杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs及其应用。

背景技术

杂交鹅掌楸(Liriodendron sino-americanum P.C.Yieh ex Shang etZ.R.Wang)是我国著名林木育种家叶培忠教授利用人工杂交育成的种间杂种，其生长速度比中国鹅掌楸快，杂种优势十分明显。成年杂种鹅掌楸树体高大，其树形美观、叶形呈马褂状，花大且鲜艳，具有较高的观赏价值，是一种适用于庭园栽培、道路绿化、荒山荒地造林等多种用途的优良树种。在美国，北美鹅掌楸木材大量用作装饰用材、工业胶合板面材或芯材、造纸等。鹅掌楸虽然有许多优越性，但鹅掌楸对低温环境敏感，其地理分布主要在长江流域以南地区。由此可见，低温限制了鹅掌楸在我国北方地区的大面积推广和种植。因此培育筛选耐低温品种的鹅掌楸是极为需要的，并且具有重要的理论和实践价值。目前鹅掌楸基因组已经完成了测序和发布，为深度挖掘鹅掌楸重要性状的调控基因奠定了基础。

鉴于CBF(C-repeat binding factor)基因是植物重要的抗逆基因，其属于AP2/ERF(ethylene response factor)转录因子家族中的CBF/DREB亚家族，含1个AP2/ERF结构域。目前，CBF基因家族已经在多种植物中得以研究，其中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中有6个DREB1/CBF基因即DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1A/CBF3、DREB1D/CBF4、CBF5、CBF6。研究表明拟南芥CBF1是与CRT/DRE序列结合的转录激活因子，CBF1过表达诱导COR(cold-regulated)基因表达，提高了拟南芥的抗冷性。除拟南芥外，研究人员也对其他植物CBF基因进行了研究。在小麦(Triticum aestivum)中，大多数CBF基因位于5号染色体的长臂上，与耐冷基因具有紧密的联系。过表达水稻CBF基因，水稻的抗寒性、抗旱胁迫性、抗盐性都得到提高。在非生物胁迫条件下，转录因子CBF可以识别下游COR基因启动子上的顺式作用元件CRT/DRE，激活COR基因的表达，其参与冷、干旱、盐等多种胁迫信号途径，可提高植物抗逆性。因此，开展鹅掌楸CBF基因的克隆与功能分析，有助于解析鹅掌楸抗逆响应生物学过程和培育筛选抗逆品种。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，针对现有技术中存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs，用于构建转基因植株。本发明所要解决的另一个问题是提供杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs的应用，用于筛选耐低温能力增强的新种质。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs，包括LhCBF6基因和/或LhCBF7基因和/或LhCBF9基因，其核苷酸序列分别对应SEQ ID NO.1-3。

杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs的表达蛋白，其氨基酸序列分别对应SEQ ID NO.4-6。

杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs在增强植物对低温胁迫抵抗能力中的应用，包括以下步骤：

1)构建杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs的表达载体；

2)将构建的杂交鹅掌楸耐低温基因CBFs的表达载体转化到拟南芥中；

3)培育筛选并获得对低温耐受能力增强的转基因拟南芥。

所述表达载体为植物表达载体。

所述植物表达载体为LhCBF6-PBI121、LhCBF7-PBI121、LhCBF9-PBI121。

所述低温胁迫为-8℃。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以杂交鹅掌楸的叶片组织为材料，通过克隆得到杂交鹅LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因，在此基础上构建其过表达载体，转入拟南芥中，得到抗性转基因植株。将转LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的拟南芥植株和野生型植株同时放入-8℃冷胁迫处理12h，恢复培养3天后，表型观察表明转LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的拟南芥植株生长受到低温胁迫的影响小，而野生型植株生长明显受抑制，且叶片有严重的失水萎蔫情况。表明转入鹅掌楸LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因可以显著增强拟南芥对低温胁迫的耐性。本发明提供的鹅掌楸LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因为后续开展杂交鹅掌楸抗逆性分子育种提供理论和基因分子依据，并将进一步在植物抗逆境胁迫中有广泛的应用。

附图说明

图1为LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因PCR扩增产物图(A为LhCBF6；B为LhCBF7与LhCBF9)；

