一种促进番茄不定根的基因及其瞬间过表达的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进番茄不定根的基因及其瞬间过表达的方法和应用。

背景技术

在自然界中，植物为了适应不同的环境条件，会形成多种不同形态的根器官，如主根、侧根和不定根。其中，不定根是一种特殊的根器官，它由植物的非根部分形成，如茎生根、伤口根和节点根。这些不定根的形成通常受到外部因素的影响，例如涝渍或伤口刺激。

尽管不定根在植物生长和适应环境方面起着重要作用，但其发育过程的分子机理仍然不十分清楚。目前，研究者将不定根的发育过程大致分为三个阶段：诱导、起始和延伸。在起始阶段，新细胞壁的生成减少，现有细胞壁逐渐弱化。同时，与生长素运输、水分胁迫、光合作用和细胞壁合成相关的蛋白质表达水平下调，而编码延伸起始因子的基因表达水平上调。在这个过程中，一些基因家族如CRL、ARL和RTCS也对不定根的遗传调控产生影响。此外，参与生长素转运和应答、细胞壁发生以及细胞壁修饰的基因和蛋白质也在不定根的发育中发挥重要作用。

虽然已经取得了一些关于不定根发育的重要研究成果，但仍需要更多的工作来揭示不定根形成的分子机理，以及如何有效地促进不定根的生成。

不定根在植物生长和适应环境方面起着重要作用，如辅助攀爬，固定支撑，辅助呼吸等。番茄自然情况下上胚轴和上部分茎节间不容易产生茎生根，这可能会限制植物的生长和适应能力，因此增加不定根的形成非常重要。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种通过瞬时过表达特定基因，促进植物茎生根和胚轴生根，从而增加番茄不定根的数量和长度的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种通过瞬时过表达特定基因，促进植物茎生根和胚轴生根的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种促进番茄不定根发生的基因，包括基因solyc10g079310、Solyc02g085500、Solyc05g051520、Solyc02g082180、Solyc01g100730、Solyc08g068620、Solyc08g068680、Solyc09g066270、Solyc08g079430、Solyc02g091820、Solyc08g068640或/和Solyc08g068630，其中基因solyc10g079310的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示、Solyc02g085500的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示、Solyc05g051520的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示、Solyc02g082180的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示、Solyc01g100730的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示、Solyc08g068620的核苷酸序列如SEQID No.6所示、Solyc08g068680的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、Solyc09g066270的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示、Solyc08g079430的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示、Solyc02g091820的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示、Solyc08g068640的核苷酸序列如SEQID No.11所示、Solyc08g068630的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供了一种瞬间过表达如以上基因的方法，包括以下步骤：

步骤1、基因克隆，克隆基因solyc10g079310、Solyc02g085500、Solyc05g051520、Solyc02g082180、Solyc01g100730、Solyc08g068620、Solyc08g068680、Solyc09g066270、Solyc08g079430、Solyc02g091820、Solyc08g068640或/和Solyc08g068630中一个或几个CDS序列；

步骤2、载体构建，通过T4连接酶使将步骤1得到的CDS连接在pMD19-T上得到含有CDS的pMD19-T载体；以载体为模板，设计带植物表达载体同源臂的特异性引物，PCR扩增，将CDS同源重组到到植物表达载体上；通过液氮速冻转化进农杆菌感受态细胞；

步骤3、制备外植体，外植体包括上胚轴外植体和番茄苗；上胚轴外植体在预培养基质中培养，得到预培养的上胚轴外植体；番茄苗在培养基质中培养长大得到培养后的番茄；

步骤4、制备农杆菌侵染悬浮液；

步骤5、侵染，分别利用步骤4得到的农杆菌侵染悬浮液侵染步骤3得到的预培养后的上胚轴外植体和培养后的番茄。

进一步地，步骤2中植物表达载体为pCAMBIA1301载体，pCAMBIA1301载体为含有CaMV 35S强启动子和两个酶切位点酶切后的质粒载体。

进一步地，步骤3中上胚轴外植体的制备步骤为：番茄种子用75％乙醇消毒1min，灭菌蒸馏水洗1次，10％ NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，在超净台上转入灭菌的三角瓶中，灭菌蒸馏水洗4次，接种于播种培养基，种子之间间隔0.8cm左右。25℃黑暗条件下培养至发芽(约3～4天)，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。种子发芽后没长出真叶之时，或真叶初露时，用手术刀切割幼苗只留胚轴上部分和一边的小半片子叶，处理后的幼苗正插入预培养基中预培养48h，避光。

