一株高蛋白酶活、高产生物活性肽的嗜盐四联球菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株高蛋白酶活、高产生物活性肽的嗜盐四联球菌及其应用。

背景技术

生物活性肽是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，是一类相对分子质量小于6000Da，具有多种生物学功能的多肽。其分子结构复杂程度不一，是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，小至由两个氨基酸组成，大至由数十个氨基酸通过肽键连接而成，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。不同的发酵菌株可以产生各种形式的生物活性肽，包括抗氧化肽、降血压肽、免疫调节肽、抗菌肽及阿片活性肽等，具有调控抗氧化应激、调节心血管系统、免疫系统、神经系统及胃肠道系统功能等生理功能。

早在1978年，牛肉的鲜味八肽从牛肉中分离出来，鲜味肽的研究和利用就已经开始。鲜味肽是分子量在150-3000Da之间的小肽，可以直接从天然食品中提取。鲜味肽作为一种绿色安全的新型食品调味剂，可以有效的改善食品的鲜味，同时也可以调整其他味觉属性。鲜味肽的味道主要来自蛋白质合成和分解过程的中间产物。近年来，在许多加工食品或未加工蛋白水解物中都发现含有鲜味肽，比如肉类、昆虫类、水产品类、真菌类、谷类、豆类及其发酵制品等多种资源，但目前，由微生物通过多种代谢途径发酵产鲜味肽的研究较少，对于新型鲜味肽的探索仍在继续。同时，微生物发酵法受到了人们的广泛关注。微生物发酵法是通过某些微生物或微生物酶的作用，通过分解原料蛋白或者对氨基酸进行合成，进而将原料转化为风味小肽类物质，再经过分离提取达到制备鲜味肽的目的。

抗氧化肽隶属于生物活性肽，是一种具有抗氧化功能的小分子生物活性物，通常由2～20个氨基酸组成。抗氧化肽作为一种小分子天然活性物，因“绿色”、“活性强”、“易吸收”等特性而备受学者关注，研究表明，抗氧化肽的生物活性可受氨基酸序列、分子量及疏水性氨基酸含量的影响。通常，分子量越小、氨基酸残基连接脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)等疏水性氨基酸比例越高，抗氧化活性越强。近年来，已在豆类、肉类、蛋类等未加工食品、发酵制品及水解物中发现了抗氧化肽，同时抗氧化肽因具有“绿色”、“天然”、“安全”、“易吸收”等特性，合成制备方式已然成为热点。

嗜盐四联球菌属于革兰氏阳性菌，它是一种球形细菌，直径约为0.5-1.5微米，广泛存在于高盐环境中，也可以在发酵食品中分离出，如豆酱、酱油、酱汁、咸菜等，它能够发酵产生乳酸、醋酸、丙酮酸等有机酸，使食品呈现出酸味和特殊的风味。其分泌产生大量的酶催化一系列代谢途径进而产生风味物质，对豆酱风味品质的形成，可能起着至关重要的作用。目前已有将嗜盐四联球菌应用到发酵酱油中，结果证明确实可以改善酱油的滋味。四联球菌属是影响酱油色度和风味的核心菌群之一，其产生的酶催化一系列代谢途径，这些代谢途径产生风味物质。蛋白酶作为豆酱酿造过程中的一种主要酶类，其可以降解原料中的蛋白质成小分子肽类和氨基酸，因此常作为衡量风味水平的指标之一。

嗜盐四联球菌具有一定的产蛋白酶能力，蛋白酶作为豆酱酿造过程中的一种主要酶类，其可以降解原料中的蛋白质生成具有上述活性的成小分子多肽和氨基酸。嗜盐四联球菌通过分泌蛋白酶，如醛糖1-表异构酶(Aldose 1-epimerase，EC 5.1.3.3)、葡萄糖磷酸变位酶(Aldose1-epimerase以及sugar-specific II)促进豆酱中葡萄糖的利用率，是豆酱中的关键糖化微生物。目前嗜盐四联球菌的蛋白酶活力值较低，导致在食品的生产实践中应用不佳，菌株利用率低。蛋白酶高的嗜盐四联球菌具有提升食品的风味的能力，因此为提升嗜盐四联球菌的菌株利用率以应用于食品的生产中，需要筛选出具有高产蛋白酶活力的嗜盐四联球菌。

