一种猪血浆基质胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞培养和组织工程领域，具体涉及一种猪血浆基质胶及其制备方法和应用。

背景技术

细胞是动物机体进行生命活动的基本单位，对动物生命过程中特定机制的探讨通常建立在以细胞体外培养为基础的试验研究上。动物细胞体外培养是生命科学研究中最常见的技术手段之一，细胞培养不仅能为生物学研究提供便利条件，还能为体内研究提供模型和材料，具有高效率、易重复、影响因素可控和避免诸多伦理问题等优势。动物细胞培养目前已被广泛应用于包括畜牧、兽医学在内的众多研究领域。

2D(Two-Dimensions,2D)细胞培养作为生命科学领域中的常用技术，为体外研究细胞内生物学事件及其机制提供了便利条件。然而随着对细胞和组织微环境研究的逐渐深入，研究人员发现2D条件下培养的细胞的状态和活性与体内细胞存在较大差异，细胞培养研究所获得的结果常与动物试验和临床试验结果相矛盾。近年来，更多的科研工作者致力于开发3D(Three-Dimensions,3D)细胞培养技术，以此为细胞提供更接近体内环境的体外培养环境。

3D细胞培养(Three-dimensional cell culture,TDCC)技术是一种以2D细胞培养技术和动物试验为基础发展起来的简单有效的细胞培养方法，采用3D细胞培养技术可以更好地模拟体内细胞生存的微环境，从而为研究提供更可靠的模型平台。3D细胞培养技术可广泛的应用于组织工程研究、药物研发和药理学研究、癌症研究、基因和蛋白质表达研究、细胞生理学研究和类器官研究。

类器官(Organoids)是一类来源于自体的组织或干细胞，通过体外3D培养形成的细胞团块，这类细胞团块具有体内组织和器官的3D结构，并更多的保留了相应的功能和表观遗传学特性。因此，类器官培养能广泛应用于组织再生，组织修复和干细胞分化等领域，并可以用作各种疾病的体外模型和治疗工具。

类器官通常在3D水凝胶系统中培养，形成高度水合的网状聚合物。3D水凝胶系统中适宜的支架材料能够为细胞生长提供适宜的空隙结构、表面活性、机械强度及生物组织相容性，使组织或细胞能更好地在3D材料上黏附、增殖、分化。此外，不同支架材料对细胞活力、形态维持、增殖、分化、凋亡和细胞形态发生也存在不同的影响。已经鉴定的多种天然聚合物和蛋白质都可以作为支架用于制备3D水凝胶，例如藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖和纤维蛋白原等。

血液中含有的大量纤维蛋白原在凝血酶的作用下可以转变为纤维蛋白。纤维蛋白相互交联成立体网状，可作为3D水凝胶培养中的支架材料。我国生猪养殖体量大，猪血资源丰富，但仅部分通过加工用作食品和饲料外，利用程度较低。充足的猪血资源可以用于大规模制备猪血浆来源纤维蛋白水凝胶和猪血小板裂解液(Porcine platelet lysate,PPL)，提高猪血利用率。

血浆在用于细胞培养之前需要经过灭菌处理。使用伽马射线辐照的方式用于hPL的灭菌处理。伽马射线辐照可以直接应用于由大批量标准化产品的制备。伽马辐照的优点是不含添加剂或残留物。然而，伽马射线辐照灭菌除了能灭活动物血清中的病毒，对血清中的细胞因子也会造成损伤。结果表明当γ辐照剂量为45kGy时，在冷冻血浆中的因子II损失为43.2％，因子IX损失为55.8％，因子X损失为48.2％，而γ辐照剂量在31kGy(因子II)时损失为36％，在38kGy时损失23.3％，在40kGy(因子IX)时损失24％，在36kGy(因子X)时损失36％。并且使用辐照灭菌操作繁琐，成本较高，不适合大规模生物制品的制备。

