一种基于天然多糖改性的温敏水凝胶、制备方法及其在伤口愈合中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于天然多糖改性的温敏水凝胶、制备方法及其在伤口愈合中的应用。

技术背景

抗生素是目前临床上应用极广泛的特效抗菌药物。然而，长期使用抗生素会增强细菌的耐药性，从而降低治疗效果。如何在杜绝滥用抗生素的情况下进一步达到消炎灭菌的效果是当前亟待解决的重要问题。

壳聚糖是甲壳素的去乙酰化产物，是天然多糖中唯一的碱性氨基多糖。因其良好的生物相容性而广泛用于生物医药研究领域。然而，壳聚糖的抗菌效果欠佳，并且难以在人体内长时间留存，这大大限制了其抗菌能力的发挥。壳聚糖的抗菌机制是C2处的氨基与游离氢离子形成带正电离子的基团，这可以吸引细菌细胞膜表面分子携带的负电荷。这种相互作用可以改变细菌细胞膜的形态，增加细胞膜的通透性，导致细胞内容物流出，细菌死亡。因此，提高壳聚糖的正电性是增强其抗菌活性的重要方法。

精氨酸是一种天然氨基酸，广泛存在于生物体内。精氨酸含有胍基，胍基是自然界中发现的最具生物活性的带正电荷的有机碱。精氨酸具有广谱抗菌活性、低毒性和良好的生物相容性，同时还能辅助免疫功能和抑制生物膜形成。这些特性使得精氨酸在抗菌治疗方面具有广阔的应用前景。尽管精氨酸具有较好的抗菌活性，但其作为单一的抗菌剂在使用时往往效果欠佳。

泊洛沙姆是一类两亲性三嵌段共聚物，由一个中心疏水性聚环氧丙烷嵌段(PPO)和两个末端亲水性聚环氧乙烷嵌段(PEO)组成。在不同类型的泊洛沙姆中，泊洛沙姆407具有PEO

本发明采用精氨酸对壳聚糖进行改性，并进一步掺杂泊洛沙姆407，从而提高壳聚糖的抗菌活性并延长其作用时间。壳聚糖通过氨基上的正电荷产生抗菌效果，精氨酸的改性可以进一步提高其正电位，从而有效增强壳聚糖的抗菌效果。与泊洛沙姆407掺杂可以有效增加壳聚糖在伤口表面的作用时间。本发明温敏水凝胶能够在特定的温度下实现由溶胶向凝胶的转变，即该水凝胶在室温下为溶胶，当接触到伤口表面后温度升高转变为凝胶，从而快速形成具有保护作用的屏障，并且该水凝胶中的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖可实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的消杀。该伤口愈合水凝胶制备简单、生物相容性高，可广泛应用于生物医药领域。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于天然多糖改性的温敏水凝胶、制备方法及其在伤口愈合中的应用。本发明将精氨酸改性壳聚糖和泊洛沙姆407结合制备温敏水凝胶，该水凝胶可用于大面积的皮肤创口，精氨酸的改性提高了壳聚糖的抗菌活性。精氨酸改性壳聚糖与泊洛沙姆407掺杂制备成的水凝胶，在特定温度下实现相转变，这实现了在室温下精氨酸改性壳聚糖/泊洛沙姆407呈液态，液态条件下可充分填充伤口，而随着温度提高到体温，它可以在原位形成凝胶，从而实现长时间抑菌的作用。同时水凝胶的三维网络结构可以吸收伤口渗出液保持润湿环境并且形成起保护作用的屏障。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于天然多糖改性的温敏水凝胶，所述温敏水凝胶包含壳聚糖改性6-脱氧-6-精氨酸及其中掺杂的泊洛沙姆407。

第二方面，本发明提供了所述的一种基于天然多糖改性的温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖和精氨酸，溶于去离子水，加入碳酸钠作为缚酸剂，进行回流，冷却至室温，调节pH至5.0-7.0，搅拌后调整pH至6.0-8.0，离心收集上清液，将上清液进行透析，冻干，得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖；

(2)称取6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖置于醋酸溶液中溶解，加入泊洛沙姆407，低温溶解完全后，静置，制备得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶。

所述的制备方法，步骤(1)中所述回流的条件为：温度90～120℃，时间10～30h；所述搅拌的时间为10～30h；所述透析的时间为2～4天。

所述的制备方法，步骤(1)中所述6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖、精氨酸、去离子水与碳酸钠的质量与体积比为0.9～1.2g:4.5～5.5g:20～40mL:1～2g，所述透析中采用的透析袋分子截留量为3500。

