一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用。

背景技术

作为豆科植物从自然界中获取氮素的主要途径，豆科植物-根瘤菌的共生固氮过程强弱与前者的产量高低是有最直接影响的；从菌植互作的角度来看，根瘤菌的早期侵染以及豆科植物的早期识别作为整个共生过程的开始，其重要性可见一斑；土壤中的根瘤菌在受到类黄酮诱导后向宿主植物的根部聚集，并通过分泌各种结瘤因子，从而促进根瘤菌侵入到植物根部细胞中，但是根瘤菌分泌的结瘤因子对于宿主植物来说则是外来抗原物质，因此豆科植物在识别这些结瘤信号的时候同时会触发免疫防御反应，而这无疑是会抑制结瘤信号的传导，进而影响整个共生结瘤过程；因此如果能够通过基因工程的方法减弱宿主植物在根瘤菌侵染后触发的早期免疫防御强度，或许能使根瘤菌更好的与豆科植物共生，从而达到后者提高产量的目的。

而目前有关研究方向主要集中在提高作物对病虫害抗性的基因上，但这些基因所编码的蛋白从本质上来说并没有参与到豆科植物-根瘤菌共生固氮过程中，因此也无法从根本上提高大豆产量；

病程相关蛋白1(Pathogenesis-related Protein 1,PR-1)是植物免疫防御反应的核心组成部分，在植物防御中起着重要作用，多数研究中都会用其表达量的高低来证明植物免疫强度的强弱，但病程相关蛋白PR-1在豆科植物-根瘤菌共生免疫过程中具体行使功能的方式是未知的，因此，本发明提出一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用，该大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用提出的大豆病程相关基因GmPR-1是一个编码参与植物免疫防御反应核心蛋白的基因，并且通过过表达GmPR-1基因，能够影响豆科植物在根瘤菌侵染时触发的早期免疫防御反应，进而提高共生结瘤和固氮能力，也能够增加单颗根瘤的瘤重和大小，提高大豆根瘤总重量和植株地上部分生物量。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用，包括所述大豆-根瘤菌共生免疫防御GmPR-1基因从大豆品系Wiliams82中使用引物对PR-1-F/R克隆获得，所述GmPR-1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GmPR-1蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步改进在于：所述大豆-根瘤菌共生免疫防御GmPR-1基因克隆具体为先配制包含大豆品系Wiliams82基因组DNA模板1μl、2×Phanta Max Buffer 25μl、10mM的dNTP 2μl、10μlM的引物PR-1-F 1.5μl、10μlM的引物PR-1-R 1.5μl、Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase 1μl和无菌去离子水18μl的总体积为50μl的反应体系，随后将反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增得到GmPR-1基因。

进一步改进在于：所述PCR扩增处理过程为现在95℃条件下反应5min，随后以95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min进行35次循环，最后在72℃条件下反应10min即完成PCR扩增处理。

进一步改进在于：所述引物对中引物PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，包括以下步骤：

步骤一、植物过表达载体的构建，先使用引物对pUB-PR-1-F/R对大豆品系Wiliams82基因组DNA进行扩增得到两端带有部分载体pUB-GFP同源区段的GmPR-1片段，随后使用同源重组的方法将片段连接到pUB-GFP载体上，得到植物过表达载体pUB-GFP：：GmPR-1；

步骤二、大豆种子萌发处理，先采用氯气对大豆种子进行灭菌，随后将其播种于蛭石中培养，得到萌发大豆；

步骤三、菌膜培养，将植物过表达载体通过电转的方法导入农杆菌K599中，并用引物对pUB-F/R通过PCR的方法筛选得到阳性转化子，随后对阳性转化子进行培养得到菌膜；

步骤四、侵染处理，在萌发大豆的下胚轴沿45°斜切，随后将菌膜处理成膏状，将斜切后的萌发大豆蘸取膏状菌膜后，沿斜切面将大豆放入无氮固体FM培养基中培养2-3天后，再将大豆取出，放入有氮固体FM培养基中培养3-4天；

步骤五、毛根培养及鉴定筛选，将侵染处理培养后的植物取出，去除切面愈伤组织处长出的根后在有氮液体FM培养基中培养5-6天，随后取出植物并检测阳性根并去除非阳性根，然后继续培养接菌；

步骤六、鉴定及表型分析，在接菌培养28天后对毛根转化植株的共生表型进行考察，并使用qRT-PCR的方法用引物对qPCR-PR-1-F/R对根瘤中GmPR-1基因的表达量进行分析。

进一步改进在于：所述步骤一中引物对pUB-PR-1-F/R中的引物pUB-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，引物pUB-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步改进在于：所述步骤六中引物对qPCR-PR-1-F/R中的引物qPCR-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物qPCR-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的有益效果为：本发明提出的大豆病程相关基因GmPR-1是一个编码参与植物免疫防御反应核心蛋白的基因，并且通过过表达GmPR-1，能够影响豆科植物在根瘤菌侵染时触发的早期免疫防御反应，进而提高共生结瘤和固氮能力，也能够增加单颗根瘤的瘤重和大小，提高大豆根瘤总重量和植株地上部分生物量，为豆科植物的氮高效和分子育种提供基因资源，为大豆-根瘤菌的组合利用及应用提供分子改造技术，从而服务于环境友好型的绿色可持续农业的发展。

