猪源非解乳糖链球菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种猪源非解乳糖链球菌噬菌体及其应用。

背景技术

非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)是一种兼性厌氧的革兰氏阳性球菌状细菌，厚壁菌门，属于Lancefield D组，镜检为球状或椭圆，呈链状排布，不形成芽孢。在绵羊血平板上展示α溶血现象，尿素酶、七叶苷阳性、；明胶酶、酪氨酸酶、过氧化氢酶、精氨酸脱氨均为阴性、可在6.5％NaCl中生长。它可以发酵葡萄糖、纤维素二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷和蔗糖，但不能发酵阿拉伯糖、甘露醇、乳糖、甘油、棉子糖、核糖、山梨醇、海藻糖或木糖。

非解乳糖链球菌属于马链球菌/牛链球菌复合体(SBSEC)中的一种，其最初发现于猪的肠道，是一种人畜共患传染病的条件致病菌。近些年从人类临床标本中鲜有分离得到，常发现于人和动物的胃肠道中。根据表型特征将非解乳糖链球菌归为绿色链球菌的唾液类链球菌。根据链球菌属的基于基因分析(16s rRNA)分类原则，它现在被纳入牛链球菌/马链球菌复合体。有文献报道显示，非解乳糖链球菌为二尖瓣上感染性心内膜炎(IE)的病原体，可引起严重的心脏反流。

牛链球菌/马链球菌复合体(SBSEC)是一组非肠球菌D组链球菌，在人和动物中都有定植。SBSEC的分类发生了巨大的变化，目前由7个(亚)种组成，根据序列特征分为4个分支：牛链球菌、马链球菌、婴儿链球菌和非解乳糖链球菌分支。由于胃肠道疾病，它们透过肠黏膜屏障切换为条件致病菌，引起菌血症和器官损害。在动物中，SBSEC是瘤胃酸中毒、潜在的蹄叶炎和感染性心内膜炎(IE)的病原体。该复合物在29～55％的炎症性肠病和结肠癌患者中被分离出来，并与高达13％的先天性心内膜炎病例有关。感染后的表现为感染性心内膜炎(IE)、菌血症、骨关节感染、脑膜炎和胆道感染等。此外，SBSEC与结肠病理病变的关系已被大量报道。

目前，对于致病性链球菌感染，一般使用抗生素进行治疗，存在固有抗药性，且随着抗生素使用，抗药性增强随之出现耐药菌株。

然而，噬菌体来源于环境，作为一类细菌依赖性病毒专门侵噬细菌，面对抗生素残留及细菌耐药现象的频发，噬菌体又成为了新型抗菌制剂的候选。由于其具有自我高效复制、特异针对病原、不影响正常菌群且不产生抗性等特点，目前在国内外已有较多成功应用的报道，噬菌体在裂解细菌中发挥的作用方式更为直接。目前没有能够同时针对多种致病性非解乳糖链球菌的噬菌体。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏能够同时裂解多种致病性非解乳糖链球菌的噬菌体的技术问题，提出一种猪源非解乳糖链球菌噬菌体及其应用，该噬菌体RKP-PSA-22009对猪养殖环境中的致病性非解乳糖链球菌具有强裂解作用且能稳定传代，可用于制备猪瘤胃酸中毒、蹄叶炎和感染性心内膜炎等疾病的防治药物。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

猪源非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009，其保藏编号为CGMCC No.45262，于2022年08月31日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，分类命名为非解乳糖链球菌噬菌体。

在一实施方式中，当温度在60℃以下时，所述猪源非解乳糖链球菌噬菌体的效价保持在10

一种猪源非解乳糖链球菌噬菌体在制备杀菌药物、生物制品或制备非解乳糖链球菌引起的传染病药物中的应用。

在一实施方式中，所述生物制品为饲料添加剂和消毒剂/清洁剂，其中所述饲料添加剂和消毒剂/清洁剂为以纯化的猪源非解乳糖链球菌噬菌体制备的单一制剂或以纯化的所述猪源非解乳糖链球菌噬菌体为主要成分制备的复配制剂。

在一实施方式中，所述非解乳糖链球菌包括致病性非解乳糖链球菌，所述致病性非解乳糖链球菌包括A型致病性非解乳糖链球菌、B型致病性非解乳糖链球菌、C型致病性非解乳糖链球菌以及D型致病性非解乳糖链球菌。