目前的细胞培养基质主要有水凝胶、琼脂糖和Matrigel等。水凝胶与琼脂糖价格虽然低廉，但不能提供对细胞生长有益的生长因子；Matrigel是从免疫缺陷小鼠肉瘤中提取的溶解基底膜制剂，富含细胞外基质(ECM)蛋白，包括层粘连蛋白(主要成分)、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白，以及一些生长因子，但是其价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪血浆基质胶及其制备方法和应用，其通过采集新鲜抗凝猪血分离血浆，开发制备新的3D水凝胶系统，即猪血浆基质胶，猪血浆基质胶具有良好的理化特性和生物学特性，用于细胞培养时能够提高细胞增殖速率且不改变细胞的生长状态和分化潜能。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种猪血浆基质胶的制备方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

(1)吸取无菌猪抗凝血浆和猪血小板裂解液到离心管中，再吸取钙盐溶液加入离心管，充分吹打混匀后转移至培养皿中，将培养皿放入培养箱中孵育，使基质充分凝固；

(2)待基质充分凝固后，在基质表面加入基础培养基和培养物，放入培养箱中培养。

另外，根据本发明上述实施例的一种猪血浆基质胶的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中，猪血小板裂解液的制备方法如下，将从猪全血中采集的血小板重悬于已离心去除纤维蛋白原的血浆中，在-80℃和4℃条件反复冻融三次，离心后收集上清液，上清液经过滤器进行过滤除菌，过滤液即为猪血小板裂解液。

在本发明的一些实施例中，所述去除纤维蛋白原的血浆的制备方法包括以下步骤：向无菌猪抗凝血浆中添加CaCl

在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中，无菌猪抗凝血浆的制备方法包括以下步骤：

(101)预先将抗凝剂添加至采血容器中，采血前使抗凝剂充分润湿容器壁；

(102)屠宰时用预添加抗凝剂的采血容器接取猪全血，收集过程及完成后缓慢颠倒采血容器以使血液和抗凝剂充分混匀；

(103)将采集后的采血容器静置1h，静置后抗凝血会因细胞沉降速率不同而分层，底层为红细胞，中层为薄层白膜层，包含白细胞及血小板层，上层为富血小板血浆；

(104)将采血容器中上层和中层液体转移到离心管中，将离心管在20-22℃下离心，离心之后的上层液体即为所需血浆，中层为血小板沉淀层，底层为红细胞沉淀层，将血浆收集到新的离心管中，可于冷冻或超低温保存或直接用于后续操作；

(105)将收集在新的离心管中的血浆利用过滤器过滤除菌，即得无菌猪抗凝血浆。

在本发明的一些实施例中，所述无菌血浆中PPL添加体积百分数为1-50％，CaCl

在本发明的一些实施例中，所述步骤(1)中，钙盐溶液为氯化钙，培养箱的温度为37℃，培养箱中CO

在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)中，基础培养基为α-MEM培养基，培养过程中每2d换液。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种根据所述的猪血浆基质胶的制备方法制备得到的猪血浆基质胶。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种3D细胞培养基质。根据本发明的实施例，所述3D细胞培养基质为所述的猪血浆基质胶。

在本发明的另一方面，本发明提出了将所述的猪血浆基质胶用于组织工程方法中，所述组织工程方法包括细胞、组织和类器官培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)在本发明中，通过采集新鲜抗凝猪血分离血浆，开发制备新的3D水凝胶系统，即猪血浆基质胶，猪血浆基质胶具有良好的理化特性和生物学特性，用于细胞培养时能够提高细胞增殖速率且不改变细胞的生长状态和分化潜能。

2)在制备PPL和血浆时，使用0.22μm一次性真空过滤器对PPL和血浆进行灭菌，操作简单且相较于辐照灭菌方式成本更低。

3)PEF和PBMSC在PFMG中能够正常增殖，且细胞生长速率优于使用PPL和FBS；在PFMG中培养PBMSC细胞不改变其分化潜能；PFMG具有良好的渗透性和可塑造性。

