转基因大豆事件XP-2及其检测方法
文献发布时间：2024-04-18 19:59:31
(一)技术领域
本发明涉及耐除草剂转基因大豆事件及其鉴定方法，特别涉及耐啶嘧磺隆与耐草甘膦除草剂转基因大豆事件XP-2和用于检测生物样品中是否包含特定转基因大豆事件XP-2的核酸序列及其检测方法。
(二)背景技术
大豆(Glycine max)是世界上许多地区的主要农作物之一，其重要的农艺性状之一是除草剂的耐受性。生物技术已经应用于大豆以改善其农艺性状和品质。通过转基因的方法可以使草甘膦耐受型基因(如EPSPS)和啶嘧磺隆耐受型基因(如P450)在大豆植株中表达而获得。例如，通过农杆菌介导转化法将来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens spstrain CP4)CP4菌株的cp4 epsps基因导入农作物，表达5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的农作物获得了对除草剂草甘膦的耐受性，我国已获得多个转cp4 epsps基因的农作物，如玉米(Zea mays)、油菜(Brassica napus)、甜菜(Beta vulgaris)、苜蓿(Medicagosativa)等。但长时间使用单一除草剂往往造成抗性杂草的大量产生。美洲推广耐草甘膦作物超过二十年，已经产出大量草甘膦抗性杂草，单独使用草甘膦难以实现田间杂草的有效防治。培育耐受两种或两种以上除草剂的转基因农作物可以为杂草控制提供多样化的选择，也能够有效延缓抗性杂草的产生。
细胞色素P450是多成员超基因家族。已有研究结果表明，P450酶系参与多种不同类型除草剂的代谢和解毒作用，并在除草剂抗性形成过程中扮演着重要的角色。狗牙根(Cynodon dactylon)中的一种P450基因N-Z1(美国专利：US9657303、加拿大专利：CA2818581C和巴西专利：BR112013012678B1)编码的蛋白质能够赋予农作物对多种除草剂的耐受性。
已知转基因的表达受到它们所在染色体位置的影响，因其所在位置不同，外源基因的表达水平、表达空间和时间模式上会存在巨大差异，从而对植物的农艺性状的影响也各不相同。相同外源基因转化得到的不同转化事件间往往性状差异巨大，因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。
能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。对转基因作物的杂交育种、生产应用、商业化注册和法律法规监管上具有重要的价值。提供转化事件外源基因整合位点信息，才能够通过现有的多核苷酸的检测方法来检测植物中转化事件的存在。常规的多核苷酸和蛋白检测的方法可以检测是否为转基因，但不能有效区别不同的转化事件，特别是使用相同基因或相同转化载体产生的转化事件。因此，只有针对插入基因和侧翼序列的检测才能够准确判断是否存在目标转基因事件。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种转基因大豆事件XP-2及其检测方法，该事件同时表达CdP450和cp4epsps两种蛋白，对啶嘧磺隆和草甘膦具有高耐受力，遗传稳定且对农艺性状没有不良影响；同时，本发明还提供了一种检测所述转基因大豆事件的方法，该方法可有效检测出特定转基因大豆事件XP-2，解决了转化体身份识别问题，可用于育种、种植和监管过程中对转基因大豆XP-2进行分子检测。
本发明采用的技术方案：
第一方面，本发明提供一种转基因大豆事件XP-2的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其互补序列中的一种或多种。
进一步，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1-10或其互补序列中的一种或多种。
更进一步，所述核酸序列源自包含转基因大豆事件XP-2的植物、种子或细胞，包含所述转基因大豆事件XP-2的种子的代表样本以保藏编号CCTCC NO：P202329保藏。
所述转基因大豆事件XP-2以SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。所述外源基因包括抗啶嘧磺隆基因CdP450和抗草甘膦基因cp4 epsps。
本发明所述转基因大豆事件XP-2是利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法，将含有抗啶嘧磺隆和草甘膦基因表达框的外源T-DNA序列导入大豆基因组中，通过再生含有外源基因的大豆细胞获得大豆转基因群体，并利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到能够满足生产需要的大豆转化事件。通过杂交等方式获得本发明转基因大豆事件XP-2的后代，任意后代的基因组中外源T-DNA的旁侧序列为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的大豆事件和种子都应视为本发明的一方面。
进一步，本发明所述外源基因的T-DNA(图1)含有两个连接的植物表达盒，即抗啶嘧磺隆基因表达盒和抗草甘膦基因表达盒，其中调控遗传元件为在大豆植物细胞中表达耐啶嘧磺隆CdP450，以及耐草甘膦cp4 epsps所必需。所述抗啶嘧磺隆基因表达盒编码具有耐啶嘧磺隆的细胞色素P450氧化酶，表达CdP450蛋白；抗啶嘧磺隆CdP450基因表达盒是由pCsVMV启动子、抗啶嘧磺隆基因CdP450和CaMV35S终止子构成，其中pCsVMV启动子为组成型启动子，来源于玄参花叶病毒，可驱动目的基因在所有植物组织中表达，终止子为35S终止子，来源于烟草花叶病毒。所述抗草甘膦基因表达盒编码植物芳香族氨基酸合成途径中的一种具有耐草甘膦特性的关键酶，表达cp4 epsps蛋白；抗草甘膦cp4 epsps基因表达盒是由Atubi启动子，水稻EPSPS信号肽，cp4 epsps基因和35S终止子构成，其中35S启动子为组成型启动子，来源于花椰菜花叶病毒，可驱动目的基因在所有植物组织中表达，叶绿体信号肽来源于水稻，cp4 epsps来源于Agrobacterium tumefaciens strain CP4，终止子为35S终止子，来源于花椰菜花叶病毒。
进一步，优选所述外源基因T-DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明转基因大豆事件XP-2为包含外源T-DNA的DNA构建体，包括左侧翼序列、外源基因和右侧翼序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明还提供一种含转基因大豆事件XP-2的重组载体或重组细胞，其含有所述T-DNA插入序列。
第二方面，本发明还涉及一种用于检测转基因大豆事件XP-2的特异性核苷酸序列，所述特异性核苷酸序列具有左侧翼区或右侧翼区与外源基因的接头序列，所述接头序列包含了插入大豆基因组的外源DNA和大豆细胞基因组左侧翼区或右侧翼区DNA的核苷酸序列。
进一步，所述特异性核苷酸序列具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中的一种或其互补序列至少11个连续核苷酸，用于检测5’端插入外源基因。当扩增子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其互补序列时，即可鉴定为转基因大豆XP-2的存在。
进一步，所述特异性核苷酸序列具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列中的一种或其互补序列至少11个连续核苷酸，用于检测3’端插入外源基因。当扩增子包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或其互补序列时，即可鉴定为转基因大豆XP-2的存在。