发明内容

本发明提供了一株产高蛋白酶活、高产生物活性肽的嗜盐四联球菌及其应用(Tetragenococcus halophilus)SNTH-3，所述的嗜盐四联球菌筛选自辽宁省不同地区96份东北传统自然发酵的豆酱，具有高蛋白酶活力，可以提升生物活性肽的产量，促进鲜味肽、抗氧化肽领域发展，提高其应用价值。

本发明一方面提供了一株嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)SNTH-3，所述嗜盐四联球菌保藏编号为CGMCC No.27586。本发明还提供了前述嗜盐四联球菌在生产生物活性肽中的应用。

上述技术方案中，进一步地，所述嗜盐四联球菌的发酵温度为25℃～40℃，接种量为1％～5％，NaCl浓度为1％～10％，pH值为5.5～10.5。

上述技术方案中，进一步地，所述嗜盐四联球菌的发酵温度为37℃，接种量3％，NaCl浓度4％，发酵pH值为8.5。

本发明还提供了前述嗜盐四联球菌在发酵食品中的应用。

本发明另一方面提供了一种微生物制剂所述的微生物制剂包含前述嗜盐四联球菌。

上述技术方案中，进一步地，所述微生物制剂中嗜盐四联球菌的活菌量不低于10

本发明还提供了前述微生物制剂在发酵食品中的有应用。

上述技术方案中，进一步地，所述发酵食品为豆酱、酱油；优选黄豆酱、豆瓣酱或豆面酱。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明提供了一株新的具有高蛋白酶活力的嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)SNTH-3，通过发酵该菌种，可将培养基上清液的蛋白酶活力值达到342.71±0.48U/mL，明显高于标准菌株ATCC 33315的蛋白酶活力值，γ-谷氨酰转移酶活力为7.361±0.003U/mL，清除DPPH自由基能力达到57.32％，清除羟基自由基的能力达到56.03％，产多肽能力达29.34±0.008mg/mL，明显高于标准菌株ATCC33315的产肽含量。嗜盐四联球菌SNTH-3可广泛应用于生物活性肽的生产，具有生产周期短、产量高、安全无毒副作用的优点。嗜盐四联球菌SNTH-3具有清除DPPH自由基，羟基自由基的能力，在抗氧化方面具有重要价值作用，该菌株还可用于制备发酵食品，有助于改善发酵食品的风味，提高发酵食品的安全性，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为嗜盐四联球菌SNTH-3细胞个体形态图；

图2为嗜盐四联球菌SNTH-3基于16S rDNA基因序列的系统发育树；

图3为嗜盐四联球菌扫描电镜图；

图4为部分嗜盐四联球菌产蛋白酶透明圈图。

图5为嗜盐四联球菌SNTH-3以抗坏血酸为阳性对照的DPPH清除自由基活性

图6为嗜盐四联球菌SNTH-3以抗坏血酸为阳性对照的羟基自由基清除自由基活性。

图7为温度对嗜盐四联球菌SNTH-3产肽及生长的影响；

图8为接种量对嗜盐四联球菌SNTH-3产肽及生长的影响；

图9为盐浓度对嗜盐四联球菌SNTH-3产肽及生长的影响；

图10为pH值对嗜盐四联球菌SNTH-3产肽及生长的影响。

图11为发酵温度与接种量对多肽含量影响的响应面图和等高线图；

图12为发酵温度与NaCl浓度对多肽含量影响的响应面图和等高线图；

图13为发酵温度与pH值对多肽含量影响的响应面图和等高线图；

图14为接种量与NaCl浓度对多肽含量影响的响应面图和等高线图；

图15为接种量与pH值对多肽含量影响的响应面图和等高线图；

图16为NaCl浓度与pH值对多肽含量影响的响应面图和等高线图。

具体实施方式

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例使用的培养基及其配方如下：

配制改良MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g、乙酸钠(无水)3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.575g、一水合硫酸锰0.25g、葡萄糖20g、柠檬酸三钠2.42g、酵母浸粉4g、牛肉浸膏8g、吐温80 1g、氯化钠100g，蒸馏水1L，调整pH值至7.0。