4)本发明成功制备PFMG，能够支持细胞在其中立体培养，且对应细胞保持了其原有的生物学特性；与传统培养方式相比，PFMG用于细胞培养后并未明显改变细胞生物学特性，不同培养体系下的pBMSCs细胞均具有分化潜能；细胞在PFMG中的增值速率高于2D培养方式；在诱导分化过程中，不同立体培养条件下表现出不同的特性和优势。立体基质能为细胞、组织或类器官的培养提供空间支撑，提供分子筛微环境，为相关研究工作提供制备方法简便、成本低廉的通用方法。

5)本发明的猪血浆基质胶是利用猪血为原材料来制作，原料极易获得并含有细胞生长因子，适合无外源3D培养猪细胞。

附图说明

图1中，A为本发明实施例中血浆和血小板的分离示意图，B为本发明实施例中再生血清的分离示意图，C为本发明实施例中血小板裂解液的分离示意图；

图2是本发明实施例中不同Ca

图3是本发明实施例中再生血清的制备流程图；

图4是本发明实施例中猪血小板裂解液的制备流程图；

图5是本发明实施例中不同粒径墨水在显微镜下的颗粒情况图，其中，(a)为PBS，(b)为水彩墨水，(c)为钢笔墨水，(d)为碳素墨水；

图6是本发明实施例中不同墨水滴加到PFMG中的渗透性试验结果图，其中，(a)为水彩墨水，(b)为钢笔墨水，(c)为碳素墨水；

图7是本发明实施例中不同强度的PFMG中不同时间点钢珠位移示意图；

图8是本发明实施例中PBMSC不同培养条件下细胞形态图；

图9是本发明实施例中PEF不同培养条件下细胞形态图；

图10是本发明实施例中细胞生长曲线图，其中，(a)为PBMSC细胞生长曲线图，(b)为PEF细胞生长曲线图；

图11是本发明实施例中不同立体PFMG的制备图，其中，(a)为夹层培养，(b)为表面培养，(c)为混合培养，左图均为立体图，右图均为主视图；

图12是本发明实施例中PBMSC和PEF不同培养体系中细胞形态图；

图13是本发明实施例中在不同的诱导培养基中对成软骨、成骨诱导的基质胶进行阿利新蓝染色结果图，其中，左边图为成软骨，右边图为成骨，(a)为混合培养，(b)为表面培养，(c)为夹层培养；

图14是本发明实施例中在不同的诱导培养基中对成软骨、成骨诱导的基质胶进行茜素红染色结果图，其中，左边图为成软骨，右边图为成骨，(a)为混合培养，(b)为表面培养，(c)为夹层培养。

图15是本发明实施例中3D培养所形成的基质胶结构经组织切片染色图；

图16是本发明实施例中使用“NSFC”4个6#铅字作为模具对PFMG的成型进行干预图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本实施例中所用到的主要试剂的配制方法如下：

(1)10％PPL培养基

αMEM培养基 90.00mL

PPL 10.00mL

4℃冰箱保存。

(2)15％FBS培养基

αMEM培养基 90.00mL

PPL 10.00mL

4℃冰箱保存。

(3)CPDA-1抗凝剂

将各组分加入到900mL水中，搅拌溶解，用NaOH调节pH至7.4后，加入水定容至1L，用0.22μm过滤器过滤，4℃冰箱保存。

(4)CaCl

CaCl

水 1.00L

将CaCl

(5)成骨诱导分化培养基

4℃冰箱保存。

(6)成软骨诱导分化培养基

4℃冰箱保存。

(7)维生素C

维生素C 88.00mg

PBS 10.00mL

维生素C溶解后0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。

(8)地塞米松储液(1000×)

地塞米松 25.00mg

甲醇 64.00mL

地塞米松充分溶解后0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。

(9)吲哚美辛

吲哚美辛 143.00mg

甲醇 10.00mL

吲哚美辛充分溶解后0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。(10)丙酮酸钠储液(100×)

丙酮酸钠 55.00mg

PBS 10.00mL

丙酮酸钠溶解后0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。

(11)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)