进一步，所述特异性核苷酸序列具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列或其互补序列，当扩增子包含SEQ ID NO:10或其互补序列时，即可鉴定为转基因大豆XP-2的存在。
本发明提供了转基因大豆事件XP-2所特有的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列可用于表征转基因大豆事件XP-2，从而可用于检测样品中是否存在转基因大豆事件XP-2。具体而言，样品中SEQ ID NO:1-10中一种或多种所示的核酸分子中至少11个连续的核苷酸的存在均表明该样品中存在转基因大豆事件XP-2。
第三方面，本发明提供一种用于检测所述转基因大豆事件XP-2的引物对，所述引物对包括第一引物和不同于第一引物的第二引物，所述第一引物和第二引物各自包含部分SEQ ID NO:10或其互补序列，用于检测样品中转基因大豆事件XP-2。
进一步，所述第一引物为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25中的一种；所述第二引物为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26中的一种。
一种用于检测所述转基因大豆事件XP-2的DNA探针，所述DNA探针包含部分SEQ IDNO:10或其互补序列，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1-10或其互补序列的DNA分子杂交，不与不含选自SEQ ID NO:1-10或其互补序列的DNA分子杂交。
更进一步，所述DNA探针为SEQ ID NO:24所示，所述探针至少用一种荧光基团标记，优选为6FAM
第四方面，本发明提供一种利用所述引物对和DNA探针检测样品中包含转基因大豆事件XP-2的DNA存在的方法，所述方法包括：(1)将待检测样品与DNA探针或引物对在核酸扩增反应液中接触；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测DNA扩增子的存在；所述DNA扩增子包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10之一或其互补序列的至少11个连续核苷酸，优选SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中至少11个连续核苷酸。
第五方面，本发明还提供了一种培育含所述转基因大豆事件XP-2的耐除草剂大豆植物的方法，所述方法包括：种植含特异性核苷酸序列的大豆种子，喷施除草剂，收获与其他不含特定核酸序列大豆植物相比，耐除草剂能力显著提高的大豆；所述特异性核苷酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列；所述除草剂包括草甘膦或啶嘧磺隆。
第六方面，本发明还提供了一种控制种植含所述转基因大豆事件XP-2的大豆植物的田间杂草的方法，所述方法包括：种植含特异性核苷酸序列的转基因大豆植物，喷施有效剂量草甘膦、和/或啶嘧磺隆除草剂，杀灭杂草；所述转基因大豆基因组中包含来自转基因大豆事件XP-2的特异性核苷酸序列，所述特异性核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。
第七方面，本发明还提供了一种基于所述转基因大豆事件XP-2获得啶嘧磺隆和/或草甘膦耐受性大豆植物的方法，所述方法包括：将含有特异性核苷酸序列的大豆植株，与另一种大豆植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有特异性核苷酸序列的植株相比，对除草剂的耐受性显著提高的植物；所述特异性核苷酸序列来自转基因大豆事件XP-2，所述特异性的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。转基因大豆事件XP-2的后代包括植物、或种子、或植物部分和种子，植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、花瓣、茎、叶、种子、荚和分生组织。
第八方面，本发明提供了一种产生自转基因大豆事件XP-2的转基因植物细胞，所述转基因植物细胞是将所述转基因大豆事件XP-2的特定区域核酸序列转入植物基因组获得的，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。
第九方面，本发明提供一种产生自转基因大豆事件XP-2的大豆商品或农产品，所述大豆商品或农产品包含可检测的DNA分子，所述DNA分子源自转基因大豆事件XP-2的特异性核苷酸序列，所述特异性核苷酸序列选自SEQ ID NO:1-10之一所示核苷酸序列或其互补序列；所述大豆商品或农产品包括：大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆坯片、大豆豆皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳酪、大豆生物质、以及使用大豆植物及大豆植物部分生产的燃料产品。
第十方面，本发明提供一种含转基因大豆事件XP-2的大豆种子XP-2(Glycine maxL.Merr.XP-2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：P202329，保藏日期2023年7月9日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
所述“大豆(soybean)”意指大豆(Glycine max)且包括可用含有转基因大豆事件XP-2的大豆植物育种的所有植物品种，包括野生大豆物种以及属于容许物种之间的育种的大豆属的那些植物。所述术语“包含”意指“包括但不限于”。
所述“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少具有3、5、10、11、14、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组边界区”或“基因组3’边界序列”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组边界区”或“基因组5’边界序列”等。
引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化事件，所述不同侧翼区是每个转化事件所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化事件也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰来自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。
本发明转基因大豆事件XP-2比现有的转基因大豆植物及同时构建的新事件，具有更加优良的性质和性能，包含了一个DNA构建体并以单一形式插入大豆基因组。所述DNA构建体(图1)包含一个T-DNA，该T-DNA区段含有两个连接的植物表达盒：CdP450基因表达盒、cp4 epsps基因表达盒。所述DNA构建体采用农杆菌介导的大豆子叶节转化法被引入大豆基因组。
本发明提供示范性引物或探针，其可用于检测源自于包含事件XP-2DNA的大豆植物的DNA在样品中的存在。此类引物或探针对靶核酸序列有特异性且因而适用于通过本发明方法鉴别大豆事件XP-2核酸序列。
所述“探针”是与靶核酸的一条链互补的分离的核酸。根据本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包含聚酰胺及其它探针材料，其特异性地结合至靶DNA序列且此类结合的检测可适用于诊断、区分、测定、或证实靶DNA序列在特定样品中的存在。探针可连接至常规的可检测标记或报道分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。适用作探针的示例性DNA分子作为SEQ ID NO:24来提供。
