一株具有抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌ys1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌ys1及其应用。

背景技术

我国是世界上农药和化肥的使用大国。一方面，化肥的大量施用造成土壤有机质缺乏，土壤微生物和小动物等有益生物减少，影响了土壤的生物活性，降低了土壤肥力；而一部分未被作物吸收利用和未被土壤吸收固定的化肥，随农田排水流入周边水体，造成氮素和磷素的富集，产生富营养化。而且我国氮肥的当季利用率低，仅为30％～50％，损失的氮素中有相当部分以氨气、氮氧化物气体进入大气，对大气环境造成影响，特别是以一氧化二氮(N

生防促生微生物在促进植物营养吸收和维持植物健康中发挥着关键作用，对作物的生长和降低病害具有重要的科学和农艺价值，具有环保无污染的特点。近年来，生防促生菌应用到农业生产中来促进植物生长和控制植物病虫害的例子越来越多，已成为减少使用化肥农药的替代产品。目前，在国家化肥农药双减和新型绿色增值肥料产业化政策的实施下，微生物菌肥/农药的研究与开发成为今后农业可持续发展的重点，开发相应的生防促生微生物菌剂能够迎合绿色环保可持续的生态农业理念，是一种绿色、可行、有效的手段和途径。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株具有抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌ys1及其应用，该菌株不仅对多种土传病害病原菌具有较好的拮抗效果，而且还能在植株根际和叶面有效定殖；另外，该菌株对水稻可具有明显的促生效果，对水稻纹枯病可具有一定的防控效果，满足农业使用需求。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株具有抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌ys1，所述解淀粉芽孢杆菌ys1已于2023年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023585，保藏地址为中国武汉·武汉大学，所述解淀粉芽孢杆菌ys1的分类命名为Bacillusammyloliquefaciens ys1。

本发明的解淀粉芽孢杆菌ys1是从广西梧州野生稻叶片中分离纯化得到，分离鉴定方法如下：将野生稻植株从土壤中轻轻拔出，装于塑料盆内，立即带回实验室。野生稻植株用自来水洗净后，将叶片剪成长3cm、宽1cm放入灭菌的培养皿中，依次经过70％乙醇消毒5min、2％ NaClO消毒5min、无菌水洗5次后，用无菌镊子将消毒叶片放入LB培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0)中，轻轻按压使水稻叶片紧贴培养基。同时，最后一次洗涤的无菌水涂布于LB平板以检查植株是否消毒彻底。待培养基中长出细菌后，用接种环挑取叶片周围菌苔，用四分划线法对菌株进行分离纯化；如此重复，直至得到纯的单菌落。

生防芽孢杆菌ys1在LB培养基(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0)上培养24h后的菌落特征为乳白色，边缘不规则，表面干燥有褶皱，革兰氏染色阳性，产芽孢(见图1)。

ys1的生理生化特征：蔗糖利用，淀粉水解，硝酸盐还原，接触酶实验，明胶液化，柠檬酸盐、VP实验和蛋白酶实验为阳性；酪素水解，MR实验，脲酶实验和酯酶实验为阴性；对7种抗生素均表现出敏感性(表1)。

表1菌株ys1的抗生素抗性特性

注：“S”表示敏感，“R”表示不敏感。

将菌株接种于LB液体培养基中，30℃150rpm振荡培养16h，取1.5mL菌液于Eppendorf离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16S rRNA基因和持家基因(gyrA)，扩增产物经测序后与GenBank数据库中已知16S rRNA基因序列进行比对分析，与Bacillus amyloliquefaciens MPA1034的16S rRNA基因序列相似性达到99.93％；ys1的16S rRNA基因序列登录号为OQ422486，gyrA基因序列登录号为OR044748，将其鉴定并分类命名为(Bacillus amyloliquefaciens)ys1。