IBMX 50.00mg

无水乙醇4.50mL

IBMX溶解后0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。

一种猪血浆基质胶的制备方法，包括以下步骤：

1、猪血浆和血小板的分离

a.预先将抗凝剂(CPDA-1)添加至1L容量的采血容器中，采血前上下颠倒使抗凝剂充分润湿瓶壁，以防止血液与瓶壁接触时血小板发生激活；

b.屠宰时用预添加抗凝剂的采血容器接取猪全血至尽量接近1L，收集完成后缓慢颠倒采血容器5次以使血液和抗凝剂充分混匀；

c.将采集到的抗凝血静置1h，静置后抗凝血会因内容物沉降速率不同而分层，如图1所示，底层：红细胞(占总体积的50％-80％)，中层：薄层白膜层，包含白细胞及血小板层(buffy coat,BC)，上层：富血小板血浆(platelet richplasma,PRP)；

d.使用移液管将采血容器中上层和中层液体转移到15mL离心管D中，将离心管D在20-22℃下以3200rpm离心20min；

e.离心上层液体即为所需血浆，将血浆收集到新的离心管F中用于后续操作；

f.在离心管D中，沿血小板和红细胞之间的分界线将离心管底部剪掉，去除红细胞部分，将剩余血小板收集在冻存管G中，称重并做好标记存于液氮中，后续用于PPL的制备；

g.将收集在离心管F中的血浆使用0.22μm一次性真空过滤器过滤除菌，将过滤后的无菌血浆存于-80℃冰箱冷冻保存，得到无菌血浆。

2、猪血浆中纤维蛋白原的去除

为获得再生血清，通过在血浆中添加CaCl

在大量制备去纤维蛋白原血浆即再生血清时，采取了以592:8的体积比添加浓度为1mol/LCaCl

表1CaCl

3、再生血清(去纤维蛋白原血浆)的制备

a.在确定无菌血浆中去除纤维蛋白最适Ca

b.按比例向无菌血浆中添加CaCl

c.将血浆纤维蛋白基质凝胶置于20-22℃下，9000g离心30min；

d.离心后上清液即为再生血清，收集上清液分装后-80℃保存。

4、猪血小板裂解液(PPL)的制备

如图4所示，将1g从猪全血中采集到的血小板重悬于25mL已离心去除纤维蛋白原的血浆(即再生血清)中，在-80℃和4℃条件反复冻融三次，6000g离心30min后收集上清液，上清液经0.22μm孔径过滤器进行过滤除菌，滤过液即为PPL，为减少个体及批次间差异，将9个供体的未过滤血浆进行混匀，分装后-80℃保存。

5、PFMG(猪血浆基质胶)的制备

按照95％无菌血浆、1％PPL、4％氯化钙的体积比制备PFMG，具体操作步骤如下:

a.以直径为35mm培养皿为例，吸取0.95mL无菌血浆和0.1mL PPL到15mL离心管中(用于培养细胞时，再加入细胞悬液)；

b.吸取0.4mL 0.5mol/LCaCl

c.充分吹打混匀后快速转移至35mm培养皿中(不能有气泡产生)；

d.将35mm培养皿放入37℃、5％CO

e.待基质充分凝固后，表面加入1mLα-MEM培养基，放入37℃、5％CO

f.实验室常用的培养皿和培养板在制备PFMG的最适体积如表2所示。在12孔板中制备猪血浆基质胶时，每孔最终体积为500μL；在35mm培养皿中制备猪血浆基质胶时，最终体积为1mL。

表2不同培养皿制备PFMG的最适体积

对制备得到的猪血浆基质胶进行性能测试试验如下：

1、PFMG的消化

为了比较细胞在塑料培养皿表面的生长情况和在猪血浆基质胶内的生长情况，要将在PFMG中培养的细胞消化，根据实验需要重新接种在PFMG中或者将细胞冻存。为此目的，使用0.05％(w/v)I型胶原酶(DMEM溶解)和0.05％(w/v)中性蛋白酶(PBS溶解)进行PFMG的消化，两种酶使用时按体积比1：1混合使用。用无菌手术刀将猪血浆基质胶切成2-4mm

