一种利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法

技术领域

本发明涉及了破骨细胞诱导方法的技术领域，具体公开了一种利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法。

背景技术

骨组织是一种兼具稳态和动态平衡特点的结缔组织，为了保持其结构的完整性，维持体内矿物质平衡，骨组织会不断地进行塑造、成形和修复这一系列的重建过程。小鼠成年后，骨代谢主要是调节骨结构和功能的动态过程。骨代谢是一个涉及破骨细胞和成骨细胞这两类关键细胞相互转化的复杂、严格的调控过程。破骨细胞是主管骨吸收功能的细胞，在骨骼的形成和骨密度的调中发挥了重要作用。骨代谢过程中的平衡无论是偏向成骨细胞还是破骨细胞，都可能引起如：骨量减少、骨质疏松和骨硬化病等临床疾病。

破骨细胞起源于骨髓中造血干细胞，是一种高度分化的多核巨细胞，主要位于哈佛系统内的骨内膜表面和骨膜下表面。平均1mm3的骨表面上一般分布2～3个破骨细胞。破骨细胞活化是骨吸收的前提，移行和吸收是破骨细胞进行骨吸收的两种状态，即破骨细胞通过从骨髓向矿化骨表面移行并黏附，然后形成吸收区域开始骨吸收。

因此，涉及骨代谢相关研究都以破骨细胞的获取作为前提，但破骨细胞在组织内含量较少，体外培养破骨细胞成为了大多数实验室的选择。单核巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，其可以通过激活、融合形成多核巨细胞，即破骨细胞。

但是，现有技术提取骨髓细胞的技术操作繁琐，步骤复杂，须在每次开始实验前处死小鼠并重新提取骨髓源性巨噬细胞。且骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的技术受适龄小鼠限制，如无适龄期小鼠则会延滞实验进程。且每次实验所需骨髓源性巨噬细胞的细胞数量远远少于提取细胞数量，差距过大，且多余细胞会直接丢弃，造成浪费。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞存在每次实验提取骨髓源性巨噬细胞时均会处死小鼠，且对小鼠的年龄要求高，提取的骨髓源性巨噬细胞过多，造成浪费的问题，提供一种利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法，该诱导方法是将冻存的小鼠骨髓源性巨噬细胞进行复苏，然后诱导为破骨细胞，该方法不需要每次实验都去处死小鼠，可随时取用，不受小鼠年龄和数量的限制，可在满足实验所需细胞数量的基础上保留更多的细胞，有效减少了对活体小鼠的需求量，降低了成本，便于推广应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1、冻存骨髓源性巨噬细胞，备用；

步骤2、将装有骨髓源性巨噬细胞的冻存管放入35℃～39℃的水浴锅中振荡解冻；

步骤3、在离心管中加入培养基，将解冻完成的骨髓源性巨噬细胞转移至离心管内，进行离心处理；

步骤4、离心处理后，去除上清液，加入培养基进行重悬，吹打混匀；细胞计数后根据实验需求铺板，然后用含M-CSF的完全培养基培养36-48h待细胞贴壁；然后换液用含有M-CSF和的RANKL的完全培养基，至少4天后，即可诱导出成熟的破骨细胞。

本申请提供的利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法，是将小鼠骨髓源性巨噬细胞进行冻存，制备破骨细胞时，即将冻存的细胞进行解冻，然后进行离心处理后，进行培养基重悬，之后在完全培养基中进行培养，至少4天后即可诱导出成熟的破骨细胞。该方法不需要每次实验都去处死小鼠，可随时取用，不受小鼠年龄和数量的限制，可在满足实验所需细胞数量的基础上保留更多的细胞，有效减少了对活体小鼠的需求量，降低了成本，便于推广应用。