富集培养基(g/L)：MRS培养基中添加氯化钠150g、那他霉素2g、结晶紫500μL、调整pH值至7.0。

固体分离培养基(g/L)：MRS培养基中添加氯化钠150g、那他霉素2g、碳酸钙10g、琼脂20g，调整pH值至7.0。

种子培养基(g/L)：基础培养基中添加氯化钠100g，调整pH值至7.0。

脱脂乳粉培养基(g/L)：脱脂奶粉110.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH值至7.4。

模拟发酵豆酱培养基：大豆分离蛋白20g、小麦粉8g、氯化钙0.028g和去离子水28g混匀后，121℃灭菌30min，冷却到38℃，接种沪酿3.042米曲霉，发酵3天后，加入100mL磷酸缓冲溶液，剧烈搅拌1h，在4℃，10000g/min下离心15min，取上清液，加入10％氯化钠，121℃，灭菌15min，按3％接种量接入嗜盐四联球菌。

大豆蛋白胨培养基(g/L)：大豆蛋白胨10g、乙酸钠(无水)3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.575g、一水合硫酸锰0.25g、葡萄糖20g、柠檬酸三钠2.42g、吐温80 1g、氯化钠50g。

蛋白

大豆分离蛋白培养基(g/L)：大豆分离蛋白10g、乙酸钠(无水)3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.575g、一水合硫酸锰0.25g、葡萄糖20g、柠檬酸三钠2.42g、酵母浸粉4g、牛肉浸膏8g、吐温80 1g，氯化钠100g，蒸馏水1L，pH值至7.0。

下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。

实施例1：嗜盐四联球菌的分离鉴定

(1)豆酱样品采集

从本溪、丹东、大连、葫芦岛、锦州、辽阳、辽中、盘锦、沈阳9个地区共采集96份农家自然发酵豆酱。样品均由农家传统方法自然酿制而成，搅拌均匀后，使用一次性取样管分装，置于冰盒内，快速带回实验室，置于-80℃冰箱。

(2)嗜盐四联球菌的分离

准确称取1.0克的大酱样品，并加入9mL无菌生理盐水中，充分搅拌并静置15至20min。将稀释液梯度稀释至合适倍数后，取200μL的稀释液加入富集培养基中。将培养基置于36℃下静置培养2至3天，然后采用平板涂布法，在固体培养基中培养5至6天。挑选与乳酸菌菌落形态相似的单菌落，并进行革兰氏染色。选取呈对状或四联球状的菌体进行挑选，将其菌落置于种子培养基中进行纯化培养，共有136株疑似嗜盐四联球菌，保藏备用。

(3)嗜盐四联球菌的鉴定

1)菌落形态学鉴定

参照《乳酸菌分类鉴定及实验方法》及《常见细菌鉴定手册》进行生理生化特征鉴定实验。136株疑似嗜盐四联球菌中挑取菌落较小，凸起，呈乳白色，不透明，表面光滑有光泽，边缘平整；无运动性，不产生孢子；革兰氏染色呈阳性，细胞呈球形、四联或成对的菌体118株。

2)分子生物学鉴定

将上述118株菌株按照3％(v/v)的体积接种于改良MRS液体培养基中，于37℃静置培养48h～72h，利用细菌基因组试剂盒对菌株进行DNA提取。

PCR上游引物27F和下游引物1492R，由上海生物工程有限公司合成。

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5'---3')；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(5'---3')。

PCR反应条件为：95℃预热3min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃保持10min，4℃保温。

PCR产物送样至上海生物工程有限公司。将测序得到的序列与NCBI数据库中的序列进行比对，使用BLAST算法进行匹配，确定118株菌均为嗜盐四联球菌。使用MEGA 10软件构建系统发育树，并采用Neighbor-Joining方法对进化树进行评估分析，以确定嗜盐四联球菌的系统发育及亲缘关系。