2、新鲜PFMG的渗透能力

含有不同色素颗粒大小墨水类型滴加到新鲜PFMG中进行渗透性试验，用以模拟细胞生长过程中的物质交换和大分子屏蔽过程。利用稀释后的墨水进行涂片并在显微镜下进行观察，可见三种墨水的颗粒情况如图5所示。PBS中干净无杂质；水彩墨水中染色剂为水溶性小分子染料，均匀无颗粒；百乐钢笔水中含有细小的颗粒；碳素墨水中则含有较为粗大的碳颗粒。

在5mL圆底塑料离心管中加入3mL的PFMG，待PFMG充分凝固后，在不同的时间段向圆底塑料离心管中添加100μL选定的不同类型墨水，试验设计如表3所示。拍照记录染料的渗透深度。

表3墨水扩散试验

结果如图6所示，水彩墨水因其具有亲水彩且不含颗粒物质，添加墨水10min后墨水渗透约为5mm，随着时间的增加渗透性越强，24h的渗透可达2cm；钢笔墨水的因其含有少量的颗粒物质，渗透性略低与水彩墨水，添加墨水10min后墨水渗透约为2mm，在30min后渗透约为5mm，随着时间增加渗透性缓慢增强，24h的渗透深度为1.3cm；而碳素墨水因其含有大量的碳颗粒，墨水渗透性低，24h的渗透约为3mm。

以上结果表明，制备的PFMG能够满足细胞生长过程小分子物质的快速扩散，有利于营养物质运输，而对大分子物质具有阻隔作用，更好的模拟了动物机体结缔组织中分子筛结构的形态和功能。

3、新鲜PFMG的凝胶强度

在5mL圆底塑料离心管中加入3mL不同强度的PFMG，PFMG稀释用细胞培养α-MEM基础培养基，待PFMG充分凝固后，向5mL圆底塑料离心管中投入9mm钢珠，观察钢珠下降程度，并拍照记录。

试验结果如图7所示，按梯度稀释依次制备10％-100％PFMG，纯α-MEM基础培养基作为对照。观察到不同浓度的PFMG都可以凝固，加入钢珠后因重力发生向下的挤压。加入钢珠3min后，钢珠因重力会导致凝胶被压缩而向下移动，浓度越低的凝胶其强度相对越低；加入钢珠7min后，试验组10％PFMG中钢珠挤压凝固的PFMG到达流式管底部，其他试验组钢珠均有下移但未到达管底；加入钢珠15min后，试验组20％PFMG中钢珠挤压凝固的PFMG到达流式管底部，其他试验组钢珠均有下移但未到达管底。此后30％-100％试验组中钢珠仅向下移动少部分距离，均不会到达流式管底部。以上结果表明，所制备的PFMG可以根据实验的具体情况调整强度。

