一种G458 DNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种G458 DNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。

但是在测序技术中使用的底物，多数为非天然dNTPs。如二代测序中，Illumina公司的Genome Analyzer(原Solexa sequencer)以及HiSeq和MiSeq系列的测序仪，均是通过检测DNA合成过程中，不同dNTP所携带的荧光标记来进行测序的。其工作原理与寡核苷酸合成仪逐步添加核苷酸类似，不同的是，测序仪中使用3’末端可逆染料(Cyclic reversibletermination,CRT)。由于所用的荧光基团标记dNTP存在3’OH保护，每一轮反应只添加一个dNTP；反应结束后，清洗游离的dNTP底物，去除3’保护基团；然后进行下一轮延伸反应。三代测序技术代表PacBIO公司，同样采用了Alexa系列荧光基团标记的测序底物。非天然底物核苷酸分子在分子结构以及分子量上，与天然底物分子有很大的差异，限制了DNA聚合酶对其结合效率。目前为了提高DNA聚合酶针对特异性地底物的整合效率，持续性等属性，常规的技术通过单独地进行定点突变的方式，但是进行定点突变的DNA聚合酶持续性、延伸速度以及结合修饰底物的能力仍然较低。因此，为了进一步提高DNA聚合酶对携带电化学基团的修饰核苷酸底物的结合效率，有必要开发一种G458 DNA聚合酶突变体及其应用。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种G458 DNA聚合酶突变体及其应用，从而提高DNA聚合酶对携带电化学基团的修饰核苷酸底物的结合效率。

本发明的第一方面提供一种G458 DNA聚合酶突变体。

具体的，所述G458 DNA聚合酶突变体包括G458-1 DNA聚合酶、G458-2 DNA聚合酶、G458-3 DNA聚合酶、G458-4 DNA聚合酶、G458-5 DNA聚合酶、G458-6 DNA聚合酶、G458-7DNA聚合酶中至少一种；

所述G458-1 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述G458-2 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述G458-3 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述G458-4 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述G458-5 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述G458-6 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述G458-7 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，所述G458-1 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述G458-2 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述G458-3 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述G458-4 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述G458-5 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述G458-6 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述G458-7 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明的第二方面提供一种核酸分子。

具体的，所述核酸分子包含第一方面中任意一种G458 DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种表达载体。

具体的，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子和用于由所述核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译所必需的调控序列。

本发明的第四方面提供一种重组宿主细胞。

具体的，所述重组宿主细胞含有第三方面所述的表达载体或第二方面所述的核酸分子。

优选的，所述重组宿主细胞为原核细胞。

本发明的第五方面提供一种组合物。

具体的，所述组合物含第一方面中任一项所述的G458 DNA聚合酶突变体和缓冲剂。

本发明的第六方面提供一种G458 DNA聚合酶突变体在核苷酸聚合中的应用。

本发明的第七方面提供一种G458 DNA聚合酶突变体在核酸扩增中的应用。

本发明的第八方面提供一种G458 DNA聚合酶突变体在测序反应中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明制备的G458 DNA聚合酶突变体，与野生型相比，其持续性和底物结合能力为野生型的2-20倍以上。

附图说明

图1为SDS-PAGE蛋白电泳结果图；

图2为本发明实施例1-7以及对比例1-2DNA聚合酶与天然底物反应的电泳结果图；

图3为本发明实施例1-7以及对比例1-2DNA聚合酶与天然底物反应的电泳结果图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

一种G458-1 DNA聚合酶

将G458-1 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.8所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-1 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-1 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.1所示)。

实施例2

一种G458-2 DNA聚合酶

将G458-2 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.9所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-2 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-2 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.2所示)。

实施例3

一种G458-3 DNA聚合酶

将G458-3 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.10所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-3 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-3 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.3所示)。

实施例4

一种G458-4 DNA聚合酶

将G458-4 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.11所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-4 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-4 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.4所示)。

实施例5

一种G458-5 DNA聚合酶

将G458-5 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.12所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-5 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-5 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.5所示)。

实施例6

一种G458-6 DNA聚合酶

将G458-6 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.13所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-6 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-6 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.6所示)。

实施例7

一种G458-7 DNA聚合酶

将G458-7 DNA聚合酶基因表达序列(序列如SEQ ID NO.14所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到G458-7 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15ML50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩G458-7 DNA聚合酶基因蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.7所示)。

对比例1

一种野生型G458 DNA聚合酶

将野生型G458 DNA聚合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.15所示，由上海捷瑞公司公司加工合成)分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号CSB-M13366)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6M后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到野生型G458 DNA聚合酶基因，并使用超滤柱AMICON ULTRA15ML 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩野生型G458 DNA聚合酶(野生型G458 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示)。