(4)嗜盐四联球菌产蛋白酶能力初筛

将分离出的嗜盐四联球菌在改良MRS培养基中培养至第二代，为确保各组菌液浓度相同，需要调整OD值。将菌液按3％的接种量转移到改良MRS液体培养基中，培养60小时，并进行3次平行实验。在脱脂乳琼脂培养基上，使用直径为1cm的打孔器打孔。在打孔时需要注意避免培养基松动。将菌体与培养基混匀后，取200μL发酵液注入孔中。将培养皿放入37℃恒温培养箱中，培养72小时。最后，记录透明圈的直径和深度。

蛋白酶透明圈在一定程度上可以反映菌株蛋白酶活力的高低，具有初筛条件的代表性。

结果如图4所示：观察并测量118株嗜盐四联球菌菌株在脱脂乳培养基上的生长情况，菌液周边的酪蛋白被降解，而其他菌液渗透不到的地方并没有出现透明圈，挑选出具有蛋白透明圈的菌株，共计74株，其中画圈为嗜盐四联球菌SNTH-3。

(5)嗜盐四联球菌蛋白酶活力测定

使用微生物蛋白酶ELISA检测试剂盒测定嗜盐四联球菌在大豆基质发酵环境下的蛋白酶活力。按照说明书进行操作，使用酶标仪在450nm波长下测定OD值，并通过标准曲线计算样品活性。

蛋白酶作为豆酱酿造过程中的一种主要酶类，其可以降解原料中的蛋白质成小分子肽类和氨基酸，因此常作为衡量风味水平的指标之一。

将初筛选定的74株嗜盐四联球菌接种到模拟不同发酵环境的培养基中，分别是大豆蛋白胨培养基、改良MRS培养基、蛋白

结果显示：综合四种发酵环境，嗜盐四联球菌SNTH-3的蛋白酶活力平均值最高，达318.64±0.58U/mL。

(6)嗜盐四联球菌γ-谷氨酰转肽酶活力测定

使用γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性检测试剂盒测定嗜盐四联球菌在大豆基质发酵环境下的γ-GT酶活力，按照说明书进行操作，其主要操作步骤包括：a.离心收集菌体；b.超声波破碎；c.采用分光光度法测量其酶活性。

γ-GT，也被称为γ-谷氨酰转移酶，在发酵过程中对鲜味产生和强化也起着重要作用。首先，γ-GT酶有助于发酵体系中的谷氨酰胺(Gln)向鲜味氨基酸谷氨酸进行转化，其是组成鲜味肽的重要氨基酸残基之一。

结果显示：在大豆蛋白胨培养基中，初筛的74株嗜盐四联球菌中SY2-1γ-GT活力最高，达4.649±0.007U/mL，SNTH-3活力值排名第二，达4.478±0.005U/ml，二者活力值相近。在蛋白

(7)嗜盐四联球菌产多肽能力测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定嗜盐四联球菌发酵培养基培养液中多肽含量，按照说明书进行操作，采用微孔酶标仪法测定A 562nm，并根据标准曲线计算多肽浓度。

结果显示：所有试验菌株均具有产多肽能力，但不同菌株之间产多肽能力差异较大。SNTH-3在模拟豆酱发酵过程的米曲霉培养基中产多肽能力最强(18.41±0.001mg/mL)，三种培养基(大豆蛋白胨培养基、改良MRS培养基、蛋白

(8)因子分析

1)KMO和Bartlett球形检验

结果如表1显示：KMO值为0.710，数值大于0.5，表明变量间具有一定的相关性，而Bartlett球形检验中，Sig值为0.000＜0.005，说明数据满足总体正态分布。因此，可以得出结论，不同嗜盐四联球菌的风味指标数据是适合进行因子分析的。

表1KMO和Bartlett球形检验

2)不同嗜盐四联球菌呈味数据因子分析

用spss软件对数据进行因子分析，结果如表2所示，第一个因子特征根是2.694，包含了原有3个变量总方差的89.803％；前2个因子累计方差贡献率为98.234％，说明取前2个公因子基本包含了全部变量信息。

表2特征值和方差贡献率

根据Fi＝Ui*Xi(i＝1,2,3)构建2个公因子的线性回归方程:

F1＝0.860X1+0.668X2-0.765X3

F2＝-0.504X1-0.257X2+1.495X3

基于函数F＝0.57999/0.98234*F1+0.40235/0.98234*F2构建因子得分模型并计算综合得分。

结果显示：因子综合评分最高的菌株是SNTH-3，具有增鲜以及抗氧化潜力，以及生产生物活性肽的能力。

综上，确定嗜盐四联球菌SNTH-3为最佳菌株，其蛋白酶活力值达到342.71±0.48U/mL，γ-谷氨酰转移酶活力为7.361±0.003U/mL，产多肽能力达27.14±0.008mg/mL。

实施例2

(1)嗜盐四联球菌SNTH-3菌落形态鉴定

嗜盐四联球菌SNTH-3菌落较小，凸起，呈乳白色，不透明，表面光滑有光泽，边缘平整；无运动性，不产生孢子；革兰氏染色呈阳性，细胞呈球形、四联或成对。细胞形态图如图1所示。

(2)分子生物学鉴定

按实施例1中方法，嗜盐四联球菌SNTH-3的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，如下所示：AGGGGGGGGGCCTATACATGCAAGTCGAACGCTGCTTAAGAAGAAACTTCGGTTTTTTCTTAAGCGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTATCCATCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATATGGCTTTTTTTCACCTGAAAGAAAGCTCAAAGGCGCTTTACAGCGTCACTGATGGCTGGTCCCGCGGTGCATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGCAAAGAACAGGAGAAAGAGGAAATGCTTTTTCTATGACGGTAGCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTGATTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCAGCTCAACTGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGATCACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCGCCCTAGAGATAGGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGCAAGCCAAGCCGCAAGGCCTAGCGAATCTCTGAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGCGGCAACCCTTAGGGAGCCCAGCCCGACG。

将SEQ ID NO:1与NCBI数据库中的序列进行比对，使用BLAST算法进行匹配，确定为嗜盐四联球菌。

使用MEGA 10软件构建系统发育树，并采用Neighbor-Joining方法对进化树进行评估分析，以确定嗜盐四联球菌的系统发育及亲缘关系。如图2所示，为SNTH-3菌株的系统发育树，与嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)的同源性最高。

申请人已于2023年6月08日将嗜盐四联球菌SNTH-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.27586。

实施例3：嗜盐四联球菌扫描电镜分析

用冷场发射扫描电镜技术对嗜盐四联球菌SNTH-3的结构进行观察和分析。配制200mL改良MRS培养基，并按照3％的接种量进行富集培养，持续56小时，最后在3000g/min下进行4℃离心10分钟，将离心菌体用磷酸缓冲溶液清洗3次。使用2.5％戊二醛电镜专用固定液对样品进行固定处理，持续4小时。之后用磷酸缓冲溶液清洗样品4次，每次20分钟。采用30％、50％、70％、90％、100％乙醇梯度脱水处理样品，并将脱水后的样品浸泡在醋酸异戊酯中，持续15分钟。最后使用二氧化碳临界点干燥仪对样品进行干燥处理，并利用冷场发射扫描电镜技术进行观察和分析。

结果如图3所示：(A)为×10.0k倍数下观察结果，(B)为×20.0k倍数下观察结果。结果发现嗜盐四联球菌在×10.0k(A)放大倍数以及×20.0k(B)放大倍数下外观良好，没有出现结构变异的现象。

实施例4：嗜盐四联球菌抗氧化活性的测定

(1)DPPH自由基清除活性的测定

1)将反应体系进行混合，并将混合物于室温下反应30分钟；

2)在517nm测吸光度并以使用去离子水和抗坏血酸做空白对照和阳性对照，其中反应体系为0.5ml已活化的SNTH-3菌株(浓度分别为2,4,6,8,10mg/ml)的待测液、1ml0.25mM DPPH乙醇溶液和1ml水组成；

清除率(％)＝(1－(A

其中，As为样品与反应液的吸光度，Ao为样品的背景吸光度，A

结果显示:如图5，通过对DPPH自由基清除率的测定，在10mg/mL浓度时，嗜盐四联球菌SNTH-3的清除率高达56.03％，表明该菌株具有较强清除DPPH自由基的能力。显示其具有较强抗氧化能力。