所述“引物”可以是高度纯化的、分离的多核苷酸，其被设计用于涉及热扩增的特异性退火或杂交方法中。一对引物可与模板DNA(如大豆基因组DNA的样品)在如聚合酶链式反应(PCR)的热扩增中一起使用以产生扩增子，其中由此类反应产生的扩增子将具有对应于位于其中引物杂交至模板的两个位点之间的模板DNA序列的DNA序列。如本文所用，“扩增子”是已使用扩增技术合成的DNA的片段(piece/fragment)的复制。本发明的扩增子可包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10所提供的至少一个序列。引物通常被设计来杂交至互补的靶DNA链以形成引物与靶DNA链之间的杂种，并且引物的存在是通过聚合酶识别的点以使用靶DNA链作为模板开始引物的延伸(即，另外的核苷酸聚合至加长的核苷酸分子中)。如本发明中使用的引物对意在指示使用双链核苷酸区段的两个引物结合相反链，以便通常在热扩增反应或其它常规的核酸扩增方法中线性地扩增在靶向由引物对的单个元件结合的位置之间的多核苷酸区段。适用作引物的示例性DNA分子作为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26来提供。作为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26提供的引物对适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者都具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸以用作DNA引物，所述DNA引物当在热扩增反应中与源自于大豆事件XP-2的模板DNA一起使用时产生用于诊断样品中的大豆事件XP-2DNA的扩增子。
根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全的序列同一性，尽管保留优先地杂交至靶序列的能力的不同于靶序列的引物和探针可通过常规方法来设计。为了使核酸分子能用作引物或探针，其仅需在序列上足够互补以便能够在特定的溶剂和所用的盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴别来自大豆事件XP-2的转基因DNA在样品中的存在。探针和引物一般是至少约11、18、24、或30个核苷酸或更长。此类探针和引物在严格的杂交条件下特异性地杂交至靶DNA序列。常规的严格条件是由Sambrook等人，1989且由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization,A PracticalApproach,IRL Press,Washington,DC(1985)中描述。
如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定大豆植物是否由含有本发明转基因大豆事件XP-2，通过有性杂交方式产生，或采集自田地的大豆样品是否包含转基因大豆事件XP-2，或大豆提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因大豆事件XP-2，从大豆植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因大豆事件XP-2的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因大豆事件XP-2也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。
本领域技术人员所熟知的许多方法都可用于分离和操纵在本发明中所公开的DNA分子或其片段，包括热扩增方法。也可以通过其它技术获得DNA分子或其片段，如通过化学方法直接合成片段，比如利用自动寡核苷酸合成仪。
所述“后代或子代”包括包含源自于祖先植物的事件XP-2DNA和/或包含具有选自由以下组成的组的至少一个序列的DNA分子的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生的植物部分：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。植物、后代、及种子对于转基因可以是纯合的或杂合的。后代可从由含有大豆事件XP-2的植物产生的种子和/或从由用来自含有大豆事件XP-2的植物的花粉受精的植物产生的种子长成。后代植物可通过自花授粉(又名“自交”)产生真正的植物育种系，即对转基因纯合的植物。适当的后代自交可产生对于加入的外源性基因是纯合的植物。或者，后代植物可异型杂交，例如用另一不相关的植物育种，产生品种或杂种种子或植物。另一不相关的植物可以是转基因或非转基因的。本发明的品种或杂种种子或植物可因此通过将缺少大豆事件XP-2的特异性及独特的DNA的第一亲代与包含大豆事件XP-2的第二亲代有性地杂交由此产生包含大豆事件XP-2的特异性及独特的DNA的杂种而得到。每个亲代可以是杂种或近交种/品种，只要所述杂交或育种产生本发明的植物或种子，即具有至少一个含有大豆事件XP-2的DNA的等位基因和/或具有选自以下的至少一个序列的DNA分子的种子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10。两个不同的转基因植物可因此杂交产生含有两个独立分离的、加入的、外源性基因的杂种后代。例如，含有赋予大豆以双重昆虫抗性作用模式以及耐草甘膦的XP-2可与其它转基因大豆植物杂交产生具有两种转基因亲代特征的植物。一个实例将是含有赋予大豆以双重昆虫抗性作用模式以及草甘膦耐性的XP-2与具有一个或多个如除草剂耐受性和/或害虫防治的另外的性状的植物的杂交，从而产生具有对鳞翅目昆虫害虫以双重抗性作用模式且具有至少一个或多个另外的性状的后代植物或种子。还可以与亲本植物进行回交和与非转基因植物进行异型杂交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于若干参考文献的一篇中，例如Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编著，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。
所述“转基因植物细胞”适用于许多工业应用中，包括但不限于：(i)用作科学探究或工业研究的研究工具；(ii)在用于产生内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产物或小分子的培养中使用，这些物质可用于随后的科学研究或用作工业产品；以及(iii)与现代植物组织培养技术一起用于产生转基因植物或植物组织培养物，其随后可用于农业研究或生产。如转基因植物细胞的微生物的生产和使用利用现代微生物学技术和人工干预以产生人工的、独特的微生物。在此过程中，将重组DNA插入植物细胞基因组中以生成转基因植物细胞，所述转基因植物细胞是单独的且独特于天然存在的植物细胞。此转基因植物细胞可然后像细菌和酵母细胞一样使用现代微生物学技术来培养并且可以未分化的单细胞状态存在。转基因植物细胞的新遗传组成和表型是通过将异源DNA整合到细胞的基因组中而产生的技术效果。本发明的另一方面是一种使用本发明微生物的方法。使用本发明微生物如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合到细胞的基因组中产生转基因细胞，然后使用此细胞得到具有相同的异源DNA的另外的细胞的方法；(ii)使用现代微生物学技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养细胞产生和纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产物的方法；以及(iv)用转基因植物细胞使用现代植物组织培养技术产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