进一步地，步骤3中番茄苗的培养基包括土：蛭石：珍珠岩，体积比为3：1：1。

进一步地，步骤3中番茄苗的培养步骤为：番茄苗在培养基质中培养，长大移至温室大棚里培养2个月，得到培养后的番茄。

进一步地，步骤4还包括：在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于1mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min培养20h左右,再按1:1000比例接种到50ml含有抗生素和As的LB,28℃、200r/min过夜培养至对数中期。培养好的农杆菌菌液转到50mL离心管(封口膜封口)，4000r/min离心10min，倒出培养基，加入5ml侵染液润洗去LB中的杂质，涡旋混匀，4000r/min离心10min，涡旋混匀，倒出培养基，加入5ml侵染液，测量OD

进一步地，步骤5还包括：

步骤5.1、将预培养的外植体转移到悬浮好的菌液中，浸染，弃掉侵染液，得到浸染后的外植体；将浸染后的外植体放入共培养基中共培养，得到共培养后的外植体；将共培养后的外植体在生根培养基培养；

步骤5.2、在番茄茎段处，斜切出创口；在创口处用农杆菌侵染悬浮液注射侵染，将拌好的湿润的泥土装入扦插球，固定于创口附近。

进一步地，步骤5.1还包括：将预培养的外植体转移到悬浮好的菌液中，浸染10min，弃掉侵染液。将外植体转移到干燥灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，平放入共培养基中(铺有滤纸)，暗培养2d。共培养后，将外植体平铺在生根培养基上，培养基上铺有一层尼龙纱布防止根生长进培养基中，6个外植体/盘，7天后观察新根生长的情况。；

进一步地步骤5.2还包括：用刀片在番茄茎段处(光滑表面)，斜30°切三个创口。创口处用移液枪吸取农杆菌菌液注射侵染，注射时用纸巾吸收溢出的菌液，间隔一段时间后重复操作，共重复三次。刀片每次使用后用75％酒精消毒。将拌好的湿润的泥土装入扦插球，固定于创口附近，用绑绳绑紧，并标识清楚。7天后观察新根生长的情况。

进一步地，播种培养基为：1/2MS、浓度为15g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂，PH为5.8；预培养培养基为：1/2MS、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为8g/L的琼脂，PH为5.8。

进一步地，生根培养基为：1/2MS、浓度为15g/L的蔗糖、浓度为300mg/L的特美汀、浓度为3mg/L的潮霉素、浓度为8g/L的琼脂，PH为5.8；共培养基为：1/2MS、浓度为30g/L的蔗糖、乙酰丁香酮、浓度为8g/L的Agar；PH为5.8。

本发明还提供了一种瞬间过表达促进番茄不定根的基因的方法在促进番茄不定根发生的应用。

在本发明的较佳实施方式中，详细说明瞬间过表达促进番茄不定根的基因的过程。

本发明有益的技术效果如下：

本发明通过瞬时过表达特定基因，促进植物茎生根和胚轴生根，从而增加番茄不定根的数量和长度。通过构建农杆菌过表达载体，在番茄的茎上创造切口，表达一个或几个能促进番茄不定根发生的基因，达到促进番茄不定根生长的目的。有助于改善植物的生长状况和适应性，对农业和生态系统具有重要意义。具体为：

增强植物适应性：不定根在植物的生长和适应环境中发挥重要作用。通过增加不定根的生成，植物可以更好地适应各种环境条件，如干旱、盐碱地、恶劣气候等。

增加植物生长支撑能力：在一些攀爬植物中，不定根可以用来攀附和支撑植物体，从而提高其生长高度和竞争力。

增加气根数量：气根是一种特殊的根，能够在水中或湿润土壤中吸取氧气。通过促进不定根的生成，可以增加植物的气根数量，有助于水生植物生存。

提高植物繁殖效率：不定根也可以用于无性繁殖，通过增加不定根的生成，可以提高繁殖效率，加速新植物的培育过程。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例1的实施流程示意图；

图2是本发明的一个较佳实施例1的侵染上胚轴结果图；

图3是本发明的一个较佳实施例1的侵染番茄茎结果图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1瞬间过表达促进番茄不定根的基因

瞬间过表达促进番茄不定根的基因实施的流程图如图1所示，包括以下步骤：

1、基因克隆：从番茄[S.lycopersicum cultivar(cv)M82]根cDNA中克隆得到表1中12个基因的一个或几个CDS序列。设计基因特异性引物，并进行序列扩增，获得目的序列。