(2)羟基自由基清除活性的测定

1)将反应体系进行混合并于25℃将混合物反应30分钟

2)在510nm处测量吸光度并使用去离子水和抗坏血酸分别作为空白和阳性对照；

其中，反应体系由1mL 9.0mM硫酸亚铁、1mL 9.0mM水杨酸、1mL 0.03％ H

清除率(％)＝(1－(A

其中，As为样品与反应液的吸光度，Ao为样品的背景吸光度，A

结果显示:如图6，通过对羟基自由基清除率的测定，在10mg/mL浓度时，嗜盐四联球菌SNTH-3的清除率高达54.72％，表明该菌株SNTH-3具有较强清除羟基自由基的能力，显示出较强的抗氧化能力。

实施例5:嗜盐四联球菌SNTH-3的高产生物活性肽的发酵条件分析

(1)响应面优化

选择发酵温度，接种量，NaCl浓度，pH值为实验因素,在单因素实验基础上，利用Box-Behnken响应面分析法设计实验方案，以发酵温度，接种量，NaCl浓度，pH值为实验因素，多肽含量为响应值，建立回归模型，分析回归模型的有效性及各单因素的影响度，对高产生物活性肽的提取因素进行优化，获得高产生物活性肽提取的优化工艺条件

选择发酵温度，接种量，NaCl浓度，pH值四个因素为自变量，以发酵温度，接种量，NaCl浓度，pH值的单一因素值为中间值进行自变量取值选择产肽量为响应面值，进行响应面优化，获得产多肽含量的回归方程：

Y＝29.23+0.56A+0.61B+0.33C-0.49D+0.34AB-0.12AC+0.087AD+0.18BC+0.21BD-0.010CD-3.31A

其中A为发酵温度、B为接种量、C为NaCl浓度、D为pH值

通过软件Design-Expert8.0.5.0优化并获得在发酵温度，接种量，NaCl浓度，pH值四个因素交互作用下的多肽含量最大值及对应发酵温度值，接种量值，NaCl浓度值，pH值

(2)最适发酵温度分析

将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-3按3％接种量接种至大豆蛋白基质培养基中，NaCl浓度为4％；发酵pH控制在8.5，分别在25℃、29℃、33℃、37℃、41℃条件下静置发酵。0-6d内每隔8h测定菌液中多肽的含量，以接种0h时的空白培养基为对照作图，绘制其产肽曲线，结果如图7所示。

从图7可知，当发酵温度为37℃，嗜盐四联球菌SNTH-3的产肽周期提前了17h。当发酵64h时，菌液中肽含量最高，达20.06mg/mL-20.67mg/mL；

(3)最适接种量分析

分别按1％、2％、3％、4％、5％的接种量将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-3接种至大豆蛋白基质培养基中，NaCl浓度为4％，发酵pH控制在8.5，37℃静置发酵。0-6d内每隔8h测定菌液中多肽含量，以接种0h时空白培养基为对照作图，绘制其产肽曲线,结果如图8所示。

从图8可知，当接种量为3％时，嗜盐四联球菌SNTH-3的产肽曲线最高，说明该菌的产肽能力最强。在发酵64h时，该菌株菌液中多肽含量达到最高值，分别为20.31mg/mL-20.79mg/mL。

(4)最适NaCl浓度分析

按3％的接种量将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-3接种至大豆蛋白基质培养基中，发酵pH控制在8.5，分别在NaCl浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％条件下，37℃静置发酵。0-6d内每隔8h测定菌液中多肽含量，以接种0h时空白培养基为对照作图，绘制其产肽曲线，结果如图9所示。

从图9可知，当发酵培养基中NaCl浓度为4％时，嗜盐四联球菌SNTH-3的产肽曲线最高。在发酵64h时菌液中多肽含量最高，达19.06-19.14mg/mL。

(5)最适发酵pH分析

按3％的接种量将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-3接种至大豆蛋白基质培养基中，NaCl浓度为4％，通过5M的NaOH溶液将发酵pH分别控制为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，37℃静置发酵。0-6d内每隔8h测定菌液中多肽含量，以接种0h时空白培养基为对照作图，绘制其产肽曲线，结果如图10所示。