所述“商品产品”是指由源自于含有大豆事件XP-2DNA的大豆植物、完整或加工的大豆种子、一个或多个植物细胞和/或植物部分的材料构成的任何组合物或产物。商品产品可以出售给消费者并且可以是活的或非存活的。非存活的商品产品包括但不限于非存活的种子；完整的或加工的种子、种子部分、及植物部分；大豆油、大豆蛋白、大豆粕(soybeanmeal)、大豆粉(soybean flour)、大豆坯片、大豆豆皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳酪、大豆生物质、以及使用大豆植物及大豆植物部分生产的燃料产品。活的商品产品包括但不限于种子、植物及植物细胞。包含事件XP-2的大豆植物因此可用于制造通常从大豆获取的任何商品产品。源自于包含事件XP-2的大豆植物的任何此类商品产品都可含有至少可检测量的对应于大豆事件XP-2的特异性及独特的DNA，并且具体说来可含有可检测量的包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10。
序列简述
SEQ ID NO:1——转基因大豆事件XP-2中5’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为26bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2——转基因大豆事件XP-2中3’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为26bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3——转基因大豆事件XP-2中5’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为60bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4——转基因大豆事件XP-2中3’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为60bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5——转基因大豆事件XP-2中5’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为100bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6——转基因大豆事件XP-2中3’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为100bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7——转基因大豆事件XP-2中5’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为1747bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8——转基因大豆事件XP-2中3’转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA结合部位附近的一个长度为1729bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9——整个T-DNA插入序列。
SEQ ID NO:10——整个T-DNA序列、5’和3’的侧翼大豆基因组序列。
SEQ ID NO:11——用于荧光定量PCR检测大豆基因组中内源基因β-Lectin的引物1。
SEQ ID NO:12——用于荧光定量PCR检测大豆基因组中内源基因β-Lectin的引物2。
SEQ ID NO:13——用于大豆转化事件筛选的荧光定量PCR引物1。
SEQ ID NO:14——用于大豆转化事件筛选的荧光定量PCR引物2。
SEQ ID NO:15——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物1。
SEQ ID NO:16——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物2。
SEQ ID NO:17——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物3。
SEQ ID NO:18——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物4。
SEQ ID NO:19——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物5。
SEQ ID NO:20——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物6。
SEQ ID NO:21——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物7。
LAD1-1——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物8。
LAD1-2——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物9。
LAD1-3——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物10。
LAD1-4——用于扩增T-DNA侧翼序列的引物11。
SEQ ID NO:22——用于鉴定转基因大豆事件XP-2的荧光定量PCR引物SQ111。寡核苷酸正向引物SQ111的序列(SEQ ID NO:22)与对应于SEQ ID NO:10的位置2612至2634和SEQ ID NO:7的位置625至647的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:23——用于鉴定转基因大豆事件XP-2的荧光定量PCR引物SQ112。寡核苷酸反向引物SQ112的序列(SEQ ID NO:23)与对应于SEQ ID NO:10的位置2711至2739和SEQ ID NO:9的位置2至30和SEQ ID NO:7的位置724至752的反向互补核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:24——用于鉴定转基因大豆事件XP-2的探针PB113。寡核苷酸探针PB113的序列(SEQ ID NO:24)与对应于SEQ ID NO:10的位置2678至2704和SEQ ID NO:7的位置691至717的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:25——用于检测包含转基因大豆事件XP-2的PCR引物SQ113。寡核苷酸正向引物SQ114的序列(SEQ ID NO:25)与对应于SEQ ID NO:10的位置2549至2576和SEQ IDNO:7的位置562至589的核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:26——用于检测包含转基因大豆事件XP-2的PCR引物SQ114。寡核苷酸反向引物SQ115的序列(SEQ ID NO:26)与对应于SEQ ID NO:10的位置2768至2793和SEQ IDNO:9的位置59至84和SEQ ID NO:7的位置781至806的反向互补核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:27——T-DNA插入序列的5’端的侧翼大豆基因组序列。