图2为LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9菌液PCR电泳结果图(A为LhCBF6；B为LhCBF7；C为LhCBF9)；

图3为LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因表达载体质粒图谱；

图4为野生型拟南芥和转LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因拟南芥在零下8度胁迫处理前和零下8度胁迫处理恢复3天后的表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例使用的主要试剂盒和药品为：FastPure Plant Total RNA IsolationKit试剂盒(Vazyme)，

主要仪器与设备：高温高压灭菌锅，普通PCR扩增仪，凝胶电泳成像仪，涡旋震荡仪，高速低温离心机，4℃冰箱，-80℃超低温冰箱，恒温培养箱，摇床，分光光度计等。

实施例1

通过生物信息学工具对鹅掌楸CBF家族序列进行分析，从鹅掌楸基因组数据库中选取了Lchi04946基因、Lchi04945基因、Lchi04943基因进行克隆，通过测序和同源比较，成功克隆出Lchi04946基因、Lchi04945基因、Lchi04943基因，并分别命名为LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9，克隆实验具体过程如下：

1.叶片RNA提取

以杂交鹅掌楸的叶片组织为材料，按照FastPure Plant Total RNAIsolationKit试剂盒(Vazyme)的操作步骤进行RNA的提取，杂交鹅掌楸叶片组织总RNA的1％琼脂糖凝胶电泳结果显示条带完整清晰，RNA完整性较好，浓度高，可用于反转录。

RNA提取的具体过程如下，以下过程在无RNase污染的超净台中进行：

取适量杂交鹅掌楸叶片组织，置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，加入65℃预热的已经提前加入β-巯基乙醇的500μL Buffer PRL；将裂解液转移至离心管中，立即剧烈涡旋震荡60sec，使其充分裂解；将裂解物在65℃空气浴5min，期间颠倒混匀2次帮助裂解，12000rpm离心10min；转移上清移至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入0.5倍上体积的无水乙醇，立刻吹打混匀；上述混合液移至已放入2mL收集管的Fast Pure gDNA-FilterColumnⅡ中，12000rpm离心2min；将Fast Pure gDNA-Filter ColumnⅡ放至新的2mL收集管中，加入500μLBuffer PRL Plus，12000rpm离心30sec，收集滤液，向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇，立即吹打混匀；将上述混合液移至已放入2mL收集管的Fast PureRNAColumnⅣ中，12000rpm离心2min弃滤液；向Fast Pure RNAColumnⅣ中加入700μLBuffer PRW1，室温放置1min，12000rpm离心30sec。弃滤液；向Fast Pure RNAColumnⅣ中加入500μL Buffer PRW2，12000rpm离心30sec，弃滤液；重复一次；将Fast Pure RNAColumnⅣ吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，去掉Fast Pure RNAColumnⅣ中残留的BufferPRW2；将Fast Pure RNAColumnⅣ转移至新的1.5mL RNase-free离心管中，向吸附膜中央悬空加入50μL RNase-free ddH

2.cDNA的获得

以提取的RNA为模板，反转录获得cDNA，使用的是Vazyme公司的

1)RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下混合液：RNase-free ddH

2)将上一步的混合液8μL、5×gDNA wiper Mix 2μL用移液器轻吹打混匀，42℃加热2min，去除基因组DNA。

3)配制第一链cDNA合成反应液：上一步的混合液10μL、10×RTMix 2μL、HiSciptIIIEnzymeMix 2μL、Oligo(dT)20VN 1μL、RNase-freeddH

