基：取马铃薯200g洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤液体至烧杯中，加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

NA培养基：牛肉浸粉3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。

BP液体培养基：牛肉浸粉3.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。

甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、多粘菌素B(1万单位)、50％卵黄乳液、革兰氏染色液试剂盒、芽孢染色液均购自青岛海博生物科技有限公司。

实施例1、Y9菌株的分离与筛选

将健康黄连的根用流水冲洗20min后，然后进行常规表面消毒，吸取100μL最后一次清洗根的无菌水涂布于LB培养基上，以检验表面消毒是否彻底。取1g表面消毒后的根用9mL无菌水充分研磨至匀浆状，静止10min后吸取上清液进行梯度稀释，吸取100μL各浓度梯度的悬浮液分别涂布于LB培养基上，28℃恒温培养。培养期间定期观察，根据培养基上长出的菌落大小和形态分离纯化，并保存菌种备用。

从30株健康黄连的根系中随机分离出了13株内生细菌，且涂布最后一次清洗的水未长出菌落，说明表面消毒彻底。通过PCR扩增16S rRNA并对其进行测序，结果显示这些内生细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)和科萨克氏菌属(Kosakonia spp.)。采用平板对峙培养法对分离纯化得到的13株细菌进行拮抗筛选。用内径为6mm的打孔器打取活化好的病原菌(腐皮镰刀菌)置于PDA平板的中央，采用十字交叉法在距平板中心2cm处分别滴10μL细菌悬浮液。每处理设3次重复，25℃培养5d后测量抑菌带宽度，将具拮抗作用的菌株保存备用。结果如表1所示，13株内生细菌中，Y9对腐皮镰刀菌的抑制效果最强。

表1内生菌分离株对腐皮镰刀菌的抑制作用

注：“-”表示无抑菌带。

实施例2、Y9菌株对病原真菌的拮抗效果

通过平板对峙法比较Y9与枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)和解淀粉芽孢杆菌(CGMCC1.15674)对2株黄连根腐病病原真菌的拮抗效果，以不接芽孢杆菌为对照进行同步试验。用内径为6mm的打孔器打取活化好的病原菌(腐皮镰刀菌和燕麦镰刀菌)置于PDA平板的中央，采用十字交叉法在距平板中心2cm处分别滴10μL细菌悬浮液。每处理设3次重复，25℃培养5d后测量测量菌丝直径，并计算生长抑制率。另用实验室保存的7株病原真菌(F.oxysporum,F.graminearum,F.fujikuroi,Clonostachys rosea,Collteotrichumfructicola,Collteotrichum gloeosporiodies,and Pestalotiopsis olivacea.)分别与Y9进行平板对峙。

抑制率＝(对照组菌落直径-试验组菌落直径)/对照组菌落直径×100％

结果如图1所示，Y9对腐皮镰刀菌(Fusarium solani组)和燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum组)均有明显的抑制作用，且抑制效果与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens组)相当，但明显优于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis组)。此外，Y9对另外7株病原真菌也有一定的抑制作用，对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，F.g组)抑制效果最好，抑制率达44.20％，对水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi，F.f组)的抑制率最低，仅为11.81％(图2，a～b)。

实施例3、Y9菌株的鉴定

首先进行菌株形态学的观察。对菌株进行划线培养，于30℃中培养48h，记录下菌落特征。并挑取少量菌体涂抹于载玻片上，经革兰氏染色和芽孢染色后在显微镜下观察。结果如图3所示，纯化后的Y9在MYP平板上呈粉红色，周围有白色沉淀环(图3，a)；在NA平板上呈灰白色，不透明，表面粗糙，边缘扩展状(图3，b)。Y9为革兰氏阳性芽孢杆菌，有芽孢，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列(图3，c和d)。

其次，利用细菌通用引物16S rRNA(SEQ ID No.1～2)对Y9的基因组DNA进行扩增和测序，得到的序列(GenBank登录号OP897300)与蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、东京芽孢杆菌的多个菌株同源性和序列覆盖度均为100％，难以区分。随后用芽孢杆菌鉴定常用特异性引物gyrA(SEQ ID No.3～4)和rpoB(SEQ ID No.5～6)对Y9的基因组DNA进行扩增和测序，分别获得了1020bp和742bp的片段，Genebank登录号分别为OP909708和OP909710。gyrA基因序列的比对结果与蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的多个菌株同源性和序列覆盖度均为100％；rpoB基因序列的比对结果为与苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的多个菌株，同源性均为99.87％，序列覆盖度均为95％。单个16S rRNA、gyrA和rpoB基因均难以将Y9与苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌区分，因此构建了基于多基因串联序列矩阵最优核苷酸替代模型GTR+F+I+G4构建系统发育树(图4)，结果显示菌株Y9与B.cereus CMCC P0011和B.cereus CH聚于相同进化支，贝叶斯后验概率值为0.992。