SEQ ID NO:28——T-DNA插入序列的3’端的侧翼大豆基因组序列。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明提供了一种转基因大豆事件XP-2，具有耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用，并且耐受除草剂啶嘧磺隆。编码草甘膦和啶嘧磺隆耐受性性状的基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于转基因大豆事件XP-2基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。所述转基因大豆事件XP-2以大豆(Glycine max)XP-2种子的形式保藏在中国典型培养物保藏中心。
(2)本发明提供的用于检测大豆植物的特异性核酸序列能够特异性检测转基因大豆事件XP-2，特异性核酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10或其互补序列中的一种。
(3)本发明提供的用于检测大豆植物的特异性核酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、及SEQ ID NO:10或其互补序列设计的特异性检测引物对或探针，可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因大豆事件XP-2或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因大豆事件XP-2的植物材料的存在。能够实现对XP-2的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管。
(4)本发明方法获得的含所述转基因大豆事件XP-2的后代或农产品或商品，具有耐草甘膦、啶嘧磺隆的特性。
(四)附图说明
图1、用于生成转基因大豆事件的转化构建体示意图。
图2、外源插入基因与大豆基因组结构示意图。
图3、鉴定包含转基因大豆事件XP-2的具有任何育种活性的组织的PCR图。M：Maker；1：转基因大豆事件XP-2的种子；2：转基因大豆事件XP-2的叶片；3：转基因大豆事件XP-2的花荚；4：空白对照；5：非转基因大豆皖豆28；6：转基因大豆中黄6106；7：常规水稻；8：常规玉米。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，本领域技术人员应当了解，在以下实施例中公开的技术代表发明人发现在实践本发明中运行良好的方法，且因此可以被认为构成了实施本发明的优选实施例。然而，本领域技术人员应理解可以根据本公开内容对所公开的特定实施方案进行许多改变，且仍然可以获得相似或类似的结果，而不会脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3
本发明以下实施例中所使用的培养基具体配方如下：
YEP固体培养基组成：Trytone(蛋白胨)10g/L，Yeast extract(酵母提取物)10g/L，氯化钠5g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH 7.0。
萌发培养基组成：MS盐(Phytotech M524)4.33g/L，蔗糖20g/L，琼脂2.75g/L，溶剂为水，pH5.8。
GADT液体培养基组成：B5盐(Phytotech G398)0.32g/L，吗啉乙磺酸(MES)3.9g/L，蔗糖30g/L，溶剂为水，pH 5.4。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、0.25mg/L的赤霉素A3(GA3)、40mg/L的乙酰丁香酮(AS)、154mg/L的DL-二硫苏糖醇(DTT)、1mM的连二亚硫酸钠(S)、2.4g/L的半胱氨酸(Cys)。
恢复培养基组成：B5盐(Phytotech G398)3.21g/L，MES 0.6g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH 5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-BA、200mg/L的特美汀(Timentin)。
筛选培养基组成：B5盐(Phytotech G398)3.21g/L，MES 0.6g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH 5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-BA、200mg/L的Timentin、25mg/L的草甘膦。
伸长培养基组成：MS盐与B5维生素混合物(Phytotech M404)4.44g/L，MES 0.59g/L，天冬酰胺0.05g/L，谷氨酰胺0.05g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH 5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的200mg/L的Timentin、25mg/L的草甘膦、0.25mg/L的GA3、1mg/L的玉米素(Zeatin)、0.1mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。
生根培养基组成：MS盐与B5维生素混合物(Phytotech M404)4.44g/L，MES 0.59g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH 5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的200mg/L的Timentin、25mg/L的草甘膦、0.1mg/L的IAA。
实施例1、转化事件的获得
(1)含有外源基因的质粒载体的获得
本发明用于大豆转化的质粒载体pXP图谱如图1所示。质粒载体pXP以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，在其多克隆位点区域加入包含抗嘧啶磺隆表达框(即完整表达CdP450蛋白表达框)和耐草甘膦表达框(即cp4 epsps蛋白表达框)的T-DNA获得的。抗嘧啶磺隆表达框：驱动CdP450基因的启动子为来源于木薯花叶病毒启动子的CsVMV启动子，终止子为来源于花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的35S的NOS终止子；耐草甘膦表达框：来源于拟南芥泛素启动子的AtUbi启动子，该启动子驱动N端连有一段编码水稻的CTP基因信号肽的cp4 epsps，终止子是CaMV的35S基因终止子。
质粒载体pXP的T-DNA(SEQ ID NO:9，即SEQ ID NO:10中2710-8548bp具体组成元件及位置如下如表1所示：RB右边界区间序列(2710-2942，233bp)、pCsVMV启动子(2943-3630，688bp)、区间序列(3631-3640，10bp)、CdP450(3641-5194，1554bp)、区间序列(5195-5200，6bp)、CaMV35S终止子(5201-5391，191bp)、区间序列(5392-5409，18bp)、pAtUbi启动子(5410-6673，1264bp)、OsEPSPS CTP(6674-6895，222bp)、cp4 epsps(6896-8263，1368bp)、区间序列(8264-8275，12bp)、CaMV35S终止子(8276-8465，190bp)、区间序列(8466-8526，61bp)、LB左边界区间序列(8527-8548，22bp)。
表1、SEQ ID NO:10包含的基因组和遗传元件