进一步的，所述步骤1中，骨髓源性巨噬细胞是由以下方法进行冻存的：

步骤11、收集小鼠骨髓源性巨噬细胞，然后在培养皿中用含M-CSF的完全培养基培养重悬培养至少16h；

步骤12、收集含悬浮细胞的培养基上清液，离心，加入无血清冻存液重悬；

步骤13、将步骤12得到的重悬细胞液分装入细胞冻存管中，程序降温后，放入液氮中进行冻存。

进一步的，所述步骤11中，在培养皿中培养16h～24h。

进一步的，所述步骤11中，小鼠骨髓源性巨噬细胞采用以下方法收集得到的：

步骤111、将小鼠进行预处理，取小鼠股骨、胫骨和肱骨，除去肌肉组织，剪去长骨两头；用无菌注射器吸取α-MEM基础培养基或无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变为白色；

步骤112、用无菌滤网过滤冲洗液并收集冲洗液于离心管中，离心处理；弃上清液，加入红细胞裂解液，冰上裂解处理；加入含胎牛血清的α-MEM培养基终止裂解，再次离心处理，弃上清液，用含有M-CSF和胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬，得到小鼠骨髓源性巨噬细胞。

进一步的，所述步骤111中，对小鼠进行预处理的方法为：3-6周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，使用酒精浸泡灭菌处理；然后转移至超净台等待下一步操作。

进一步的，所述步骤13中，每个细胞冻存管中细胞浓度为500-1000万个/ml。

进一步的，所述步骤3中，在1100～1500r/min下离心3～8min。

进一步的，所述步骤4中，完全培养基中，M-CSF的浓度为25-40ng/ml；RANKL的浓度为90-110ng/ml。

进一步的，所述步骤4中，4-6天后诱导出成熟的破骨细胞。

本发明的另一目的是为了提供上述诱导方法的应用。

如上述的小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法在诱导或检测破骨细胞中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本申请提供的利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法，是将小鼠骨髓源性巨噬细胞进行冻存，制备破骨细胞时，即将冻存的细胞进行解冻，然后进行离心处理后，进行培养基重悬，之后在完全培养基中进行培养，至少4天后即可诱导出成熟的破骨细胞。该方法不需要每次实验都去处死小鼠，可随时取用，不受小鼠年龄和数量的限制，可在满足实验所需细胞数量的基础上保留更多的细胞，有效减少了对活体小鼠的需求量，降低了成本，便于推广应用。

附图说明

图1为实施例1小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞TPAP染色后显微镜图。

图2为实施例2小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞TPAP染色后显微镜图。

图3为实施例3小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞TPAP染色后显微镜图。

图4为对比例1小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞TPAP染色后显微镜图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞

步骤1、冻存骨髓源性巨噬细胞，备用；

骨髓源性巨噬细胞是由以下方法进行冻存的：

步骤11、收集小鼠骨髓源性巨噬细胞，然后在培养皿中用含10ng/ml M-CSF的完全培养基培养重悬培养16h。

其中，小鼠骨髓源性巨噬细胞采用以下方法收集得到的：

步骤111、3-6周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，使用酒精浸泡灭菌处理；然后转移至超净台等待下一步操作；

取小鼠股骨、胫骨和肱骨，除去肌肉组织，剪去长骨两头；用无菌注射器吸取α-MEM基础培养基或无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变为白色；

步骤112、用无菌滤网过滤冲洗液并收集冲洗液于离心管中，离心处理；弃上清液，加入红细胞裂解液，冰上裂解处理；加入含胎牛血清的α-MEM培养基终止裂解，再次离心处理，弃上清液，用含有M-CSF和胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬，得到小鼠骨髓源性巨噬细胞。

步骤12、收集含悬浮细胞的培养基上清液，离心，加入无血清冻存液重悬；

步骤13、将步骤12得到的重悬细胞液分装入细胞冻存管中，程序降温后，放入液氮中进行冻存，每个细胞冻存管中细胞浓度为500万个/ml。

步骤2、将装有骨髓源性巨噬细胞的冻存管放入35℃的水浴锅中振荡解冻；

步骤3、在离心管中加入培养基，将解冻完成的骨髓源性巨噬细胞转移至离心管内，进行离心处理，在1500r/min下离心3min。

步骤4、离心处理后，去除上清液，加入培养基进行重悬，吹打混匀；细胞计数后根据实验需求铺板，然后用含M-CSF的完全培养基培养36-48h待细胞贴壁；然后换液用含有25ng/ml的M-CSF和90ng/ml的RANKL的完全培养基，4-6天后，即可诱导出成熟的破骨细胞。如图1所示。