表1促进番茄不定根的基因

2、载体构建：通过T4连接酶使基因CDS连接在pMD19-T上。选择含有CaMV 35S强启动子的植物表达载体(pCAMBIA1301载体，以下简称1301载体)，选择启动子后适宜的两个酶切位点酶切质粒载体。以含有目的基因的pMD19-T载体为模板，设计带1301载体同源臂的特异性引物，PCR扩增，目的片段同源重组到线性的1301载体上。将构建好的1301基因过表达载体,通过液氮速冻转化进LBA4404农杆菌感受态细胞。

3、外植体制备：

a)上胚轴外植体制备：番茄种子用75％乙醇消毒1min，灭菌蒸馏水洗1次，10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，在超净台上转入灭菌的三角瓶中，灭菌蒸馏水洗4次，接种于播种培养基，种子之间间隔0.8cm左右。25℃黑暗条件下培养至发芽(约3～4天)，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。种子发芽后没长出真叶之时，或真叶初露时，用手术刀切割幼苗只留胚轴上部分和一边的小半片子叶，处理后的幼苗正插入预培养基中预培养48h，避光。

b)番茄苗培养：番茄在培养基质中(土：蛭石：珍珠岩，体积比3：1：1)培养，番茄苗长大移至温室大棚里培养2个月。

4、农杆菌侵染悬浮液制备：

在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于1mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min培养20h左右,再按1:1000比例接种到50ml含有抗生素和As的LB,28℃、200r/min过夜培养至对数中期。培养好的农杆菌菌液转到50mL离心管(封口膜封口)，4000r/min离心10min，倒出培养基，加入5ml侵染液润洗去LB中的杂质，涡旋混匀，4000r/min离心10min，涡旋混匀，倒出培养基，加入5ml侵染液，测量OD600,调整OD600为0.4，加吐温，摇匀。

5、侵染：

a)侵染上胚轴：将预培养的外植体转移到悬浮好的菌液中，浸染10min，弃掉侵染液。将外植体转移到干燥灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，平放入共培养基中(铺有滤纸)，暗培养2d。共培养后，将外植体平铺在生根培养基上，培养基上铺有一层尼龙纱布防止根生长进培养基中，6个外植体/盘，7天后观察新根生长的情况，结果如图2所示，图中左3株苗为瞬时转染一个或几个目的基因的过表达载体，侵染番茄上胚轴；右3株苗为瞬时转染1301空载体，作为阴性对照，侵染番茄上胚轴。可见与对照株苗比，瞬时转染的株苗不定根明显长度增加且数量增多。

b)侵染番茄茎：用刀片在番茄茎段处(光滑表面)，斜30°切三个创口。创口处用移液枪吸取农杆菌菌液注射侵染，注射时用纸巾吸收溢出的菌液，间隔一段时间后重复操作，共重复三次。刀片每次使用后用75％酒精消毒。将拌好的湿润的泥土装入扦插球，固定于创口附近，用绑绳绑紧，并标识清楚。7天后观察新根生长的情况，结果如图3所示，图中A部分为成熟2个月的番茄植株，瞬时转染一个或几个目的基因的过表达载体，番茄茎第四节间，1周后的生长情况。图B为成熟2个月的番茄植株，农杆菌1301空载体瞬时转染番茄茎第四节间，1周后的情况，作为阴性对照。可见与对照植株比，瞬时转染的植株不定根明显长度增加且数量增多。

6、培养基配方：

a)播种培养基：1/2MS+蔗糖(15g/L)+Agar(8g/L)；PH＝5.8

b)预培养培养基：1/2MS+蔗糖(30g/L)+Agar(8g/L)；PH＝5.8

c)共培养培养基：1/2MS+蔗糖(30g/L)+乙酰丁香酮(100μM)+Agar(8g/L)；PH＝5.8

d)侵染液(胚轴生根)：MS+蔗糖(30g/L)+乙酰丁香酮(100μM)；PH＝5.8

e)侵染液(茎生根)：MgCl2(10mM)+2-(N-吗啉代)乙磺酸(10mM)+乙酰丁香酮(100μM)；PH＝5.6。

f)生根培养基：1/2MS+蔗糖(15g/L)+特美汀(300mg/L)+潮霉素(3mg/L)+Agar(8g/L)；PH＝5.8

吐温母液：50ml侵染液+50滴吐温，过滤灭菌。100ml侵染液中加2滴吐温。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。