(2)转化农杆菌
利用电击法(2500V)将步骤(1)获得的质粒载体pXP导入农杆菌LBA4404中，获得含有转化载体T-DNA的农杆菌。
(3)大豆遗传转化
大豆转化参考李桂兰等报道的方法(李桂兰等，2005农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究，作物学报，31(2)170-176)，其中筛选化合物是草甘膦，具体步骤如下：
①大豆种子消毒(氯气灭菌法)：挑选饱满、无病斑、无开裂、无硬实的成熟大豆种子皖豆28，放入90*15mm的培养皿中，每皿约150粒单层平铺。灭菌前将培养皿开盖置于超净台上，打开光照并风吹1h，之后放入干燥器中。干燥器中放入250mL烧杯，烧杯中先加入30mL次氯酸钠和70mL水，混合均匀，再加入8mL(质量浓度36％)浓盐酸，立即盖上干燥皿盖子。静置约12h后，打开干燥器盖子，将表面灭菌后的大豆种子移到超净台上风吹1h，吹散残留的氯气。
②大豆种子萌发：将消毒完成后的大豆种子种脐朝下插入到萌发培养基(Germination Medium,GM)，种子约一半浸没到培养基中。每皿15粒，24℃光培养12h，获得吸胀的大豆种子。
③农杆菌菌液的准备：用接种环取-80℃保存的步骤(1)构建的含有转化载体的农杆菌接种到YEP固体培养基中，24℃暗培养12h。用灭菌后的1mL枪头划取农杆菌到GADT液体培养基中，涡旋菌体，并加入适量GADT液体培养基调OD650为0.5，获得农杆菌菌液。
④外植体准备与农杆菌侵染：将步骤②吸胀的大豆种子置于灭菌后的滤纸上，用11号解剖刀从种子胚方向先斜切去掉胚根顶端，然后沿中轴线将大豆种子剖开。将胚附着的那一半子叶去皮，在体视镜下将其胚芽处的两片幼叶分开，露出包裹在下面的生长点，用解剖刀轻微破坏生长点，获得外植体。将准备的外植体浸入步骤③农杆菌菌液中约1.5h。
⑤共培养：倒掉步骤④多余的菌液，将沾有菌液的外植体置于培养皿中，每皿15个，26℃暗培养3d。
⑥恢复培养：将步骤⑤共培养后的外植体与水平面成30°角斜插入恢复培养基(Rest Medium，RM)中，子叶约一半浸入培养基，每皿7个外植体。26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下培养1周。
⑦丛生芽的诱导：将步骤⑥恢复培养后的外植体转移到筛选培养基(ShootInduction Medium,SIM)中，按相同方法摆放。26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下培养3周。
⑧芽的伸长：将长出丛生芽的外植体置于灭过菌的滤纸上，切去子叶和变黄的部分，将丛生芽转移到伸长培养基(Shoot Elongation Medium,SEM)中，基部浸入培养基，每皿4-5个外植体。26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下培养，每2周换一次培养基直至长出约3cm的幼苗。
⑨幼苗的生根：将步骤⑧幼苗从组织上切下，用吲哚丁酸(IBA,indole-3-butytric acid,IBA)浸泡切口2min后转移到生根培养基(Rooting Medium)中，26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下继续培养1-2周后，当幼苗长出约2cm长的根时，获得生根苗。
⑩苗的移栽：将步骤⑨生根苗从培养基中取出，用自来水冲去根部残留的培养基，植物转化一共产生685个T
实施例2、大豆转化事件的筛选
将实施例1获得的685个T
表2.T
对没有药害的转化事件进行定量PCR检测，测定外源基因在87个转化事件中的含量，从而评估T-DNA的插入拷贝数，放弃带有两个或者两个以上拷贝的转化事件。取上述转化事件的植株，用CTAB法提取植物基因组。通过SYBR Green荧光定量PCR方法检测基因的拷贝数以确定外源基因的拷贝数。选取大豆基因组中的Lectin作为内参基因，随机选取一个大豆转化事件作为基准，计算目的基因在反应初始的相对含量。
本实施例使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(BIO RAD)，在Bio-Rad RadCFX96
表3.定量PCR引物序列表
通过分析cp4 epsps基因拷贝数的实验结果，进而证实外源基因己整合到所检测的大豆植株的染色体组中，其中有54个单拷贝的转基因大豆转化事件。
对54个选定的单拷贝转化事件的后代进行更高剂量啶嘧磺隆的耐受性检测，喷施112.5ga.i./ha啶嘧磺隆，结果显示，对更高剂量啶嘧磺隆具有耐受性的转化事件有5个，分别为转化事件XP-2、XP-195、XP-325、XP-326和XP-552(表4)。
表4.T
温室种植五个转化事件XP-2、XP-195、XP-325、XP-326和XP-552的T
通过抗啶嘧磺隆性能检测及耐草甘膦性能检测，并结合田间农艺性状表现，最终选定转化事件XP-2更为优异，该转化事件具有良好的草甘膦和啶嘧磺隆耐受性、外源基因单拷贝插入，农艺性状表现优秀，性状稳定遗传。
实施例3、大豆转化事件XP-2的检测
(1)大豆基因组的提取
采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取大豆转化事件XP-2基因组DNA。
取1000mg克幼嫩的大豆转化事件XP-2的T0代叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.8mL于65℃水浴锅中预热的CTAB缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mMEDTA，溶剂为水，pH 8.0)，充分混匀后，于65℃水浴锅中水浴60min；
加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀，12000rpm(每分钟转数)转速下离心10min，吸取上清液至新的离心管中；
加入0.7倍体积的异丙醇，轻柔晃动离心管，12000rpm转速下离心1min，收集DNA到管底；弃上清液，加入1mL质量浓度为75％的乙醇，洗涤沉淀，12000rpm转速下离心1min，重复洗涤一次，在超净台吹干；
DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，溶剂为水，pH 8.0)中，Nanodrop测定DNA的浓度，保存备用。
(2)侧翼DNA序列的分析
使用Liu等报道的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)方法(Liu，Plant Journal 1995,8(3):457-463)对实施例1筛选的优良转化事件XP-2外源基因DNA插入点两侧的区域序列进行测定。引物序列见表5，PCR反应条件见表6，PCR反应体系见表7。
表5.TAIL-PCR引物序列
表5中V代表G、A、C，N代表A、T、C、G，B代表G、T、C。
表6.TAIL-PCR反应条件
表7.PCR反应体系
采用Axygen公司的PCR产物回收试剂盒回收特异性较强的第2轮或第3轮PCR扩增产物，连接到PMD20-T克隆载体上(TaKaRa,Code:D107A)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆进行测序。获得的序列信息与大豆网上数据库(http://www.soybase.org)进行比对分析，检索相似的大豆基因组序列。
(3)XP-2整合入基因组序列信息
上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列、外源抗嘧啶磺隆基因表达框和抗草甘膦基因表达框序列拼接形成本发明所述的转化事件(示意图见图2)，核苷酸序列为SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:10包含的基因组和遗传元件见表1。对应大豆转化事件XP-2以大豆(Glycine max L.Merr.XP-2)XP-2种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:P202329，保藏日期2023年7月9日。
