一株巴氏假单胞菌及其在抑制植物病原菌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株巴氏假单胞菌及其在制备植物病原菌抑菌剂中的应用。

背景技术

生物防治大致可以分为以虫治虫、以鸟治虫和以菌治虫三大类。它是降低杂草和害虫等有害生物种群密度的一种方法。它利用了生物物种间的相互关系，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。它的最大优点是不污染环境，是农药等非生物防治病虫害方法所不能比的。

近年来，假单胞菌作为一种具有巨大发展前景的菌属，在生物技术领域被广泛研究。其中铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、托拉氏假单胞菌研究最为普遍。

假单胞菌是重要的植物促生菌种之一，能够快速生长，并且对于植物根系有很好的定植能力。该菌属通过定植根际和各种植物隔室与植物有益地相互作用。假单胞菌通过促进养分吸收、调节植物激素水平以及通过诱导的全身抗性提供直接和间接的植物病原体生物防治来促进植物生长，说明该菌属具有刺激植物生长，保护和防御寄主植物免受病原体侵害的能力。澄清对作物有益的假单胞菌及其属性有助于改善作物营养和保护可持续农业生产。

王氏葡萄孢菌是三华李叶斑病、板栗的枝干、叶片及果实病株的主要病原体；六出花莲格孢菌是内生真菌，是烟草种子、猪笼草、哥伦比亚切花、黑斑病的主要病原体；隐秘刺盘孢菌是英国波斯核桃、辣椒、草莓、苹果、梨的主要病原体；长镰刀菌是玉米叶斑病、玉米丝黑穗病、小麦茎基腐病的主要病原菌；布氏镰刀菌是玉米根腐病、茎腐病、穗腐病的主要病原菌；莱安附球菌是燕麦叶片黑斑病、茶叶斑病的主要病原菌；毛莨葡萄孢菌是石龙巧、文殊兰、花毛莨的主要病原菌；分支横梗霉是降解秸秆、亚麻籽、麦曲、甘草的主要病原菌；附球菌属是苹果霉心病的主要病原菌。

目前还未有巴氏假单胞菌抑制上述病原菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica)，该细菌保藏的保藏编号为CCTCC NO:M20231586。

本发明的另一个目的在于提供一株巴氏假单胞菌的在制备抑菌剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人自云南麻栗坡县撕裂贝母兰根际环境样中，分离出一株对多种病原菌具有抑菌作用，且抑菌率高的细菌，经鉴定为巴氏假单胞菌，该细菌已于2023年09月04日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：Pseudomonas baetica BY19，保藏编号为：CCTCC NO:M20231586。

分离得到的巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica)BY19，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态为淡黄色表面光滑的圆形，菌落饱满不透明。生理生化表现为革兰氏阴性；有荧光；具端生鞭毛，能运动；好氧；不形成孢子；过氧化氢酶反应为阳性。本发明的保护范围还包括：

巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica)BY19在抑制植物病原菌中的应用；

巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica)BY19在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用；

以上所述的病原菌，优选的，所述的植物病原菌为王氏葡萄孢菌(Botrvosphaeriawang ensis)、六出花莲格孢菌(Alternaria alstroemeride)、隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigm a)、长镰刀菌(Fusarium longifundum)、布氏镰刀菌(Fusariumboothii)、莱安附球菌(Ep icoccum layuense)、毛莨葡萄孢菌(Botrvotinia rannculi)、分支横梗霉(Lichtheimia ramos a)、附球菌属(Epicoccum phragmospora)。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

本发明中的巴氏假单胞菌BY19为植物根际分离菌种，此前未有报道过该菌在植物病原菌中的抑制功能。

本发明中的巴氏假单胞菌BY19生长迅速，有较强的耐盐能力，环境适应能力强。

本发明中的巴氏假单胞菌BY19对导致植物枯萎病的多种致病菌均有较好的抑菌效果，首次报道了一株对王氏葡萄孢菌(Botrvosphaeria wangensis)、六出花莲格孢菌(Alternariaalstroemeride)、隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)、长镰刀菌(Fusarium longifundu m)、布氏镰刀菌(Fusarium boothii)、莱安附球菌(Epicoccumlayuense)、毛莨葡萄孢菌(Botrvotinia rannculi)、分支横梗霉(Lichtheimia ramosa)、附球菌属(Epicoccum phragmosp ora)都有抑制效果的的巴氏假单胞菌BY19。

附图说明

图1为巴氏假单胞菌的培养性状图。

图2为巴氏假单胞菌对王氏葡萄孢菌(BY19-1)、六出花莲格孢菌(BY19-2)、隐秘刺盘孢菌(BY19-3)、长镰刀菌(BY19-4)、布氏镰刀菌(BY19-5)、莱安附球菌(BY19-6)、分支横梗霉(BY19-8)、附球菌属(BY19-9)的抑制作用示意图；

图2中A到P依次为隐秘刺盘孢菌(BY19-3)、附球菌属(BY19-9)、王氏葡萄孢菌(BY19-1)、布氏镰刀菌(BY19-5)、六出花莲格孢菌(BY19-2)、莱安附球菌(BY19-6)、长镰刀菌(BY19-4)、分支横梗霉(BY19-8)。