对比例2

一种商业DNA聚合酶

商业DNA聚合酶为(Bst 3.0DNA Polymerase，购于NEB公司，目录号：M0374S。

对实施例1-7以及对比例1-2得到的DNA聚合酶进行性能鉴定：

1.SDS-PAGE蛋白电泳验证对比例1-2DNA聚合酶和实施例1-7DNA聚合酶的蛋白大小和纯度。

将上述得到的对比例1DNA聚合酶和实施例1-7DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，鉴定各DNA聚合酶蛋白的大小和纯度。结果如图1所示，图中1泳道为蛋白Marker，2/3泳道为BSA的400ng/600ng，4泳道为对比例1野生型G458 DNA聚合酶，5/6/7/8/9//10/11泳道分别为实施例1-7中G458-1 DNA聚合酶，G458-2 DNA聚合酶，G458-3 DNA聚合酶，G458-4DNA聚合酶，G458-5 DNA聚合酶，G458-6 DNA聚合酶，G458-7 DNA聚合酶。从图1可以看出，各电泳条带在浓缩胶中被压成一条直线，从图1中条带位置，结合测序结果初步判断，对比例1野生型DNA聚合酶和实施例1-7DNA聚合酶大小正确，蛋白纯度较高。

2.实施例1-7以及对比例1-2中DNA聚合酶延伸能力，延伸速度的性能比较。

(1)制备模板引物复合物

10x reaction buffer：500mM Tris-HCl，100mM MgCl

模板引物复合物：90ul template(250ng/ul)+1ul Primer(100uM)+10ulreaction buffer；95℃5min,25℃30min。

(2)延伸反应

天然底物组：

10X°reaction buffer2：200mM°Tris-HCl，100mM(NH

表1天然底物反应体系：

反应条件：25℃条件下反应10min,65℃条件下反应1H。

表2D8G底物反应体系：

反应条件：65℃条件下反应1H。

T18-DSP8-T4-G(简称D8G)底物结构如下所示：

(3)电泳验证

取5ul上述样品与1ul的10X碱性缓冲液和2ul的碱性上样缓冲液(6x)(Coolaber公司，目录号：SL2212-5ML)以及4ul无酶水混合。将上述样品进行0.6％碱性琼脂糖凝胶电泳检测。

天然底物结果图如图2所示，图中1泳道为GeneRuler High Range DNA Ladder(Thermo Scientific公司，目录号：SM1353)，2泳道为1kb plus DNA ladder(Trans公司，目录号：BM211)，3泳道为对比例1野生型G458 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，4/5/6/7/8/9/10泳道为实施例1-7中G458-1 DNA聚合酶，G458-2 DNA聚合酶，G458-3 DNA聚合酶，G458-4 DNA聚合酶，G458-5 DNA聚合酶，G458-6 DNA聚合酶，G458-7DNA聚合酶，G458-8 DNA聚合酶，G458-9 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，11泳道为对比例2中Bst3.0DNA Polymerase(NEB公司，目录号：M0374S)在300mMKCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，12泳道为模板条带。在天然底物条件下所有DNA聚合酶均有延伸条带，且大部分延伸能力比对比例1野生型G458 DNA聚合酶强，其中实施例2中G458-2 DNA聚合酶的活性最强。

D8G底物结果如图3所示，图中1泳道为GeneRuler High Range DNA Ladder(Thermo Scientific公司，目录号：SM1353)，2泳道为1kb plus DNA ladder(Trans公司，目录号：BM211)，3泳道为对比例1野生型G458 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，4/5/6/7/8/9/10泳道为实施例1-7中G458-1 DNA聚合酶，G458-2 DNA聚合酶，G458-3 DNA聚合酶，G458-4 DNA聚合酶，G458-5 DNA聚合酶，G458-6 DNA聚合酶，G458-7DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，11泳道为Bst 3.0DNAPolymerase(NEB公司，目录号：M0374S)在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，12泳道为模板条带。在天然底物条件下所有DNA聚合酶均有延伸条带，且实施例1-7中的各DNA聚合酶延伸能力均比对比例1野生型G458 DNA聚合酶强，其中实施例7中G458-7 DNA聚合酶的活性与D8G底物结合最强。

综上所述，如图2和图3所示，根据滚环复制后扩增产物的亮度，G458 DNA聚合酶突变体的持续性和底物结合能力约是野生型G458 DNA聚合酶的2-20倍以上。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验所作的任何修改、等同替换、改进等得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。