与花生蔗糖含量紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及与花生蔗糖含量紧密连锁的分子标记及应用，属于分子生物学领域。

背景技术

栽培花生(Arachis hypogaea L.；2n＝4x＝40)是一种重要的油料和经济作物，在世界范围内得到广泛种植。花生籽不仅含有丰富的蛋白质(20-40％)、脂质(40-60％)和碳水化合物(10-20％)，还含有丰富的维生素、矿物质和抗氧化剂，可以直接食用、煮、烤，也可以加工成糖果、饼干和巧克力。花生被认为是市场上最受欢迎和重要的坚果之一，其在食品中的消费量不断上升。由于消费者的偏好，风味是花生在食品使用中重要的考虑因素。蔗糖是花生种子中的主要碳水化合物，约占花生种子总糖的90％，直接影响生花生的甜度。此外，由于蔗糖的水溶性，它可以被水解成果糖和葡萄糖，并在烘烤过程中与游离氨基酸发生反应，产生特色风味，所以蔗糖含量成为食用花生品种培育中重要的衡量指标，有必要了解花生蔗糖代谢的分子机制，确定花生蔗糖代谢的关键调控因子。

栽培花生可能来源于两个二倍体野生种Arachis duranensis(AA)和Arachis

竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)可在广泛的基因组DNA样品中进行(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。与TaqMan双色标记探针法、MassARRAY分子量阵列技术、Affymetrix SNP芯片相比，KASP技术灵活性更高、试剂成本低，同样成本至少获得两倍的数据量。因此，利用花生重组自交系群体，对花生蔗糖含量的调控基因进行QTL定位，并基于目标基因开发分子标记，可应用于花生育种中。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供2个与花生蔗糖含量紧密连锁的分子标记及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

与花生蔗糖含量紧密连锁的分子标记，所述分子标记为qSucA06和qSucA16；

分子标记qSucA06位于花生第6染色体的115,805,462bp处，该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，

分子标记qSucA16位于花生第16染色体的148,167,815-148167817bp处，该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，

扩增所述分子标记qSucA06的KASP引物组合包括：

qSucA06_F1:5’-CATTGTTATCAGTGAGGGAGCTTG-3’，

qSucA06_F2:5’-CATTGTTATCAGTGAGGGAGCTTT-3’，

qSucA06_com:5’-CCCAATTCCTCTCTTCTCTTTCAG-3’；

扩增所述分子标记qSucA16的KASP引物组合包括：

qSucA16_F1:5’-TGAATCGAGGGATTATGTGTTCATC-3’，

qSucA16_F2:5’-GTTGCTAGCAAAATTTGCCCAACAA-3’，

qSucA16_com:5’-GATTTATGTGCAAACAACAATTATAAAAGGACAT-3’。

进一步，所述的分子标记在以下任一项的应用：

(1)在花生蔗糖含量性状表型鉴定中的应用，

(2)在筛选或创制花生蔗糖含量性状不同的花生中的应用，

(3)在花生蔗糖含量基因分型中的应用，

(4)在花生分子辅助标记育种中的应用。

进一步，所述的分子标记鉴花生蔗糖含量性状表型的方法，包括如下步骤：

(1)提取待鉴定花生样本的DNA，

(2)以DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，

(3)通过SNPLine基因分型平台对待鉴定花生蔗糖含量性状表型样本qSucA06和qSucA16分子标记位点进行基因分型；

(4)步骤(3)中判断待鉴定花生蔗糖含量性状表型的方法如下：

若qSucA06的SNP位点的分型结果为突变型(A:A)且qSucA16的InDel位点的分型结果为突变型(Del:Del)时，则待鉴定花生样本为高蔗糖含量；

若qSucA06的SNP位点的分型结果为野生型(C:C)且qSucA16的InDel位点的分型结果为野生型(WT:WT)时，则待鉴定花生样本为低蔗糖含量。

本发明有益效果：

本发明利用冀花甜1号(JT1)和PI478819为亲本的F2遗传群体，构建高、低糖混池进行BSA分析和进一步的精细定位，定位到2个调控花生蔗糖含量的QTL(qSucA06和qSucA16)分子标记，qSucA06影射的物理图谱位置为Chr06:115,805,462bp-115,930,751bp，LOD值为42.93，遗传贡献率为24.03％，qSucA16影射的物理图谱位置为Chr16:148,104,817bp-148,167,815bp，LOD值为60.34，遗传贡献率为37.67％。该QTL区间与来自不同亲本的遗传群体定位的结果有重叠，进一步验证了这2个QTL分子标记的稳定性。