所述的制备方法，步骤(2)中所述溶解的时间为10～30h；所述低温溶解的条件为：温度0～10℃，时间10～30h；所述静置的条件为：温度30～40℃,时间5～15min。

所述的制备方法，步骤(2)中所述6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖、醋酸溶液、泊洛沙姆407的质量与体积比为0.05～0.15g:4.0～6.0mL:0.8～1.5g，所述醋酸溶液的浓度为0.5～1.5％。

所述的制备方法，步骤(1)中所述6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖的制备方法为：称取壳聚糖分散在醋酸溶液中，搅拌至溶解，滴加氢氧化钠溶液，过滤后得到纯化的壳聚糖，称取纯化的壳聚糖分散在无水乙醇中，调节pH至6.0-7.0，加入苯甲醛，高温搅拌，冷却至室温，过滤，用乙醇和去离子水交替清洗固体沉淀，以去除未反应的苯甲醛，将固体沉淀溶于二氯甲烷中，加入对甲苯磺酰氯，加入三乙胺和4-二甲氨基吡啶作为缚酸剂和催化剂，在冰水浴中进行反应，进行过滤，收集沉淀物，用乙醇和冰水交替冲洗，冻干后即得6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖。

所述的制备方法，所述高温搅拌的条件为：温度60～80℃，时间6～10h；所述反应的时间为3～8h。

所述的制备方法，所述壳聚糖、醋酸溶液、氢氧化钠溶液的质量与体积比为1.0～2.0g:75～125mL:5～15mL，所述醋酸溶液的体积浓度为0.5～1.5％，所述氢氧化钠溶液的浓度是0.5～1.5mol/L；所述壳聚糖、无水乙醇、苯甲醛、二氯甲烷、对甲苯磺酰氯、三乙胺和4-二甲氨基吡啶的质量与体积比为1.0～2.0g:40～60mL:2.5～3.0mL:40～60mL:4.5～5.5g:0.5～1.5mL:0.5～1.5g。

第三方面，本发明提供了所述的温敏水凝胶，或由所述的制备方法获得的温敏水凝胶在制备用于伤口愈合的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明制备的伤口愈合温敏水凝胶能够在升高至接近体温的温度下(26.5℃左右)实现相转变，从而在伤口表面形成三维网络结构吸收伤口渗出液形成保护屏障，同时能够让6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖长时间与伤口接触，实现长效抑菌。并且本发明温敏水凝胶中的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖可实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的消杀。该伤口愈合水凝胶制备简单、生物相容性高，可广泛应用于生物医药领域。

附图说明

图1为实施例一中壳聚糖、6-脱氧-6-对甲苯磺酰-N-苯甲醛壳聚糖、精氨酸、6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的红外光谱图；

图2为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶在恒定频率下的模量-温度曲线图；

图3为实施例一中壳聚糖、6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的水接触角图；

图4为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例一中壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例二中泊洛沙姆407水凝胶的扫描电镜图；

图5为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的溶胀率图；

图6为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例一中壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的抑菌效果图；

图7为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例一中壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例二中泊洛沙姆407水凝胶、对比例三中医用纱布、止血海绵的血凝指数图；

图8为实施例一中6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例一中壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例二中泊洛沙姆407水凝胶、对比例三中医用纱布、止血海绵的凝血时间图。

具体实施方式

现在结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例一：

一种基于天然多糖可用于伤口愈合的温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.5g壳聚糖分散在100mL体积浓度为1.0％的醋酸溶液中，搅拌至溶解。滴加1mol/L氢氧化钠溶液10mL，过滤后得到纯化的壳聚糖。将纯化后的壳聚糖分散在50mL乙醇中，用1mol/L盐酸溶液调节混合物pH至6.5。混合物中加入2.7mL苯甲醛，70℃搅拌8小时，冷却至室温，过滤，用乙醇和去离子水交替清洗固体以去除未反应的苯甲醛，随后将固体分散在50mL二氯甲烷中，加入5.0g对甲苯磺酰氯。在混合物中分别加入1.0mL三乙胺和1.0g二甲氨基吡啶作为缚酸剂和催化剂。反应在冰浴中进行5小时。沉淀物通过过滤收集，用乙醇和冰水交替冲洗，冻干后即得6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖。

(2)称取1.0g 6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖和5.0g精氨酸溶于30mL去离子水中。添加1.5g碳酸钠作为缚酸剂，然后在110℃下回流24小时。将混合物冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH＝6.0。搅拌反应24小时。将混合物pH调至7.0，离心收集上清液。最后将上清液置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天，冻干后得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖。