从图10可知，当发酵pH为8.5时，嗜盐四联球菌SNTH-3的产肽曲线最高。在发酵64h时菌液中多肽含量最高，达到18.95mg/mL-19.04mg/mL。

实施例6响应面实验优化

(1)Box-Behnken实验

根据响应面设计原理，在单因素实验基础上选择对多酚提取率影响显著的4个单因素，即发酵温度、接种量、NaCl浓度、pH值为自变量，产多肽含量为响应值，进行四因素三水平实验，共计29个实验点，5个中心实验点。响应面实验因素水平如表3所示，实验设计方案和结果如表4所示。

表3

表4

(2)回归模型的建立及显著性检验

应用响应面优化软件对数据进行方差分析，数据拟合得Y(多肽含量)、A(发酵温度)、B(接种量)、C(NaCl浓度)、D(pH值)的回归方程Y＝29.23+0.56A+0.61B+0.33C-0.49D+0.34AB-0.12AC+0.087AD+0.18BC+0.21BD-0.010CD-3.31A

分析P值的大小可知，有极显著的因素A、B、C、D、AB、A

表5

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注**为极显著，*为显著。

(3)交互作用分析

由表三可知，AB交互作用对多肽含量的影响极为显著(P<0.01)，AD和CD交互作用对多肽含量的影响不显著(P>0.05)，其等高线图和响应面图如图11至图16所示。等高线的形状可以判断因素交互作用的强弱，等高线的形状越接近圆形，则交互作用越弱。由图11至图16可知，发酵温度和接种量的交互作用对多肽含量影响显著，发酵温度和pH值交互作用，pH值和NaCl浓度交互作用对多肽含量影响不显著。

根据响应面坡度的大小可以反映出因素水平改变对响应值的影响程度，响应面坡度越大，则影响越大。多肽含量随因素交互作用的改变而有所波动，根据图11～图16为响应面优化得到的曲面图，图中所示为固定A，B，C，D中任意的两因素为零水平时，剩余两因素之间的交互作用以及对多肽含量的影响。从各个因素交互作用对响应面进行分析，响应面等高线图可直观地反映各因素对响应值的影响，以便找出最佳工艺参数以及各参数之间的相互作用，等高线中最小椭圆的中心点及为响应面的最高点。从响应面和等高线图可以看出，发酵温度与接种量的交互作用对多肽含量的影响显著。

(4)响应面优化结果

根据软件Design-Expert 8.0.5.0优化出最佳工艺条件，发酵温度37.34℃，发酵pH 8.5，最适接种量3％，最适NaCl浓度4％时产多肽含量可达29.2517mg/ml，考虑实验的易操作性，确定最佳工艺条件为发酵温度37℃，发酵pH 8.5，最适接种量3％，最适NaCl浓度4％时为高产鲜味肽最佳培养条件最佳工艺条件下，3次平行实验结果显示，高产鲜味肽含量为与理论预测值相差不大，证明回归模型良好的预测了产多肽含量效果，优化后的工艺条件参数合理，适用于高产鲜味肽的培养。

(5)实验验证

以上述优化后的最佳工艺条件生产多肽：

将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-3接种至大豆蛋白基质培养基中，NaCl浓度为4％，接种量为3％，发酵pH控制在8.5，37℃静置发酵。0-6d内每隔8h取(菌液)进行(多肽含量)测定。

发酵72h测定，多肽产量高于优化前的嗜盐四联球菌SNTH-3，多肽的含量为29.25mg/mL；电子舌测定鲜味值高达20.43，呈鲜味效果非常好，其蛋白酶活力值高达342.71±0.48U/mL显著高于未进行优化的SNTH-3菌株。为后续深入研究菌株T.halophilusSNTH-3在改良MRS培养基中的产鲜味肽特性及菌株的生产应用提供了良好的研究基础。

综上所述，本发明筛选获得的嗜盐四联球菌SNTH-3可广泛应用于生物活性肽的生产，具有生产周期短、产量高、安全无毒副作用、抗氧化性能力强的优点。该菌株还可用于制备发酵食品，有助于改善发酵食品的风味，提高发酵食品的安全性，具有广阔的应用前景。有助于未来对于生物活性肽的深度挖掘，也为进一步探索T.halophilus产鲜机理以及未来在食品、医药等领域的应用提供了基础数据支持。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。