最后，参考《常见细菌系统鉴定手册》进行Y9菌株生理生化特性的试验，用蜡样芽孢杆菌标准菌(CMCC(B)63303)和苏云金芽孢杆菌标准菌(ATCC 10792)为对照进行同步试验。本发明所述蜡样芽孢杆菌Y9菌株生理生化特性试验结果见表2。由表2可知，Y9的生理生化特征与蜡样芽孢杆菌一致，且在蛋白质毒素结晶试验中，未观察到浅红色的游离芽孢和深红色的菱形晶体。

表2Y9与类似菌的生理生化测定

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

综合形态、多基因联合系统发育树和生理生化特征，最终将Y9鉴定为蜡样芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus Y9，于2023年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.26960。

实施例4、Y9菌株的盆栽防效

将蛭石、珍珠岩和泥炭土按1：1：1的比例混匀，121℃高压灭菌20min，放凉分装于花盆中(口径12cm，0.5加仑)，每盆移栽2株健康且长势一致的1年生黄连苗。试验共设4个处理，每个处理3盆黄连苗，实验重复3次。黄连移栽5天后用5mL腐皮镰刀菌Fs(1×10

实施例5、Y9菌株及其组合物的拮抗活性

1)菌株活化：将Y9和解淀粉芽孢杆菌分别接种于NA培养基上，30℃培养1-2天。将哈茨木霉、深绿木霉和里氏木霉分别接种于PDA培养基上，25℃培养5-7天。

2)发酵种子液：将上述活化菌株分别接种于BP液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养48h，制得种子液。所述哈茨木霉和深绿木霉的种子液浓度约为10

3)菌株相容性：按照图6，a中成对将待测菌在PDA和NA平板上划线，30℃培养3天，观察抑菌圈，相容的组合可以覆盖生长，而不相容的组合会有明显的抑制带，见图6，b。

4)菌剂发酵：先将200μL哈茨木霉或(和)绿色木霉种子液接种于20mL BP液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养48h；再按接种比例接入相应Y9或(和)解淀粉芽孢杆菌种子液，30℃、160rpm振荡培养48h。

5)平板对峙：用内径为6mm的打孔器打取活化好的病原菌(腐皮镰刀菌和燕麦镰刀菌)置于PDA平板的中央，采用十字交叉法在距平板中心2cm处分别滴10μL发酵液。每处理设3次重复，25℃培养5d后测量测量菌丝直径，并计算生长抑制率，每个处理3个重复。

抑制率＝(对照组菌落直径-试验组菌落直径)/对照组菌落直径×100％

结果如表3所示，Y9单独处理(T1)的抑菌效率与解淀粉芽孢杆菌(T2)相当，但显著低于哈茨木霉(T3)和深绿木霉(T4)处理。而Y9与哈茨木霉或者深绿木霉组合后的防效一般要高于单独使用Y9或者木霉，其中T7(HY,T.harzianum+Y9,1:1)、T15(HYJ,T.harzianum+B.amyloliquefaciens+Y9,1:1:1)和T20(HLYJ,T.harzianum+T.atroviride+B.amyloliquefaciens+Y9,2:2:1:1)对腐皮镰刀菌和燕麦镰刀菌的抑制率都很高，因此被选为下一步大田试验的组合。

实施例6、Y9菌株及其组合物的田间防效

1)菌株活化：将Y9和解淀粉芽孢杆菌分别接种于NA培养基上，30℃培养1-2天。将哈茨木霉和深绿木霉分别接种于PDA培养基上，25℃培养5-7天。

2)发酵种子液：将上述活化菌株分别接种于BP液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养48h，制得种子液。所述哈茨木霉和深绿木霉的种子液浓度约为10

3)菌剂发酵：在2000mL的三角瓶中，加入1000mL BP液体培养基，按表4先接入10mL哈茨木霉或(和)深绿木霉种子液，30℃、160rpm振荡培养48h；再按接种比例接入相应Y9或(和)解淀粉芽孢杆菌种子液，30℃、160rpm振荡培养48h。

表4Y9菌株及其组合物的田间防效实验组

田间施用：收集发酵液，加水至10L后，用喷雾器抵根喷淋，同时设置哈茨木霉可湿性粉剂和清水作为对照。随机选择3块3年生罹患黄连根腐病的连地，将每块连地分为5份，分别对应5个处理，每组处理5m

发病分级按以下标准(表5)进行统计：

表5 DB63T1294-2014蚕豆抗根腐病田间评价技术规程

按以下公式计算病情指数：

结果如表6和图7所示，7月份酷暑高热，正是黄连根腐病的高发季节，蜡样芽孢杆菌Y9的三个组合物及哈茨木霉可湿性粉剂都有效地降低了黄连根腐病的发生和为害，特别是HYJ处理的黄连，发出了新叶和新根，长势强健，防效优于哈茨木霉可湿性粉剂，说明蜡样芽孢杆菌Y9及其组合物作为黄连根腐病的生防制剂有广阔的应用前景。

表6 Y9及其组合物的对黄连根腐病的田间防效

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。