本发明基于qSucA06和qSucA16区间和基因转录本序列的差异，获得了调控蔗糖含量的候选基因arahy.42CAD1和arahy.3URM83。基于候选基因的野生型和突变型序列，开发了A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817InDel位点的KASP分子标记，该分子标记在花生不同亲本遗传群体中的分型结果与蔗糖含量紧密连锁，证明了该分子标记的准确性。该KASP标记能够快速准确的获得花生蔗糖含量信息，且能应用于花生分子辅助标记育种中。

附图说明

图1：“JT1×PI478819”RIL群体子代材料的蔗糖含量分布图；

图2：目标基因结构注释和突变位点信息；

图3：A06.115805462SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点在“JT1×PI478819”RIL群体中的KASP验证；

图4：“JT1×PI478819”RIL群体中A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点与蔗糖含量的连锁性关系图；

图5：在自然群体材料中A06.115805462的SNP位点和A16.148167815 -148167817的InDel位点与蔗糖含量的连锁性关系图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法均为常规方法。

实施例1花生蔗糖含量主效QTL的获得

(1)利用冀花甜1号(JT1)和PI478819组配组合，通过SNPLine基因分型平台检测结果剔除假杂种，自交获得拥有813个家系的F

表1四种BSA分析法获得的花生蔗糖含量相关的候选区间

(2)“JT1×PI478819”F

(3)基于BSA分析法获得的QTL初定位区间，开发了31个SNP/Indel位点的KASP标记，通过SNPLine基因分型平台对“JT1×PI478819”F

申请人先前对“JT1×PI478819”F

表2“JT1×PI478819”RIL群体中花生蔗糖、油和蛋白质含量的QTL定位结果

(4)QTL区间内候选基因分析

基于qSucA06和qSucA16两个QTL区间及两翼的标记寻找目标性状的重组单株和重组单元。qSucA06位于6号染色体的115,805,462-115,930,751bp，区间大小为125.29Kb，注释的基因有14个，其中只有一个基因(arahy.42CAD1)发生有义突变(图2a)，该突变位点位于6号染色体的115805462bp处，C碱基突变为A碱基，翻译提前终止。qSucA16位于16号染色体的148,104,817-148,167,815bp，区间区间大小为63.00Kb，注释的基因有7个，其中有2个基因(arahy.QB6IYV和arahy.3URM83)发生有义突变(见表3)。

表3QTL区间内候选基因突变位点分析

以参考基因信息设计了arahy.3URM83基因的引物，在JT1籽仁的cDNA中扩增到了其转录本，分析该转录本发现，其包含2个CDs序列，命名为gene1和gene2(图2b)。其中gene1与6号染色体上的arahy.42CAD1基因高度同源，gene2与6号染色体上的arahy.8JVH3I基因高度同源。利用IciMapping软件分析连锁图谱上各位点的上位性，发现qSucA06和qSucA16在蔗糖、油和蛋白质含量上都存在上位性，LOD值19.20-50.31，表型贡献率为61.20-79.20％，所以qSucA06和qSucA16的目标基因可能是同源基因。自然群体材料中，在arahy.42CAD1和gene1的突变位点与JT1基因型相同材料的蔗糖含量大于7％，与JT1基因不同的材料蔗糖含量低于6％。而自然群体材料中，在arahy.42CAD1和arahy.QB6IYV基因的突变位点与JT1基因型相同的材料的蔗糖含量在3％-6％之间，所以将arahy.42CAD1和gene1作为调控蔗糖、油和蛋白质含量的目标基因。

实施例2目标基因突变位点的KASP分子标记开发与验证

arahy.42CAD1基因上的SNP突变位点是A06.115805462，该位点位于花生第6染色体的115,805,462bp处，该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，

ACTCTGAACCCTAATTACCCAAATAATACAGCAAAAACGGCTGAGATC ATGTCAAGGTATAGGCCAATAGCTCCAAAGCCAGATACCAATAATTCCTCAT[

ACTCTGAACCCTAATTACCCAAATAATACAGCAAAAACGGCTGAGATC ATGTCAAGGTATAGGCCAATAGCTCCAAAGCCAGATACCAATAATTCCTCAT[

扩增分子标记位点的KASP引物组合包括：

qSucA06_F1:5’-CATTGTTATCAGTGAGGGAGCTTG-3’(SEQ ID NO:3)，qSucA06_F2:5’-CATTGTTATCAGTGAGGGAGCTTT-3’(SEQ ID NO:4)，qSucA06_com:5’-CCCAATTCCTCTCTTCTCTTTCAG-3’(SEQ ID NO:5)。

arahy.3URM83基因上的InDel突变位点是A16.148167815-148167817，该InDel位点位于花生第16染色体的148,167,815-148167817bp处，该位点前后100bp的序列如SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7所示，