为实现上述发明目的，本发明还提供如下技术方案：

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在植物促生中的应用。

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在抑菌中的应用。

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在制备菌剂中的应用。

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在制备生物肥料中的应用。

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在防控植物病害中的应用。

优选的，所述植物病害包括水稻纹枯病、辣椒炭疽病、香蕉枯萎病和番茄青枯病。

所述的解淀粉芽孢杆菌ys1在水稻促生和防治水稻纹枯病中的应用。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌ys1采用灌根方式来促进水稻生长。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌ys1采用喷施水稻叶面方式来防治水稻纹枯病。

与现有技术相比，本发明有益效果如下：

本发明的解淀粉芽孢杆菌ys1不仅对多种土传病害病原菌具有较好的拮抗效果，而且还能在植株根际和叶面有效定殖；另外，该菌株通过根际浇灌方式对水稻具有明显的促生效果，通过喷施叶面方式对水稻纹枯病具有一定的防控效果，其防控效果达61.1％。利用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株ys1可以代替部分农药及化肥的施用，有效地保护农作物的生产以及减少农田农药和化肥的污染。

附图说明

图1为是本发明解淀粉芽孢杆菌ys1的菌落图；

图2是解淀粉芽孢杆菌ys1对苗期水稻的促生效果图；

图3为解淀粉芽孢杆菌ys1的伊枯草菌素A和芽孢菌霉素D基因电泳图；

图4为解淀粉芽孢杆菌ys1产蛋白酶活性图；

图5是解淀粉芽孢杆菌ys1分别对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)(A)、辣椒炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)(B)、香蕉枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)(C)和番茄青枯病(Ralstonia solanacearum)(D)的平板拮抗效果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

以下实施例研究了解淀粉芽孢杆菌ys1对多种土传病害病原菌的平板对峙效果、在水稻叶表的定殖效果、通过叶面喷施方式对水稻纹枯病的防治效果及通过根际浇灌方式对水稻的促生效果，确定该解淀粉芽孢杆菌ys1的抗病和促生效果。

以下实施例中使用到的菌悬液为：将本发明的解淀粉芽孢杆菌ys1(保藏编号为CCTCC NO：M 2023585)在LB液体培养基37℃、120rpm条件下培养12h，离心收集菌体，用于下述实验中不同浓度的菌悬液制备。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌ys1对苗期水稻的促生效果如下：

选取单粒饱满水稻种子，浸24h，晾12h，再浸12h至露白，转移至铺有滤纸的无菌培养皿内，6天后，待根生长至2cm左右，于ys1菌悬液中(OD

表2解淀粉芽孢杆菌ys1对水稻的促生作用结果

由图2和表2可以看出，本发明的解淀粉芽孢杆菌ys1通过根际浇灌方式对水稻具有明显的促生效果。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌ys1产生的生物抑菌物质及ys1对多种土传病原菌的拮抗效果如下：

提取ys1菌株的DNA，采用特异性引物对拮抗细菌ys1基因组中的脂肽类抗菌基因进行PCR扩增。PCR检测到ys1基因组中存在抗菌肽类物质伊枯草菌素A(Iturin A)和芽孢菌霉素D(Bacillomycin D)基因(见图3)。伊枯草菌素A基因(Iturin A)和芽孢菌霉素D(Bacillomycin D)的核苷酸碱基序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示.

由此可见，解淀粉芽孢杆菌ys1的抑菌代谢产物中存在广谱的抗菌肽类物质。

解淀粉芽孢杆菌ys1可以分泌胞外蛋白酶水解细菌或真菌细胞壁，对其定殖及防控病原微生物具有重要的作用。如图4所示，菌株ys1的蛋白水解酶活性强，菌落四周产生明显可见的蛋白水解圈，大小为38.3±0.18mm。

先将多种土传病害病原菌在PDA平板(采用去皮土豆200g切块，煮沸30min后滤布过滤得到的滤液、蔗糖20g、琼脂20g、加蒸馏水至1000mL)上进行活化，然后将直径为0.5cm的真菌菌饼置入PDA平板中央，30℃培养24–36h后将1μL ys1菌悬液(OD