附图说明

图1为本发明实施例2应用方法流程图。

图2为本发明实施例2鉴定筛选阳性转化子电泳示意图。

图3为本发明实施例2表型的差异示意图。

图4为本发明实施例2毛根植株表型示意图。

图5为本发明实施例2毛根植株根瘤图。

图6为本发明实施例2毛根植物生物学表达量示意图。

图7为本发明实施例2的GmPR-1表达量示意图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供了一种大豆免疫防御基因，包括所述大豆免疫防御GmPR-1基因从大豆品系Wiliams82中使用引物对PR-1-F/R克隆获得，所述GmPR-1基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述GmPR-1蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述大豆-根瘤菌共生免疫防御GmPR-1基因克隆具体为先配制包含大豆品系Wiliams82基因组DNA模板1μl、2×Phanta Max Buffer 25μl、10mM的dNTP 2μl、10μlM的引物PR-1-F 1.5μl、10μlM的引物PR-1-R 1.5μl、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl和无菌去离子水18μl的总体积为50μl的反应体系，随后将反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增得到GmPR-1基因。

所述PCR扩增处理过程为现在95℃条件下反应5min，随后以95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min进行35次循环，最后在72℃条件下反应10min即完成PCR扩增处理。

所述引物对中引物PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

PR-1-F：atggggttgtgcaaggtttca；

PR-1-R：ctagtagggtctttggccaacata。

实施例2

根据图1-图7所示，本实施例提供了一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，应用过程如下：

将从大豆品系Wiliams82中克隆的GmPR-1基因全长CDs克隆到到pUB-GFP上，转入Wiliams82中，所获得的转基因植株在接种大豆慢生根瘤菌BradyrhizobiumjaponicumUSDA6后，出现地上部分生物量以及地下部分所接根瘤单颗大小和重量显著高于野生型的表型。因此可通过该方法增强大豆与特定种类根瘤菌的共生结瘤和固氮能力，包括以下步骤：

步骤一、植物过表达载体pUB-GFP：：GmPR-1的构建，先使用引物对pUB-PR-1-F/R对大豆品系Wiliams82基因组DNA进行扩增得到带有部分载体pUB-GFP同源区段的GmPR-1片段，随后使用同源重组的方法将片段连接到经KpnI和XbaI双酶切后的载体pUB-GFP上，得到植物过表达载体pUB-GFP：：GmPR-1，并通过农杆菌介导毛根转化的方法将其转入Wiliams82中；

引物对pUB-PR-1-F/R中的引物pUB-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，引物pUB-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

pUb-PR-1-F：ttgttgactcgacagtctagaatggggttgtgcaaggtttca；

pUb-PR-1-R：gtccttatagtccatggtaccctagtagggtctttggccaacata。

步骤二、大豆种子萌发处理，挑取无破损、无病斑的大豆，用氯气灭菌(量取100ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，密封灭菌16小时)，随后将灭过菌的大豆播种于灭过菌的蛭石中，先放置于在28℃培养箱中暗培养2-3天，待子叶从蛭石中冒出后再放置于大豆人工气候室中培养2-3天，生长至子叶竖起，与下胚轴约成直角状态，得到萌发大豆。

步骤三、菌膜培养，将植物过表达载体pUB-GFP：：GmPR-1通过电转的方法导入农杆菌K599中，并用引物对pUB-F/R通过PCR的方法筛选得到阳性转化子，该引物对扩增的阳性转化子条带为705bp，如说明书附图2所示，图中M表示DL2000，1表示pUB-GFP：：GmPR-1阳性转化子，2表示pUB-GFP阳性转化子；将阳性转化子再液体培养基中活化，取500μl工程菌菌液，加入5％甘油后涂板，28℃培养约1-2天，生成菌膜；

其中引物对pUB-F和pUB-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，所示。

pUB-F：gcgcgcccttatcgtcatcgtc；

pUB-R：ccttgtttgttgattctattgccgtggatt。

步骤四、侵染处理，取出萌发好的大豆，在下胚轴“绿白交界处”沿45°斜切，随后用消毒后的刀片将平板上的菌膜聚集到平板中间形成“菌膏”，之后用大豆下胚轴切口蘸取膏状菌膜；将侵染后的大豆放入无氮固体FM培养基中，在大豆人工气候室中暗培养2-3天；将植株转入有氮FM培养基中，在大豆人工气候室中光培养3-4天。

步骤五、毛根培养及鉴定筛选，将侵染处理培养后的植物取出，去除切面愈伤组织处长出的根后在有氮液体FM培养基中培养5-6天，随后取出植物，吸水纸吸干其根上的液体，在体式荧光显微镜下检测阳性根，具有GFP绿色荧光的为阳性根，然后拔除其它非阳性根，仅留下最粗壮的单一阳性根，然后将具有单一阳性根的植株继续放入有氮FM培养基中培养4-5天，最后移至土壤中进行培养并接种大豆慢生根瘤菌BradyrhizobiumjaponicumUSDA6。

步骤六、鉴定及表型分析，在接菌培养28天后对毛根转化植株的共生表型进行考察，并使用qRT-PCR的方法用引物对qPCR-PR-1-F/R对根瘤中GmPR-1基因的表达量进行分析；

引物对qPCR-PR-1-F/R中的引物qPCR-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物qPCR-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

qPCR-PR-1-F：gtgagtcacgttgccaatgc；

qPCR-PR-1-R：ccacttaggtcaccagtgct。

过表达GmPR-1毛根转化植株(pUB-GmPR-1)中GmPR-1基因的表达量和共生表型与对照组植株毛根(将植物表达载体pUB-GFP通过发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化的方法导入大豆品系Wiliams82中，Control)表型的差异如说明书附图3所示，图中A为转基因植株毛根表达量和对照组植株毛根GmPR-1基因的表达量柱状图，B为接种大豆慢生根瘤菌BradyrhizobiumjaponicumUSDA6后的地上表型示意，C为地下部分生物量示意图。由图可知，过表达GmPR-1毛根转化植株中GmPR-1表达量显著提高后，单颗根瘤的瘤重和大小显著增加，从而导致其地上部分高度也显著增加。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。