在一实施方式中，所述传染病包括猪瘤胃酸中毒、蹄叶炎和感染性心内膜炎。

一种杀菌药物，其有效成分包括猪源非解乳糖链球菌噬菌体。

一种消毒剂或清洁剂，为以纯化的猪源非解乳糖链球菌噬菌体的单一制剂或以纯化的猪源非解乳糖链球菌噬菌体为主要成分制备的复配制剂，用于防治养殖环境中非解乳糖链球菌的污染。

在一实施方式中，所述消毒剂或清洁剂的剂型为液体、冻干粉或片剂；所述养殖环境包括猪体内、猪体表、猪养殖场所地面、猪养殖场所空气、猪饲料、饮水以及养殖器具。

一种饲料添加剂，为以纯化的猪源非解乳糖链球菌噬菌体制备的单一制剂或以纯化的猪源非解乳糖链球菌噬菌体为主要成分制备的复配制剂，添加在猪饲料中，用于防治养殖过程中非解乳糖链球菌的污染。

在一实施方式中，杀菌药物或消毒剂或清洁剂或饲料添加剂，非解乳糖链球菌包括致病性非解乳糖链球菌，根据16S起源进化分析，致病性非解乳糖链球菌包括A型致病性非解乳糖链球菌、B型致病性非解乳糖链球菌、C型致病性非解乳糖链球菌以及D型致病性非解乳糖链球菌。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的猪源非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009，能对猪养殖环境中的致病性非解乳糖链球菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中猪瘤胃酸中毒、蹄叶炎和感染性心内膜炎(IE)等疾病的防治提供了良好的噬菌体来源；

2、本发明提供的猪源非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009在传代30次的条件下，仍然可以保持较高水平的效价，该噬菌体具有较强的遗传稳定性；

3、本发明提供的猪源非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009可用于制备杀菌药物、生物制品或制备非解乳糖链球菌引起的传染病药物。

附图说明

图1为本发明所提供的非解乳糖链球菌在THB血平板上的菌落形态图；

图2为本发明所提供的噬菌体RKP-PSA-22009的噬菌斑形态；

图3为本发明所提供的噬菌体RKP-PSA-22009电镜观察图；

图4为本发明所提供的噬菌体RKP-PSA-22009对宿主的裂解试验效果图；

图5为本发明所提供的噬菌体RKP-PSA-22009遗传稳定性实验结果图；

图6为本发明所提供的噬菌体RKP-PSA-22009热稳定性试验效果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的猪源非解乳糖链球菌噬菌体及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

本实施例为非解乳糖链球菌的分离及其鉴定过程，具体为：

(1)从发病养殖场采样，取病料粪水于Todd-Hewitt Broth(THB)液体培养基(添加0.5％的萘啶酮酸和多粘菌素)中37℃摇床进行过夜增菌培养；

(2)以三线分离法接种到THB血平板(5％绵羊血)上，37℃温箱培养24h后取出观察；

(3)挑取直径1.0mm、圆形光滑、具有溶血环的的菌落接种于THB血平板继续纯化；

(4)5％马血清的THB液体培养基中37℃过夜培养，挑取纯培养物的单个菌落，进行革兰氏染色、镜检、16SPCR测序鉴定；

(5)鉴定完成后菌液中加60％的甘油保存于-80℃，命名为PSA-22009。非解乳糖链球菌在THB血平板上的菌落形态如图1所示。

实施例2

本实施例为噬菌体的分离及纯化、鉴定过程，具体为：

步骤一、噬菌体的分离及纯化

(1)粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g猪粪便加入10mL SM缓冲液中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤器过滤，将滤出液4℃保存备用；

(2)噬菌体富集：取0.2mL非解乳糖链球菌菌悬液和1mL猪粪滤出液加入到5mLTHB液体培养基中，37℃、培养过夜；然后12000rpm离心10min，将上清液用0.22μm滤器过滤，滤出液备用；

(3)噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取宿主非解乳糖链球菌菌悬液0.1mL与0.5％的THB软琼脂混合铺在THB固体平板上，待软琼脂凝固后将滤出液0.1mL点到平板上，静放至混合液吸收，放于37℃培养箱培养6-8h后，用接种环挑取透明的噬菌斑置于2mL SM缓冲液中，4℃保存过夜，让噬菌体完全释放，即得噬菌体；