实施例4、转基因大豆事件XP-2特异性检测引物和探针
这一实施例描述用于鉴定大豆样品中转基因大豆事件XP-2的DNA存在的方法。设计一对PCR引物和探针用于鉴定转基因大豆事件XP-2的插入T-DNA序列及其右侧翼的大豆基因组序列，序列涵盖于SEQ ID NO:1-10中。
本实施例的PCR引物和探针分别为：SQ111、SQ112和PB113。寡核苷酸正向引物SQ111的序列(SEQ ID NO:22)与对应于SEQ ID NO:10的位置2612至2634和SEQ ID NO:7的位置625至647的核苷酸序列相同。寡核苷酸反向引物SQ112的序列(SEQ ID NO:23)与对应于SEQ ID NO:10的位置2711至2739和SEQ ID NO:9的位置2至30和SEQ ID NO:7的位置724至752的反向互补核苷酸序列相同。寡核苷酸探针PB113的序列(SEQ ID NO:24)与对应于SEQ ID NO:10的位置2678至2704和SEQ ID NO:7的位置691至717的核苷酸序列相同。PCR引物SQ111(SEQ ID NO:22)和SQ112(SEQ ID NO:23)扩增在事件XP-2的正确接合点处独特的基因组/插入DNA的128个核苷酸扩增子。探针PB113经荧光标记(比如6’-FAM荧光标记)后，可用于检测引物SQ111和SQ112的PCR产物，以鉴定样品中源于事件XP-2的DNA的存在。
SEQ ID NO:22：gagagagaggcttctgtttccca；
SEQ ID NO:23：gccttcagtttaaactatcagtgtttgac；
SEQ ID NO:24：tcagattatgtgcagtgtctcgagcgc。
除SQ111(SEQ ID NO:22)、SQ112(SEQ ID NO:23)和PB113(SEQ ID NO:24)以外，对于本领域的技术人员应显而易知，还可设计其它引物和/或探针以扩增和/或杂交SEQ IDNO:10内对于检测样品中源于事件XP-2的DNA的独特存在并且用于检测样品中源于事件XP-2的DNA的存在的序列。
根据标准分子生物学实验室规范，开发用于事件鉴定的PCR测定来用于检测样品中的事件XP-2DNA。由用于检测样品SQ111(SEQ ID NO:22)、SQ112(SEQ ID NO:23)和PB113(SEQ ID NO:24)中源于事件XP-2的DNA的存在的引物对和探针(即，如6FAMTM的荧光标签标记的探针)的各集合优化标准PCR测定或PCR测定的参数。PCR反应的对照包括对大豆基因组中的单一拷贝基因具特异性的内部对照引物和内部对照探针(例如，VICTM标记)。本领域的技术人员应知晓如何设计对大豆基因组中的单一拷贝基因具特异性的引物。一般来说，针对样品中事件XP-2DNA的检测优化的参数包括引物和探针浓度、模板DNA的量以及PCR扩增循环参数。
实施例5、鉴定包含转基因大豆事件XP-2的具有任何育种活性的组织
本实施例利用一对引物经PCR产生的扩增子来检测包含转基因大豆事件XP-2的任何育种活性的组织。确定转基因大豆事件XP-2存在的扩增子包含以SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10形式提供的任意一至少11个以上连续的核苷酸。引物对包括基于侧接序列和插入的表达盒(SEQ ID NO:9)的引物对。
本实施例为了获得发现SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的诊断性扩增子，基于SEQ ID NO:7的碱基1至1747设计正向引物分子SQ114(SEQ ID NO:25)，同时基于插入的表达盒DNA序列(SEQ ID NO:9的位置1至8539)设计反向引物分子SQ115(SEQ ID NO:26)，其中所述引物分子具有足够长度的邻近核苷酸以特异性地杂交于SEQ ID NO:7和SEQID NO:9。寡核苷酸正向引物SQ114的序列(SEQ ID NO:25)与对应于SEQ ID NO:10的位置2549至2576和SEQ ID NO:7的位置562至589的核苷酸序列相同。寡核苷酸反向引物SQ115的序列(SEQ ID NO:26)与对应于SEQ ID NO:10的位置2768至2793和SEQ ID NO:9的位置59至84和SEQ ID NO:7的位置781至806的反向互补核苷酸序列相同。
SEQ ID NO:25：agggatagtgtttacattctctctagtc；
SEQ ID NO:26：gcctgaatggcgaatgctagagcagc。
分别取实施例1转基因大豆事件XP-2的(1)种子、(2)叶片、(3)花荚，采用CTAB法提取基因组DNA作为模板，以(4)不添加模板对照、(5)非转基因大豆皖豆28基因组、(6)转基因大豆中黄6106基因组、(7)常规水稻基因组、8)常规玉米基因组为对照，在引物SQ114和SQ115的作用下，按照表8反应体系进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3所示。
PCR反应程序为：95℃变性3min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行32个循环，最后72℃延伸3min。
表8.PCR反应体系
应用引物对SQ114和SQ115扩增产物电泳结果显示，仅有XP-2样品能够检测到约245bp大小的条带，条带大小与预期一致，不含XP-2基因组的其他样品检测不到特异性条带，本发明提供的引物对能够特异性检测出XP-2事件的存在(图3)。
除SQ114(SEQ ID NO:25)、SQ115(SEQ ID NO:26)以外，对于本领域的技术人员应显而易知，还可设计其它引物以扩增SEQ ID NO:10内对于检测样品中源于转基因大豆事件XP-2的DNA的独特存在并且用于检测样品中源于转基因大豆事件XP-2的DNA的存在的序列；其他的引物序列可由DNA扩增方法领域的技术人员选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9。在对本实施例的方法进行修改的情况下使用这些DNA引物序列在本发明的范围内。本发明从包含XP-2的样品中能获得扩增子的引物序列包括由至少一种源于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的DNA引物序列。
实施例6、蛋白表达量测定
分别取转基因大豆事件XP-2不同代次(T
Cd P450检测试剂盒操作步骤：
1.准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量20mg磨好的样品加入1mL样品提取缓冲液，同时用2mL样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后冰上静置3min，12000g离心10min，取上清用PBS稀释20-200倍，准备加样；
2.孵育：在ELISA板中每孔加入50μL Cd P450酶联反应液，分别将不同的样品以及用于标准曲线制作的不同浓度的CdP450蛋白各取50μL加入到相应的样品孔中，混匀后用parafilm将ELISA板封好，置于水平摇床上，室温180rpm孵育2h；
3.洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体；
4.显色：加入100μL显色底物，充分混匀后室温下180rpm孵育15-20min；
5.终止：每孔加入100μL终止缓冲液后充分混匀，30min内测定结果；