4、在PFMG条件下培养猪来源细胞时对细胞形态的影响

从发育至24.5d的猪胎儿中分离获得PEF细胞，并从成年猪肋骨红骨髓中分离获得了PBMSC细胞。

(1)猪胎儿成纤维细胞(PEF细胞)的分离方法包括以下步骤：

a.将怀孕24.5天的母猪屠宰后取出子宫，用棉线绳扎牢子宫两端后剪断子宫体，将子宫放入已灭菌的保鲜袋中带回实验室；

b.将子宫置手术托盘中，用清水反复清洗子宫，直到将表面清洗干净，用高压后的纱布将水擦净；

c.用双氧水、碘伏、75％乙醇依次冲洗子宫表面彻底消毒,生理盐水冲洗干净，湿热灭菌后的纱布擦干，移入超净台内操作；

d.引出尚充盈的尿囊膜，撕破放出羊水，将胎儿移入PBS中；

e.将胎儿在PBS中反复清洗3次以上，用镊子去净胎儿表面残留羊膜，再重复用PBS清洗数遍，直到没有其他母体组织；

f.用镊子夹断四肢、头部、尾部，剥离红色的胎肝胎肾，仅保留躯干部分，将躯干放入PBS中反复清洗3次以上；

g.用镊子提取胎儿反复放在培养皿盖上以去除残留PBS，随后将躯干置入培养皿中；

h.滴加300μL IV型胶原酶于躯干上用眼科剪将其剪成匀浆；

i.取上述1个胎儿个体匀浆添加5mL IV型胶原酶于15mL离心管。将离心管置于37℃水浴锅中充分消化30min，每5min颠倒混匀一次至液体粘稠；

j.1000rpm离心5min吸弃上清；

k.加入5mL DMEM基础培养基进行漂洗，置于37℃水浴锅中10min，1000rpm离心5min吸弃上清；

l.重复上述步骤；

m.将组织接入T75培养瓶中加入12-15mL培养基，次日观察换液；

n.待细胞生长为80％-95％连续单层时，冻存细胞。

(2)猪骨髓间充质干细胞(PBMSC细胞)的分离方法包括以下步骤：

a.采集一条猪肋骨低温条件运回实验室；

b.用双氧水、碘伏、75％酒精依次对采集肋骨进行充分消毒；

c.再次碘伏、75％酒精消毒，重复两遍；

d.肋骨从酒精取出后，然后放入4℃的含5×双抗的PBS溶液中；

e.将组织取出置于超净台内高压灭菌托盘上，用镊子和手术刀剔除肋骨周围猪肉，再将肋骨依次置于碘伏、75％酒精中充分消毒；

f.将组织取出置于超净台内高压灭菌托盘上，将肋骨用骨钳、骨剪充分剪开；

g.将肋骨内部红骨髓刮至100mm皿中，加入8-10mL培养基，次日观察换液；

h.待细胞生长为80％-95％连续单层时，冻存细胞。

为了探究PFMG是用于细胞培养的效果，将分离获得PEF和PBMSC分别接种于含15％FBS(胎牛血清)培养基、含10％PPL(猪血小板裂解液)培养基和含10％PPL的PFMG培养基中，相差显微镜下逐日观察PEF和PBMSC的生长状态、传代后的形态变化特点及贴壁情况，拍照记录。

分离到的PEF细胞在形态上符合成纤维细胞的典型形态，如图8所示；分离得到的PBMSC细胞在形态上符合间充质干细胞的典型形态，如图8所示。并且分离获得的PEF和PBMSC都能够在含15％FBS和含10％PPL的培养基中稳定生长。将获得的PEF与PBMSC细胞在体外进行扩增后冻存，用于后续对比培养试验。

将分离获得的PEF、PBMSC细胞分别接种于含10％PPL、含15％FBS的2D培养条件中，以及PFMG中，连续传代后，倒置显微镜下观察细胞形态。图8-9为P3代时不同培养条件下细胞生长形态，细胞多呈长梭形，星形或纺锤形，成纤维细胞细胞与间充质干细胞形态相似无明显差异。

PBMSC细胞和PEF细胞在接种0h时，在FBS和PPL中接种的细胞形态无差异，细胞均匀分布在培养皿表面，细胞呈现圆形；而在PFMG中接种的细胞因呈多层次分布，因此在显微镜下观察可以看到不同空间分布的圆形细胞。接种24h后，在FBS和PPL中培养的细胞形态无差异，细胞多呈长梭形，星形或纺锤形；而在PFMG中接种的细胞则呈现多棱角状态。结果表明PBMSCs和PEF均能在三种不同培养环境中正常生长，细胞形态略有差异。

5、测定PFMG条件下猪细胞生长增殖速度

将分离获得的PEF和PBMSC细胞分别接种于含10％PPL培养基、含15％FBS培养基和PFMG中进行传代培养，选取P3代细胞以6×10

PBMSC细胞在PPL和FBS培养条件下，前1-2d内生长速度较为一致，培养至第3d时，PPL培养条件下细胞的增殖速度较FBS中的快，此后细胞增殖速度更明显，这与实验室前期的研究进展相一致；在PFMG培养条件下，细胞的生长速度在1-2d与PPL和FBS保持一致，第3d开始PFMG中培养的细胞增殖速度展现出比PPL更大的优势(见图10a)。

与PBMSC细胞的生长趋势类似，PEF细胞在PPL和FBS培养基中1-3d生长速度较为一致，第4d开始PPL中培养比FBS中培养细胞的增殖速度快，此后优势更明显，在PFMG中细胞的生长速度在1-2d与PPL和FBS保持一致，第3d开始PFMG中培养的细胞增殖速度展现出比PPL更大的优势(见图10b)。