(4)噬菌体纯化：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主非解乳糖链球菌菌悬液0.2mL混合均匀，加入冷却至50℃左右的软琼脂混合均匀，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取边缘光滑的单个透明斑于1mL SM缓冲液中，4℃过夜保存。取0.1mL过夜保存的浸出液和0.1mL菌悬液混合，加入冷却至50℃左右的软琼脂混合均匀，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h，照此步骤纯化至噬菌斑为大小均一、边缘光滑的噬菌斑，即得纯化好的噬菌体，如图2所示。

(5)噬菌体的制备：取0.2mL非解乳糖链球菌菌悬液和1mL纯化好的噬菌体悬液加入到50mLTHB肉汤中，37℃培养过夜，然后10000rpm离心10min，将上清液用0.22μm滤器过滤，噬菌体滤出液备用；

(6)噬菌体的保存方式：将噬菌体菌悬液与60％的甘油+THB液体培养基按照1∶1的比例混合后，于-80℃中保存，命名为RKP-PSA-22009。

步骤二、噬菌体的形态观察

取20微升含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图3所示。

噬菌体RKP-PSA-22009的电镜图像可知：该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，其直径约为21nm，有一个长约31nm的尾，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

步骤三、噬菌体的分子生物学鉴定

噬菌体全基因组测序及分析：采用Illumina TruSeq

(1)以1μg噬菌体基因组DNA起始量建库；

(2)Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；

(3)补平3’端加A、连接index接头(TruSeq

(4)文库富集，PCR扩增8个cycles；

(5)2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；

(6)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

(7)cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

(8)Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。

测序结果如SEQ ID No.1所示。

噬菌体保藏信息：将噬菌体RKP-PSA-22009于2022年08月31日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45262，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例3

本实施例为噬菌体RKP-PSA-22009对宿主非解乳糖链球菌PSA-22009的裂解效果试验，具体为：

将培养6h的宿主菌悬液以1∶100的比例接种到100mL THB液体培养基中，37℃培养2h(OD约0.15，约5.0×10

结果分析：由图4可知，相比对照组，加入噬菌体的菌液OD

实施例4

本实施例为噬菌体RKP-PSA-22009的稳定性遗传实验，具体为：

将噬菌体连续传代30次，每代培养基中加入等量的噬菌体和宿主菌，每代培养时间6h，然后铺双平板，将噬菌体连续传29代后，测定其效价。结果如图5所示。

结果分析：由图5可知，噬菌体在传代过程中，效价整体稳定，说明噬菌体的生物遗传稳定性较好，有助于后续的生产和运输处理。

实施例5

本实施例为噬菌体RKP-PSA-22009的热稳定性实验，具体为：

将噬菌体原液分装到EP管中，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃及80℃的条件下孵育30min和60min，然后用SM缓冲液10倍比例稀释后，铺双平板测定其效价，结果如图6所示。

结果分析：由图6可知，噬菌体RKP-PSA-22009具有较好的温度耐受性，温度在60℃以下噬菌体效价均保持在较高水平，在10

实施例6

本实施例为非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009的裂解谱系分析，具体为：

本实施例采用双层平板法点板法，测定该非解乳糖链球菌噬菌体RKP-PSA-22009对菌株库保存的56株非解乳糖链球菌的裂解效果，非解乳糖链球菌的具体信息如下：

表1 五十六株非解乳糖链球菌具体信息

利用如表1所示的菌株信息分别制备非解乳糖链球菌菌液，取100μL培养6h的待测菌菌液加入到0.5％的THB半固体培养基中混匀，倒入平皿中，静置凝固。取10μL噬菌体悬液滴加到软琼脂平皿上，37℃培养4～6h左右，观察有无噬菌斑出现。

本发明噬菌体裂解菌株库保存的56株非解乳糖链球菌中的51株，裂解率为91.07％，其中A型裂解率100％、B型裂解率100％、C型裂解率83.33％、D型裂解率81.25％。由此可见，噬菌体非解乳糖链球菌具有宽裂解谱、高裂解率。

实施例7

本实施例为噬菌体RKP-PSA-22009的安全性检测，具体为：

本次实验以小鼠为实验对象，所用小鼠为7～8周龄雌性SPF级小鼠，重约25g左右，共40只。分为2组，各20只；其中实验组正常饲喂加噬菌体10

结果分析：观察结果显示，以此量的噬菌体饲喂实验用小鼠，小鼠的日常行为均正常，解剖检查小鼠的内脏无异常，饲喂结束两到三天后，在小鼠的粪便中检测不到噬菌体的存在。