4)按照下列反应条件进行第一链cDNA合成反应：37℃45min、85℃5sec、4℃∞，产物立即用于PCR反应，或在-20℃保存。

3.克隆目的基因片段、片段回收、连接转化及测序

利用Oligo7.0设计引物，进行PCR，从而获得目的基因，进行连接转化测序，最后进行比对分析。

引物序列如下：

LhCBF6-F：5’-ATGGAAACCTTCTTCAGCTCTG-3’，

LhCBF6-R：5’-TCAGATTGAGTAGCTCCACAGTG-3’，

LhCBF7-F：5’-ATGGCCACATATTCTACATACACATTGG-3’，

LhCBF7-R：5’-TCAGATGGAGTGGCTCCACAG-3’，

LhCBF9-F：5’-ATGGCAACATTCTTCAGCTGTG-3’，

LhCBF9-R：5’-TCAGATGGAGTGGCTCCACAG-3’。

PCR扩增体系：

使用的是Vazyme公司的

PCR反应条件：95℃3min；95℃15sec，58℃15sec，72℃30sec，循环35次；72℃5min；4℃∞。

LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。

4.目的基因片段回收

将PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得预期目的片段，使用TS INGKE公司的DNA凝胶回收试剂盒，对目的片段进行回收纯化，步骤如下：1)在吸附柱EC中，加入250μL Buffer BL，12000g离心1min，活化硅胶膜。2)在365nm长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好，将含有目的DNA条带的凝胶放入2mL离心管中。3)加入500μL的Buffer GL。4)65℃空气浴6min，每2mi n上下颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化，溶液呈淡黄色(若胶块体积较大，适当添加Buffer GL至溶液呈淡黄色)。5)将溶液转入吸附柱EC中，12000g离心1min，弃废液，将吸附柱EC放回空收集管。6)在吸附柱EC中加入700μL Buffer W2，12000g离心1min，弃废液；重复一次。7)将吸附柱EC放回空收集管中，12000g离心2min。8)取出吸附柱EC，放入干净的1.5mL离心管中，20～25℃开盖静置2min，在吸附柱膜中央部位加入50μL 65℃预热的Eluent，20～25℃静置2min，12000g离心2min，可再洗脱一次提高产量。

5.目的基因片段连接、转化及测序

将目的基因片段与克隆载体pClone007 Blunt Vector Kit(TSINGKE TSV-007B)，分别进行连接反应。10μL反应体系如下：目的基因片段2μL、pClone007BluntVector 1μL、10×TopoMix 1μL、ddH

所有溶液直接加入管中后，用移液器吸打混匀，室温(22-30℃)反应5mi n即可完成反应。

将连接产物转入大肠杆菌菌株中TreliefTM5α(TSINGKE TSC01)。具体步骤如下：1)从-80℃超低温冰箱取出100μL感受态细胞，置于冰上融化，加入连接产物10μL，轻轻混匀，冰上静置5min；2)42℃水浴热激45s，迅速移至冰浴，静置2min；3)不加培养液取合适体积菌液直接涂布在含Amp的LB固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。

检测重组质粒，将得到的阳性克隆进行测序分析。结果分析，LhCBF6基因编码区长度为678bp，包含完整的开放阅读框(ORF)，序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示；LhCBF7基因编码区长度为642bp，包含完整的开放阅读框(ORF)，序列如SEQ ID NO.2所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.5所示，含有214个氨基酸；LhCBF9基因编码区长度为672bp，包含完整的开放阅读框(ORF)，序列如SEQ ID NO.3所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示，含有224个氨基酸。

实施例2

构建LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的过表达载体，并将其转入农杆菌菌株，通过花序浸泡法转化野生型拟南芥(Columbia)，从而获得过表达LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的阳性转基因拟南芥，研究分析杂交鹅掌楸LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的功能。

本发明所用大肠杆菌为DH5α(TIANGEN)；表达载体为PBI121。具体过程如下：

1.通过同源重组技术构建LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的过表达载体，所用引物如下：

LhCBF6.FOR：

5’-gagagaacacgggggactctagaATGGAAACCTTCTTCAGCTCT-3’，

LhCBF6.REV：

5’-gatcggggaaattcgagctcTCAGATTGAGTAGCTCCACAGT-3’，

LhCBF7.FOR：

5’-gagagaacacgggggactctagaATGGCCACATATTCTACATACACA-3’，

LhCBF7.REV：

5’-gatcggggaaattcgagctcTCAGATGGAGTGGCTCCAC-3’，

LhCBF9.FOR：

5’-gagagaacacgggggactctagaATGGCAACATTCTTCAGCTG-3’，

LhCBF9.REV：

5’-gatcggggaaattcgagctcTCAGATGGAGTGGCTCCAC-3’。

以上述获得的基因片段为模板，进行PCR扩增。50μL反应体系如下：2×Phanta MaxBuffera 25μL；dNTP Mix(10mM each)1μL；上游引物(10μM)2μL；下游引物(10μM)2μL；含有目的片段的质粒1μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL；ddH