GATTGAATGGCAAAGCAGTGAAGATCAGAGGAAGAAGTTTTGTGTGA ATGCTTTCTGTGATGTTACCAAGTTGTGTTGTGAATCGAGGGATTATGTGTT C[TCATGGAGGTTCCACACACGTACCAGAGAAGCTTCTCAATCTAGTTGCAA TCTTTAAGAAATTTGCATGTTTTTATTTTCTTCTTAGATTATATAGTTCTAGTAGTAGTGTGAAACCTTAGCTTGTTCTTATTATTATCTATATATATTATACATATCTATGTACATTATTACATAGTTATATAATAGATATATGCTAATATAGTATTAGCTATCAATTATATATAGTTTTGTTATGCTTTTGCCTTATAATATTAATGTACTTTAAGGACAAAGTTTGCTAGTTATGTATCTTGGTGTTCCCTTCATTTTCCTAATTCTCTTTTCAGTTGCTAAACAAATCTCTTGAATTTTTATTTTTAGGTAACTATATTCTAAATTTGTCTAAATAGTTGTAGAGTGTTAAATGAATATTTAACTATATGTTTAGTTAAATATCTTTTATTATTTAATTAAATATGTTTGATTAAATTATTTAACTGTTTATAATATCTTTAAACCTTCGAATGAGGATATCTAATCTAAATATGTTTGATTAAATTATTTAACAATATATCGTAGTAAAAAAATGTTTATAATATTATTTTTAAATAAATATATTATATTGTTGAAATAATCATCTTAATTTTTTTTTATAGTGATACATTTAGGAGACTTTTGGCTTTGTTTATGTTTATGTTTATAATTCTTATATTTATACAATTAGGAAGATCTTTGACCTTCATGGAATGTTGTTATTGAGTTAGTTTGAGATCCGCTATTAGATTTGTCTTAATAACTAGGAAAAGAATACGTTATTAAGAGAGAGTCTGCAAACTATTACCAACACGTGATAAATTAGGATTAAATCATGATTAACTTAGATAAATTAGGAATAAACCATAATTAACTTAGATATGGTTTTATTTAGTAGATGGGTTTCATGTCCAACCCAATTTAAGTTGGCAGATTTTGTCAGATAAAAAGTTAGTAAGTTGGCAGATTTTGACAGATCAAAAATTGGTAACGTAGCACTACTCAAGTTGACAGATAAAAAGTTGGTAACTTAGCACTACTGTAATAACTATATTGGACTAGTAGCATTATCTATACAAAATCACTGATTGCATTTTGTTCCTTTTTTTTATATAGAGTTAAGCTTATTCTAATTATTGATAAAAAAGATTGATAATATAAAATAGTTTTACACAAATATTTAAATGTATACTGTTCTATTTTTAAAAATAA