图3为巴氏假单胞菌对毛莨葡萄孢菌(BY19-7)的抑制作用示意图。

图4为巴氏假单胞菌对不同病原菌的抑菌率的柱状图；

其中：A：巴氏假单胞菌对对王氏葡萄孢菌(BY19-1)；B：六出花莲格孢菌(BY19-2)；C：隐秘刺盘孢菌(BY19-3)；D：长镰刀菌(BY19-4)；E：布氏镰刀菌(BY19-5)；F：莱安附球菌(BY19-6)；G：分支横梗霉(BY19-8)；H：附球菌属(BY19-9)。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

巴氏假单胞菌BY19的分离及鉴定：

来自于云南麻栗坡县的撕裂贝母兰根际环境样品置于灭菌的空试管中,并于该试管中加入5mL无菌水,振荡摇匀后静置，即得样品悬液。之后使用无菌移液枪头吸取0.5mL上述母液，移至装有4.5mL无菌水的空试管中，取10

(1)形态特征

分离得到的巴氏假单胞菌，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈淡黄色表面光滑的圆形，菌落饱满不透明。

(2)生理生化实验

生理生化表现为革兰氏阴性；有荧光；具端生鞭毛，能运动；好氧；不形成孢子；过氧化氢酶反应为阳性。

(3)巴氏假单胞菌(Pseudomonas baetica)的基因鉴定

用细菌DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：

27F:5＇-GTTTGATCCTGGCTCAG-3＇

1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇；

经16SrDNA序列同源性比对分析，结果表明其与菌株Pseudomonas baetica的16SrD NA基因序列相似性最高，属于一株巴氏假单胞菌，该细菌已于2023年09月04日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：Pseudomonas baeticaBY19，保藏编号为：CCTCC NO：M20231586。

培养基：LB培养基(/L)：酵母浸粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g；摇瓶：250mL锥形瓶；35℃条件下培养15h，巴氏假单胞菌有效菌浓度达到10

实施例2：

巴氏假单胞菌BY19的耐受性测试：

(1)耐pH范围实验：

将巴氏假单胞菌BY19种子液按照1％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在35℃、160r/min条件下培养，培养15h后取样测OD

LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

表1巴氏假单胞菌BY19对不同pH培养基的耐受情况

(2)耐盐浓度试验：

将巴氏假单胞菌BY19种子液按照1％的量分别接种于盐浓度不同的LB培养基中，在35℃、160r/min条件下培养，培养15h后取样测OD

0％、。(1％盐浓度：0.05gNaCl/5g水，以此类推)。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

表2巴氏假单胞菌BY19对不同盐度培养基的耐受情况

综合(1)-(2)的结果，本发明提供的巴氏假单胞菌BY19对盐浓度的适应范围较为广泛，能适应的pH范围为5-8，能在0％-10％的盐浓度下生长，并且在10％的盐浓度下也能持续缓慢生长。巴氏假单胞菌BY19在pH 8，盐浓度0％的条件下生长最快，在此最适条件下培养15h，巴氏假单胞菌BY19有效菌浓度达到10

实施例3：

巴氏假单胞菌BY19对植物病原菌的抑制作用：

采用抑菌圈法测定巴氏假单胞菌BY19对病原菌的抑制能力。用LB活化巴氏假单胞菌BY19，将种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上用枪头进行打孔，挑取真菌菌块倒置接种在涂有巴氏假单胞菌BY19的PDA平板上，将平板置于35℃培养4d，测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。

本实验选取的植物病原菌有王氏葡萄孢菌(Botrvosphaeria wangensis)、六出花莲格孢菌(Alternaria alstroemeride)、隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)、长镰刀菌(Fusar ium longifundum)、布氏镰刀菌(Fusarium boothii)、莱安附球菌(Epicoccumlayuense)、毛莨葡萄孢菌(Botrvotinia rannculi)、分支横梗霉(Lichtheimia ramosa)、附球菌属(Epicoc cum phragmospora)

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。

注：D，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。

结果如图2和4所示，巴氏假单胞菌BY19对常见的布氏镰刀菌、王氏葡萄球菌、隐秘刺盘孢菌、六出花莲格孢菌有非常好的防治效果，对引起这三种植物病害的致病菌的抑制率均能达到90％以上；对长镰刀菌、莱安附球菌的抑制率都在88％以上；对分支横梗霉、附球菌属的抑制率仅达到80.45％及76.42％，对各菌的抑菌率如下表所示。

表3巴氏假单胞菌BY19对不同菌株的平均抑菌率

其中毛莨葡萄孢菌(BY19-7)由于菌丝状态为粉末状，从图3可以看到，孢子散落出来后基本都正常生长，因此可视为本发明的巴士假单胞菌BY19对该病原菌无抑菌效果。

由以上实施例可知，本发明提供了一株巴氏假单胞菌BY19，对于防治王氏葡萄孢菌、六出花莲格孢菌、隐秘刺盘孢菌、长镰刀菌、布氏镰刀菌、莱安附球菌、毛莨葡萄孢菌引起的植物枯萎病均具有良好的防治效果，具有制备成生物防治剂的巨大潜力，但对分支横梗霉和附球菌属的抑制作用较差，仅达到80.45％及76.42％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。