如图1所示为实施例一中制备的壳聚糖、6-脱氧-6-对甲苯磺酰-N-苯甲醛壳聚糖、精氨酸和6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的红外光谱图，其中壳聚糖在2867cm

(3)称取0.1g的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖在1.0％的5.0mL醋酸溶液中溶解2小时，加入1.05g的泊洛沙姆407，在4℃下溶解24小时，完全溶解后，在37℃下静置10分钟，即可得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶。

如图2所示为实施例一中制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶在恒定频率(1Hz)下的模量-温度曲线，结果证实了该水凝胶在26.5℃时具有胶凝特性，其中在温度低于26.5℃时，损失模量占主导地位，表明6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407的胶束不是有序排列的，聚合物链处于松弛构象。当温度上升超过26.5℃后，存储模量的快速增加反映了凝胶三维网络结构的形成。

如图3所示为实施例一中制备的壳聚糖、6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的水接触角测量结果，壳聚糖和6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的水接触角分别为52.2°和36.8°。显然，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的亲水性远大于壳聚糖，这是由于6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖上的精氨酸造成的。精氨酸含有亲水性的胍基和羧基，这使得6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖与水形成了强氢键，从而显著提高了亲水性。

如图4中C为实施例一中制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的扫描电镜，不难看出，该水凝胶呈现出具有较大空腔的三维网络结构，这可能是由于6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的亲水性较高，使其周围可以存在更多的水分子，在冷冻过程中形成更大的冰晶，经过冻干后留下了孔隙。更大的空腔意味着在实际应用时，伤口表面可以保持空气的流通，同时可以有效规避厌氧菌的伤害。

实施例二：

一种基于天然多糖可用于伤口愈合的温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.0g壳聚糖分散在75mL体积浓度为0.5％的醋酸溶液中，搅拌至溶解。滴加0.5mol/L氢氧化钠溶液5mL，过滤后得到纯化的壳聚糖。将纯化后的壳聚糖分散在40mL乙醇中，用0.5mol/L盐酸溶液调节混合物pH至6.0。混合物中加入2.5mL苯甲醛，70℃搅拌8小时，冷却至室温，过滤，用乙醇和去离子水交替清洗固体以去除未反应的苯甲醛，随后将固体分散在40mL二氯甲烷中，加入4.5g对甲苯磺酰氯。在混合物中分别加入0.5mL三乙胺和0.5g二甲氨基吡啶作为缚酸剂和催化剂。反应在冰浴中进行5小时。沉淀物通过过滤收集，用乙醇和冰水交替冲洗。冻干后即得6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖。

(2)称取0.9g 6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖和4.5g精氨酸溶于20mL去离子水中。添加1.0g碳酸钠作为缚酸剂，然后在110℃下回流24小时。将混合物冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH＝5.0。搅拌反应24小时。将混合物pH调至6.0，离心收集上清液。最后将上清液置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天，冻干后得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖。

(3)称取0.05g的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖在体积浓度为0.5％的4.0mL醋酸溶液中溶解2小时，加入0.8g的泊洛沙姆407，在4℃下溶解24小时，完全溶解后，在37℃下静置10分钟，即可制备出6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶。

实施例三：

一种基于天然多糖可用于伤口愈合的温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取2.0g壳聚糖分散在125mL体积浓度为1.5％的醋酸溶液中，搅拌至溶解。滴加1.5mol/L氢氧化钠溶液15mL，过滤后得到纯化的壳聚糖。将纯化后的壳聚糖分散在60mL乙醇中，用1.5mol/L盐酸溶液调节混合物pH至7.0。混合物中加入3.0mL苯甲醛，70℃搅拌8小时，冷却至室温，过滤，用乙醇和去离子水交替清洗固体以去除未反应的苯甲醛，随后将固体分散在60mL二氯甲烷中，加入5.5g对甲苯磺酰氯。在混合物中分别加入1.5mL三乙胺和1.5g二甲氨基吡啶作为缚酸剂和催化剂。反应在冰浴中进行5小时。沉淀物通过过滤收集，用乙醇和冰水交替冲洗。冻干后即得6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖。

(2)称取1.2g 6-脱氧-6-对甲苯磺基-N-苯甲醛壳聚糖和5.5g精氨酸溶于40mL去离子水中。添加2.0g碳酸钠作为缚酸剂，然后在110℃下回流24小时。将混合物冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH＝7.0。搅拌反应24小时。将混合物pH调至8.0，离心收集上清液。最后将上清液置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天，冻干后得到6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖。