TCTGAATTTGATTAAATGTTTACATCAAAATTAAACTTAAAAAAAAAAGGAA

TGCACATCAAATATGAAGATTCCATGAAATTAGGAAACAGAAAATATACAA

AGGTTGCCATTAGAGGTTTAAATTGAAACAAACAAATAGTCGTGAGTAAAT

TCTCAATCTCATATTCTCATATCCAAATAAAAAACAGCAAATCGTTTCCTTTA

ATAAAAAATTAAATATATGTAGTTTATTATTAAATATTTAATTATGTAATTACA

AAATATATAAATTAATATATAAAAAAATTATATCATAATATGACTAATTTAATTC

CTGAATTTTTTTATCGAAAAAATATTTAATAATTTATCAAAGTCTAACAAGAA

ACTAGTTTATTCTGAATGCATTTATTATGAAACAACCACAGATTTGGGAATCT

ATTTTAAAACTATATAGGATGATTATATCAAAACTTCCAAAAGAACATATCAA

GACTTGACGTTTATTAGAATCCACTTAGGCGATCATTTTCAGAGTGATTAAT

TTATTGATTATTATTAATATTATTGTTTTAAAAAATGAAAGAATGAATAACAA

AAGTTAAATACCGGCTTTGCATATTCTAAGCTGCCCAGTTGTCGTTTTGTTT

GTTTCTCACAATGAAACGCCATTTGTATCCCTTGTTCACATCGAGCATTATTC

TTTCCACATCTTCTTCTTTTCAACAATGAAAATTTCTTCGGAATAAATGGTC

CAATATAACTCGTTAATTAATATACTAATTATTTTTTATTAGAGCCGGAAAAA

CTCTTTATTTAATGTGATTGTAAATATTCTTTTTTTGGTCACTAGTTAAAATTT

CGGGGAACAAATGAGATTTGAAAATCTCTTATAAAAAGTCTCACATCATTTA

AAAAGATGAGCATCTCAGTCACTGTATCTAGAATTTGTTGATTTTGTACCAC

TAAACAAGTATTACTGTCTTTTTATATCAAAGAGATATATATGTGAATTTTCA

AATCTTGAAAGAGAATTGAAAATTTTGTTAGGAATCAAATTCAAAATGGCT

ATTTGTTATTTTTAATTTAATTATAAATCATCATTATTATAAATTTCTAGTCATA

TTTCTAATATAATTTTCATATTTTCATAGTATTTAGTAGTTTCTTTAAGAGTAAT

TATTAGGAATTTTAATTCATCTTCTAGTTATGTTTTTAATACGTAAATGAATAA

AAACTCAAATATATATGTTATTTTTTAACACATCAAAAGATTAAAAAAATTTT

AAGATACAAATTTTATTTAGAAATTAAGAAGATATATTAAGATTTTTAGTTAT

TTTTCTTTTTTAAATACTACTAATAACACATGGTTAATTTGAGTTACAACTAC

TTTTTCTTTTGTCATTAATCTTGGATTCGAATTCTAAGTATAAAAATTCAATTT

GACTCCTGAAATTTAAGATCGGTCTTAAATTGACTCCTAAAATTATAATTAA

CTCAATTTTTCCTAAAATTTATAATAGTAACTCATTTAATCCCTGAGTTTATTT

TTGTAAATTGCATATTGATTTTGCACGTTAATTTGCTAAGATTTGAATTTCTC

GTCTAGTTAGATTTCATATAACTAAGATCGATCTATTAGACCTTTTAAAAGTT

TGATTAGTTTCCCAATATTTTTATGAAAATGACAATAACAAGTTCAATTTAAA

AATTTTACCACCCTGAAAACAACAATTAAATTTCTGGAGTTCTAATCAATTT

TGGTCGCATAGAAATTAGACAAAAAATCTAAATTACAACATGTTGATGTGCC

AAATCAATACGTTATTAATGAAAATTAGCTCAAGAGTTAATGTGAGTTAAAA

TTATATATTTTGGGTCCATTTTGAGTTTATTAAAATTTTCAAAGTCAAATTGA

ATTCGATTTTAAATTTTAGGGATGAAATTGAGTATTAACCATGATTTAAAAAT

ATTAAAACATTACAAAATTGCTCCAATAAAACAATAACTATGCCGCTTTAAA

ACTATAGTATTTATTATTTAATAACTAAGATCACTCACTGCTCTCTTAATATAT

TTCCAAACCTTCAAACCAAAATACCATAACTTTATTGAACCAAAAAATGGC

ACCATTAACACCAAAATCCAATGACAATGAGGACCTTGAGGAAAACCAAG

CTCTTAATAAGCTTGAATCAGCATGTTCTGATTTAGAATCTTTCCTCAGAGC

AACAGAGATCATGGAACACAACCTTCTAACCATGGAAACTCGGTTCGATCT

CTTACAAGGATCTTTATCCAATGCATCCAGAAGGATCACACCTTTGCAATCC

TTGGCCATGTCAAGGAAAGCACTTGAAACAAGGATCAACCGAGCCGTTTC

GCCGGCGCTGGAGCTCATCGAGACCTTTAAGGTCGCCGAGTCCCTCCAGC

ACCGGATTCTTGACCTCTCGACCAAGCTCTTGGCCGAGAGGACACAGCAG

AAGAGGCTCCAGAAGCTTCTAGAATACGCCGATTGCGTTGATAGGTTAAAC

GAGGCGATTAACTCTATATGTCAAGTTGGTGAGGGTGTCATTTTGAAGCTTC

AAGAGGTTGTGGAGTTCATAAGCAGAACAAAGGCTGCGGATCAATACAGG

ACACAAAGGTTGTCATACTCATACTTTGATCATTTTTATGTTGCTAGCAAAATTTGCCCAACAA]ATCATGTCCTTTTATAATTGTTGTTTGCACATAAATCTCAA AGCTATTAATTCCATTTTTGGGTATTTAATTTTTAATTATTAACATAAATTCTT CACCA(SEQ ID NO:6)