2.PBI121载体质粒双酶切反应

使用XbaI和SacI限制性内切酶进行双酶切。

双酶切反应体系如下：PBI121质粒1ug、CutSmart buffer 2μL、XbaI 1μL、SacI 1μL、ddH

吸打混匀，37℃水浴，双酶切反应4h后，进行热失活反应。

3.重组反应，使用Vazyme公司的

使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心收集管底。37℃反应30分钟(PCR仪)；反应结束降至4℃。

4.重组产物转化，使用TIANGEN公司的DH5α感受态细胞进行转化：

取感受态细胞置于冰浴中，向感受态细胞悬液中加入重组产物10μL，轻弹混匀，在冰浴中静置30min；将离心管置于42℃水浴中放置90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管；向离心管中加入900μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，150rpm的摇床振荡培养45min，使菌体复苏；将离心管内容物混匀，4000rpm离心2分钟，弃去部分培养液后悬浮菌液，涂布于含有卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养16h。

5.阳性克隆筛选及测序

从筛选平板上挑取单菌落进行PCR检测及测序验证，PCR反应使用Vazyme公司的2×Rapid Taq Master Mix试剂，25μL体系如下：ddH

反应程序：95℃，3min；95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min，35个循环；72，5min，16℃，∞。菌液PCR检测为阳性的克隆送至擎科生物公司(南京)测序鉴定，正确，获得含有LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的过表达载体LhCBF6-PBI121、LhCBF7-PBI121、LhCBF9-PBI121(图3)。

实施例3

1.冻融法转化农杆菌

本发明使用的农杆菌菌株为GV3101(唯地)，采用液氮冻融法将构建的LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的过表达载体分别转入农杆菌。具体过程如下：冰浴融化农杆菌感受态细胞，每管加入1-5μL(100ng)回收纯化的重组质粒，轻吸打混匀，置于冰上，冰浴静置5min；液氮速冻5min，37℃热击5min，迅速置于冰上5min；加入700μL无抗生素的LB液体培养基，28℃，振荡培养2-4h；6000rpm离心1min收菌，吸去部分上清；留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上；28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落；菌液PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

2.拟南芥花序侵染

将阳性单克隆菌液扩大培养，摇菌至OD 0.6-0.8时，采用花序浸泡法将目的基因转入野生型拟南芥中。具体过程如下：

将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用含有5％蔗糖的1/2MS溶液悬浮；在浸泡前，加入浓度为0.05％的SilwetL-77，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分未开放的花序在农杆菌悬浮溶液中浸泡15～30sec，期间轻轻晃动；将浸泡过的拟南芥平放至托盘上，用保鲜膜覆盖保湿，避光24h；取下保鲜膜，正常条件下培养至种子成熟，成熟后停止浇水。

3.T2代转基因株系的获得

T1代拟南芥成熟后，收集种子并编号，将T1代种子和野生型拟南芥种子分别放入灭菌过的离心管中，先用灭菌水浸没清洗数次，再用1％的次氯酸钠消毒处理15min；静置后将上清液汲除，用无菌水清洗4-5次，再加入0.1％的琼脂糖，用移液枪将重悬的拟南芥种子点到含有卡那霉素的1/2MS固体培养基上培养；4℃低温春化72h，再移到光照培养箱中培养10d后，观察转基因植株和野生植株生长情况；选取子叶浓绿、根系发达的阳性转基因苗和拟南芥野生苗移栽到营养土中培养获得T2代转基因植株。

4.将过表达LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的T2代转基因拟南芥分别选取三个株系，分别编号为：6-1、6-2、6-3，7-1、7-2、7-3，9-2、9-3、9-4，将转基因植株和野生型植株同时置于-8℃下处理12h，而后在正常光照条件下恢复培养，3天后观察转基因植株和野生型拟南芥植株表型。

结果如图4所示，转LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因的拟南芥植株生长受到低温胁迫的影响小，而野生型植株生长明显受抑制，且叶片有严重的失水萎蔫情况。表明转入鹅掌楸LhCBF6、LhCBF7、LhCBF9基因可以显著增强拟南芥对低温胁迫的耐性。