6.检测：通过Thermo MK3酶标仪在450nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线，进行目标蛋白定量。
cp4 epsps酶联免疫定量检测试剂盒操作步骤：
1.准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量20mg磨好的样品加入1mL样品提取缓冲液，充分混匀后置于冰上静置3min，12000g离心10min，取上清稀释200-1000倍，准备加样；
2.样品孵育：向ELISA板上加稀释好的样品以及用于标准曲线制作的不同浓度的cp4 epsps阳性蛋白，每孔100ul，于水平摇床上180rpm室温孵育45min；
3.洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体；
4.酶标抗体孵育：每孔加入100μL酶标抗体，水平摇床上180rpm室温孵育30min；
5.洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将板倒置，充分去除内部残留液体；
6.显色：每孔加入100μL显色底物，180rpm室温孵育15-20min。
7.终止：每孔加入100μL终止缓冲液后充分混匀，30分钟内测定结果；
8.检测：通过Thermo MK3酶标仪在450nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线，进行目标蛋白定量。表9.转基因大豆事件XP-2中CdP450和cp4 epsps蛋白表达量测定结果
/>
*以鲜重微克每克植物组织(μg/g fw)为单位，计算外源蛋白表达水平，表述形式为算术平均数和标准差。样本数n＝20，括号内为ELISA测定结果的最大值和最小值。
实施例7、转基因大豆事件XP-2草甘膦、二甲四氯、硝磺草酮、五氟磺草胺、烟嘧磺隆、吡嘧磺隆和啶嘧磺隆耐受性测试
采用随机区组设计，共24个小区，每个小区面积4m×5m，分别双粒播种转基因大豆事件XP-2和非转基因大豆皖豆28，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，每种大豆3次重复。在V3期按如下步骤处理：1)不喷施；2)分别喷施1800g a.i./ha草甘膦、1848g a.i./ha二甲四氯、123.75g a.i./ha硝磺草酮、45g a.i./ha五氟磺草胺、102g a.i./ha烟嘧磺隆、56.25g a.i./ha吡嘧磺隆和112.5g a.i./ha啶嘧磺隆。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的10株)、药害症状(选取药害症状最轻的10株)，药害症状分级按GB/T17980.42-2000执行。除草剂受害率计算公式：
(X-受害率，单位为％，N-同级受害株数；S-级别数；T-总株数；M-最高级别)。
用方差分析方法比较不同处理的转基因大豆事件XP-2、非转基因大豆皖豆28在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因大豆事件XP-2对除草剂的耐受水平。田间测试结果显示，转基因大豆事件XP-2对草甘膦、二甲四氯、硝磺草酮、五氟磺草胺、烟嘧磺隆、吡嘧磺隆及啶嘧磺隆均具有高度耐受性(表10)。
表10大豆转化事件XP-2对除草剂的耐受性
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实施例8、转基因大豆事件XP-2草甘膦和二甲四氯、草甘膦和硝磺草酮、草甘膦和五氟磺草胺、草甘膦和烟嘧磺隆、草甘膦和吡嘧磺隆及草甘膦和啶嘧磺隆耐受性测试
采用随机区组设计，共24个小区，每个小区面积4m×5m，分别双粒播种转基因大豆事件XP-2和非转基因大豆皖豆28，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，每种大豆4次重复。在3-5叶期按如下步骤处理：1)不喷施；2)分别喷施900g a.i./ha草甘膦+337.5g a.i./ha二甲四氯、900g a.i./ha草甘膦+123.75g a.i./ha硝磺草酮、900g a.i./ha+45g a.i./ha五氟磺草胺、900g a.i./ha+102g a.i./ha烟嘧磺隆、900g a.i./ha草甘膦+56.25ga.i./ha吡嘧磺隆和900g a.i./ha+112.5g a.i./ha啶嘧磺隆。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的10株)、药害症状(选取药害症状最轻的10株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。除草剂受害率计算公式：
(X-受害率，单位为％，N-同级受害株数；S-级别数；T-总株数；M-最高级别)。
用方差分析方法比较不同处理的转基因大豆事件XP-2、非转基因大豆皖豆28在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因大豆事件XP-2对除草剂的耐受水平。田间测试结果显示，转基因大豆事件XP-2对草甘膦和二甲四氯、草甘膦和硝磺草酮、草甘膦和五氟磺草胺、草甘膦和烟嘧磺隆、草甘膦和吡嘧磺隆及草甘膦和啶嘧磺隆均具有高度耐受性(表11)。
表11大豆转化事件XP-2对混合除草剂耐受性调查表
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实施例9、杂交产生含转基因大豆事件XP-2的后代
为了产生包含增强的农艺学、耐除草剂特性的大豆植物或其植物部分，可使含有转基因大豆事件XP-2的大豆植物与潜在的含有任何其它大豆事件或其组合的大豆植物杂交且评估表型以测定后代植物的所得特性。
杂交具体操作步骤：
1.选花：在无病虫、无损伤、生长健壮的非转基因大豆事件XP-2的大豆植株中部偏上节位(第6-12)上，选花瓣即将露出花萼，已能看出花瓣颜色的花；
2.去雄：用左手食指和拇指顺势轻捏花柄和花朵基部，右手用镊子先把大半的花萼向下或斜向下撕去，露出合在一起的花冠。此时，从旗瓣向龙骨瓣方向斜向下(与花柄约呈45度角)夹住花冠上部约1/3(因柱头向旗瓣方向弯曲，如此可避免夹伤柱头)，微微斜向旗瓣方向拔起；
3.取花授粉：将转基因大豆事件XP-2父本花龙骨瓣处的萼片撕下，从两龙骨瓣之间分开花冠，露出黄色的花药(看上去表面蓬松)；再从花丝中部，将花粉团整个夹出，左手轻捏去雄花，花药对准柱头，轻轻摩擦一两下；然后，再小心地将花粉团倒插在花柱上，一则可继续散粉，二则可保护裸露的柱头。
杂交赋予由所述植物育种产生的后代植物的特性可延伸超过事件XP-2的除草剂耐受性，包括但不限于地上害虫控制、除草剂耐性、杀线虫特性、抗旱性、病毒抗性、抗真菌控制、细菌抗性、雄性不育性、耐寒性、耐盐性、增加的产率、增强的油组成、增加的油含量、增强的营养物使用效率或改变的氨基酸含量。具有改进的农艺学性状的转基因事件的实例为本领域中众所周知的。
以下为可用于由转基因大豆事件XP-2育种的可能的转基因大豆品系的非限制性清单以赋予大豆植物、植物部分、种子或商品产品中增强的特性。育种可包括以下任何一种或所有组合：除草剂耐性：大豆GTS 40-3-2、MON87708、MON89788、A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP356043、GU262、W62、W98、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、BPS-CV127-9、SYHT04R、SYHT0H2、EE-GM3、pDAB4472-1606、pDAB4468-0416、pDAB8291.45.36.127、AAD-12；昆虫抗性：MON87701、DAS-81419-2；增加的增强的油组成：DP-305423、G94-1、G94-19、G168、OT96-15、MON87705、MON87769；增加的产率：MON 87712。