GATTGAATGGCAAAGCAGTGAAGATCAGAGGAAGAAGTTTTGTGTGA ATGCTTTCTGTGATGTTACCAAGTTGTGTTGTGAATCGAGGGATTATGTGTT C[ATC]ATCATGTCCTTTTATAATTGTTGTTTGCACATAAATCTCAAAGCTATT AATTCCATTTTTGGGTATTTAATTTTTAATTATTAACATAAATTCTTCACCA(SEQ ID NO:7)

扩增所述分子标记位点的KASP引物组合包括：

qSucA16_F1:5’-TGAATCGAGGGATTATGTGTTCATC-3’(SEQ ID NO:8)，qSucA16_F2:5’-GTTGCTAGCAAAATTTGCCCAACAA-3’(SEQ ID NO:9)，

qSucA16_com:5’-GATTTATGTGCAAACAACAATTATAAAAGGACAT-3’(SEQ ID NO:10)。

PCR反应体系为1μL：1μL模板DNA(50-100ng/μL)，DNA烘干后加入1μL1×MasterMix和KASP引物的混和液，引物体积约占1.4％。

KASP引物的混和液：3条引物分别配置浓度为100μmol/L的储备液。KASP引物混合液的配置比例为F1:F2:com:水＝15:15:30:40(体积比)。

PCR扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃延伸1min，10个循环；94℃变性20s，55℃延伸1min，26个循环；10℃保存。

利用SNPLine基因分型平台(LGC)验证了A06.115805462SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点在“JT1×PI478819”RIL群体中的真实性(图3)。A06.115805462SNP位点KASP检测结果中，JT1的检测结果为A:A，PI478819的检测结果为C:C，与测序结果一致；A16.148167815-148167817的InDel位点KASP结果中，JT1的检测结果为Del:Del，PI478819的检测结果为WT:WT，与测序结果一致。

将“JT1×PI478819”RIL群体子代材料的A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果分为4种类型，分别为A:A&Del:Del，A:A&WT:WT，C:C&Del:Del，C:C&WT:WT。“JT1×PI478819”RIL群体子代材料的A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果为A:A&Del:Del时，蔗糖含量最高(蔗糖含量>6％)，与其他3种类型差异显著；“JT1×PI478819”RIL群体子代材料的A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果为C:C&WT:WT时，蔗糖含量最低(蔗糖含量<4％)，与其他3种类型差异显著(图4)。

实施例3利用目标基因的分子标记对自然群体材料的验证试验

挑选不同生物型的353份自然群体材料(包括农家种、国外引种和国内育成品种)进行蔗糖含量的测定和目标基因的单倍型分析；分别在商丘种植点(A)、潍坊种植点(B)和郑州种植点(C)进行种植。

在353份自然群体材料中，有连续开花亚种材料156份，交替开花亚种材料197份。连续开花亚种材料中珠豆变种(var.vulgaris)84份，疏枝变种(var.fastigiata)26份，秘鲁变种(var.peruviana)2份，中间型材料(irregular fas-type)44份；交替开花亚种材料中密枝变种(var.hypogaea)85份，茸毛变种(var.hirsuta)12份，中间型材料(irregularhyp-type)100份。对自然群体材料目标基因的单倍型分析发现其突变位点与上述一致。提取待鉴定自然群体花生样本的DNA，通过SNPLine平台对6号染色体上的A06.115805462SNP突变位点和16号染色体上的A16.148167815-148167817InDel突变位点进行基因分型。

若自然群体材料A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果为A:A&Del:Del时，蔗糖含量最高，与其他3种类型差异显著；若自然群体材料A06.115805462的SNP位点和A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果为C:C&WT:WT时，蔗糖含量显著低于A:A&Del:Del的材料，与其他2种类型的蔗糖含量差异较小(图5)。

综上所述，“JT1×PI478819”RIL群体和自然群体材料的验证结果为：

若A06.115805462的SNP位点的分型结果为突变型(A:A)且A16.148167815-148167817的InDel位点的分型结果为突变型(Del:Del)时，则待鉴定花生样本为高蔗糖含量；若A06.115805462的SNP位点的分型结果为野生型(C:C)且A16.148167815的InDel位点的分型结果为野生型(WT:WT)时，则待鉴定花生样本为低蔗糖含量。