(3)称取0.15g6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖在体积浓度为1.5％的6.0mL醋酸溶液中溶解2小时，加入1.5g的泊洛沙姆407，在4℃下溶解24小时，完全溶解后，在37℃下静置10分钟，即可制备出6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶。

对比例一：

(1)称取0.1g壳聚糖在体积浓度为1.0％的5.0mL醋酸溶液中溶解2小时，加入1.05g的泊洛沙姆407，在4℃下溶解24小时，完全溶解后，在37℃下静置10分钟，即可制备出壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶。

(2)壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的扫描电镜图如图4B所示，为分布密集的蜂窝状结构。

对比例二：

(1)称取1.05g的泊洛沙姆407，在体积浓度为1.0％的5.0mL醋酸溶液中溶解2小时，在4℃下溶解24小时，完全溶解后，在37℃下静置10分钟，即可制备出泊洛沙姆407水凝胶。

(2)泊洛沙姆407水凝胶的扫描电镜图如图4A所示，为规则的片状结构。

实施例四：6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的溶胀率测试

称取实施例一制备得到的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶10g，浸入50mLpH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲溶液中，每隔一定时间间隔将水凝胶取出并用滤纸吸干表面的水，记录其实时质量。

溶胀率的计算公式为：溶胀率(％)＝(m

如图5所示，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶在前50分钟内具有较高的溶胀率，其最大值可达到300％左右，原因是6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶形成了三维网络结构，可以充分存储水分。但超过50分钟后，该水凝胶的溶胀率显著下降，这可能是由于水凝胶在50分钟后发生了部分溶解。

实施例五：抗菌效果测试

以实施例一制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、和对比例一制备的壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶为待测材料，测试待测材料在凝胶状态下的抗菌效果，测试方法为：

将生长到对数相的大肠杆菌用无菌水稀释至1×10

如图6所示，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率分别为99.7％和99.8％。对细菌高的抑制率是因为精氨酸上的胍基极大地提高了6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖的正电位，使其对细菌细胞膜上负电荷的吸引变强，促使细菌裂解死亡。壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率分别为75.9％和88.5％。

实施例六：凝血能力测试

以实施例一制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例一制备的壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶、对比例二制备的泊洛沙姆407水凝胶为待测材料，测试并对比待测材料凝血能力，测试方法为：

(1)将10mg待测材料置于15mL离心管中并加热至37℃，然后滴入100μL新鲜抗凝人血于样品表面，37℃孵育10min，然后在离心管中缓慢加入10mL去离子水。离心收集上清液，用紫外可见分光光度计测量其在540nm处吸光度。将100μL新鲜抗凝人血加入10mL去离子水中作为参比样品，取100μL参比样品，在540nm处测定其吸光度。

血凝指数(BCI)的计算公式为：BCI(％)＝A

(2)将10mg待测材料置于15mL离心管中并加热至37℃，每管加1mL抗凝人血和10μL2mol/L CaCl

实验结果由图7可知，实施例一制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的血凝指数值为24.3％，对比例一制备的壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的凝血指数为41.0％。对比例二制备的泊洛沙姆407水凝胶的凝血指数为67.7％。由图8可知，实施例一制备的6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的凝血时间为471秒，对比例一制备的壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的凝血时间为532秒，对比例二制备的泊洛沙姆407水凝胶的凝血时间为646秒。

究其原因，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖/泊洛沙姆407水凝胶的部分凝血特性来自于其良好的吸水能力和丰富的空腔，加速了血液的吸收。另一方面，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖所携带的正电荷可以有效促进带负电荷的红细胞聚集。与壳聚糖相比，6-脱氧-6-精氨酸接枝壳聚糖还具有更高的分子量，这进一步促进了与红细胞的相互作用，通过促进红细胞的聚集而实现止血。

对比例三：

将医用纱布、止血海绵的凝血能力作为对比。分别将10mg医用纱布和止血海绵置于15mL离心管中，37℃预热1小时，然后滴入100μL新鲜抗凝人血于样品表面，37℃孵育10min，然后在离心管中缓慢加入10mL去离子水。离心收集上清液，用紫外可见分光光度计测量其在540nm处吸光度。将100μL新鲜抗凝人血加入10mL去离子水中作为参比样品，取100μL参比样品，在540nm处测定其吸光度。

血凝指数(BCI)的计算公式为：BCI(％)＝A

如图7、8所示，医用纱布的凝血指数和凝血时间分别为79.3％和815秒，止血海绵的凝血指数和凝血时间分别为49.6％和554秒。