室内平板对峙试验结果如图5所示，从图5中可以看出，菌株ys1对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、辣椒炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、香蕉枯萎病(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)和番茄青枯病(Ralstonia solanacearum)均具有很好的抑制效果。

实施例3

解淀粉芽孢杆菌ys1对水稻纹枯病发病率抑制效果如下：

水稻纹枯病发病率和病斑高率测定采用离体叶片实验。剪取大田水稻成株叶片，取中部10cm长的成段叶段，在ys1的菌悬液(OD

离体水稻叶片的纹枯病菌侵染实验表明，浸泡ys1菌悬液处理的水稻叶片的发病率为45.0％，远低于喷施无菌水(90.9％)和井冈霉素(81.8％)处理的水稻叶片。因此，菌株ys1对水稻纹枯病具有较好的抑制作用，可以成为生防应用菌株。

实施例4

解淀粉芽孢杆菌ys1对水稻纹枯病病斑高率、防控效果与叶际定殖效果如下：

将水稻种子用40℃温水浸泡后，放入垫有2层湿润滤纸的培养皿中，于光照培养箱中催芽，设置白天16h，湿度80％，温度30℃。待秧苗长至5-10cm时，移入盆里，水稻移栽后放入温室内。施肥量为每千克土壤N-P

纹枯病接种方法为：先将纹枯病菌丝接种到含有200mL PDA液体培养基中，120rpm黑暗培养7d。将液体PDA培养基培养得到的菌丝过滤掉溶液后，捏成一个直径为5mm菌丝球块，同时利用锡箔纸将菌丝球块嵌入稻株茎秆倒数第3叶鞘内侧，并保持叶鞘包茎状态不变。7d后待茎杆上出现典型病变斑，揭开锡箔纸。

盆栽实验设置3个处理，每个处理3盆，每盆含2株水稻。其中各处理为(1)无菌水(CK)；(2)井岗霉素60A(40μg/mL，20mL/盆)；(3)W26菌悬液(OD

处理(1)-(3)接种纹枯病后，分别于2d、7d、14d、21d和30d进行喷雾。在第1次喷雾20d后，按照下面公式Ⅰ和公式Ⅱ来测量纹枯病相对病斑高率(病斑高度占植株高度的百分率)。

病斑高率＝病斑长度/水稻株高×100％(Ⅰ)

防效＝(1-处理组病斑高率/对照病斑高率)×100％ (Ⅱ)

水稻发病率和防控效果如下：喷施菌株ys1的水稻发病率(45.0％)，远低于喷施无菌水(90.9％)和井冈霉素(81.8％)处理的水稻叶片，ys1的防控效果与喷施井冈霉素的防控效果(61.6％)相当(表3)，表明ys1对水稻纹枯病具有较好的抑制作用。

解淀粉芽孢杆菌ys1在水稻叶际的定殖效果如下：在喷施菌液40d后，对水稻茎叶进行随机取样。将采取的水稻样品剪切成1cm长，称取1g样品加入99mL 0.85％的灭菌生理盐水中，200rpm振荡1h。对浸提液进行不同浓度的梯度稀释后，涂布于TSA平板上，每个处理设置3个重复。37℃培养24h后，对平板进行菌落计数。结果显示，在40d内，菌液处理的ys1菌体数量维持在1.2×10

表3菌株ys1对水稻纹枯病的防治效果

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误，采用Duncan’s法，P<0.05。

结果表明：本发明的解淀粉芽孢杆菌ys1不仅对多种土传病害病原菌具有较好的拮抗效果，而且还能在植株根际和叶面有效定殖；另外，该菌株通过根际浇灌方式对水稻具有明显的促生效果，通过喷施叶面方式对水稻纹枯病具有一定的防控效果，其防控效果达61.1％。利用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株ys1可以代替部分农药及化肥的施用，有效地保护农作物的生产以及减少农田农药和化肥的污染。