6、PFMG条件培养猪来源细胞对细胞形态的影响

制备了不同的立体PFMG培养体系，如图11所示，具体制备方法如下：

(1)夹层培养(如图11a所示)：在培养皿底预先铺一层PFMG，待基质胶充分凝固后，将细胞接种在基质胶表面，放入37℃、5％CO

(2)表面培养(如图11b所示)：在培养皿底预先铺一层PFMG，待基质胶充分凝固后，将细胞接种在基质胶表面，表面添加培养基，放入37℃、5％CO

(3)混合培养(如图11c所示)：将细胞悬液和PFMG充分混匀加入培养皿中，待基质胶充分凝固后，表面添加培养基，放入37℃、5％CO

将分离获得的PEF和PBMSC细胞分别接种于表面培养PFMG、夹层培养PFMG和混合培养PFMG立体培养体系中，细胞连续传代后，倒置显微镜下观察细胞形态。图12为P3代不同立体培养体系中细胞生长形态。

PBMSC细胞和PEF细胞在表面培养中和夹层培养中细胞形态差异不大，细胞多呈长梭形，星形或纺锤形；PBMSC细胞和PEF细胞在混合培养中因其细胞呈现多层次分布，细胞有更广阔的生长空间，细胞形态发生改变，各自呈现多棱角形态。

7、诱导分化

为鉴定PBMSC细胞在不同立体PFMG培养条件下是否具有多向分化潜能，对PBMSC细胞进行了诱导分化鉴定，分别向成骨和成软骨进行定向诱导分化。取三种立体培养条件下生长至P3代的细胞，将对数生长期的细胞接种于6孔板中。

成骨分化：将PBMSC细胞以6×10

成软骨分化：将PBMSC细胞以6×10

其中，阿利新蓝染色包括以下步骤：

移除细胞培养基，用PBS洗两次，用多聚甲醛固定15～20min；加入Alcian酸化液浸泡3min；加入Alcian染色液染色30min，流水冲洗；加入固红染色液复染5min。流水冲洗1min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜镜检，图像采集分析。

茜素红染色包括以下步骤：

移除培养基，将细胞团块制成石蜡切片，脱蜡至95％乙醇；载玻片竖立放置，彻底风干；切片加入茜素红S染色液的拨片染缸浸染；蒸馏水快速冲洗；复染液复染，蒸馏水冲洗3次；常规脱水透明，中性树胶封固；显微镜镜检，图像采集分析。

如图13中阿利新蓝染色可知，经过14d的诱导培养，PBMSC细胞在不同立体PFMG中均可分化出类软骨组织并分泌出软骨间质。

如图14中茜素红染色可知，经过14d的诱导培养，细胞在不同立体PFMG中均能诱导出成骨组织，表明细胞保持成骨诱导的特性。

8、3D培养所形成的结构经组织切片染色(HE染色)观察

移除培养基，基质胶用固定液固定；经浓度从低到高的酒精作为脱水剂脱水；将脱水完成的基质胶转移至二甲苯溶液中透明化；用石蜡包埋，待石蜡完全凝固后切片；切片放入二甲苯中脱蜡；脱蜡后切片经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水；用苏木精和伊红进行染色；染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯溶液后封片。

如图15所示，发现纤维蛋白呈现弱嗜酸性并交织成网，细胞分散生长，形态从多角形到细长纤维形过度，胞质呈较强嗜酸性，细胞核为嗜碱性。所形成的结构与机体疏松结缔组织非常接近。

9、PFMG的定型能力和支持能力。

如图16所示，使用“NSFC”4个6#铅字作为模具对PFMG的成型进行了干预，凝固后可形成“NSFC”字样凹槽并稳定维持，为后续采用不同3D模式培养睾丸类器官提供了重要支持。综上表明PFMG可作为3D培养材料用于类器官的培养，具有良好的分子筛特性、组织相容性、定形能力和类似结缔组织的基质结构。

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