实施例2

利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞

步骤1、冻存骨髓源性巨噬细胞，备用；

骨髓源性巨噬细胞是由以下方法进行冻存的：

步骤11、收集小鼠骨髓源性巨噬细胞，然后在培养皿中用含10ng/ml M-CSF的完全培养基培养重悬培养24h。

其中，小鼠骨髓源性巨噬细胞采用以下方法收集得到的：

步骤111、3-6周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，使用酒精浸泡灭菌处理；然后转移至超净台等待下一步操作；

取小鼠股骨、胫骨和肱骨，除去肌肉组织，剪去长骨两头；用无菌注射器吸取α-MEM基础培养基或无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变为白色；

步骤112、用无菌滤网过滤冲洗液并收集冲洗液于离心管中，离心处理；弃上清液，加入红细胞裂解液，冰上裂解处理；加入含胎牛血清的α-MEM培养基终止裂解，再次离心处理，弃上清液，用含有M-CSF和胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬，得到小鼠骨髓源性巨噬细胞。

步骤12、收集含悬浮细胞的培养基上清液，离心，加入无血清冻存液重悬；

步骤13、将步骤12得到的重悬细胞液分装入细胞冻存管中，程序降温后，放入液氮中进行冻存，每个细胞冻存管中细胞浓度为1000万个/ml。

步骤2、将装有骨髓源性巨噬细胞的冻存管放入36℃的水浴锅中振荡解冻；

步骤3、在离心管中加入培养基，将解冻完成的骨髓源性巨噬细胞转移至离心管内，进行离心处理，在1200r/min下离心5min。

步骤4、离心处理后，去除上清液，加入培养基进行重悬，吹打混匀；细胞计数后根据实验需求铺板，然后用含M-CSF的完全培养基培养36-48h待细胞贴壁；然后换液用含有40ng/ml的M-CSF和110ng/ml的RANKL的完全培养基，4-6天后，即可诱导出成熟的破骨细胞。如图2所示。

实施例3

利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞

步骤1、冻存骨髓源性巨噬细胞，备用；

骨髓源性巨噬细胞是由以下方法进行冻存的：

步骤11、收集小鼠骨髓源性巨噬细胞，然后在培养皿中用含10ng/ml M-CSF的完全培养基培养重悬培养20h。

其中，小鼠骨髓源性巨噬细胞采用以下方法收集得到的：

步骤111、3-6周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，使用酒精浸泡灭菌处理；然后转移至超净台等待下一步操作；

取小鼠股骨、胫骨和肱骨，除去肌肉组织，剪去长骨两头；用无菌注射器吸取α-MEM基础培养基或无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变为白色；

步骤112、用无菌滤网过滤冲洗液并收集冲洗液于离心管中，离心处理；弃上清液，加入红细胞裂解液，冰上裂解处理；加入含胎牛血清的α-MEM培养基终止裂解，再次离心处理，弃上清液，用含有M-CSF和胎牛血清的α-MEM完全培养基重悬，得到小鼠骨髓源性巨噬细胞。

步骤12、收集含悬浮细胞的培养基上清液，离心，加入无血清冻存液重悬；

步骤13、将步骤12得到的重悬细胞液分装入细胞冻存管中，程序降温后，放入液氮中进行冻存，每个细胞冻存管中细胞浓度为800万个/ml。

步骤2、将装有骨髓源性巨噬细胞的冻存管放入39℃的水浴锅中振荡解冻；

步骤3、在离心管中加入培养基，将解冻完成的骨髓源性巨噬细胞转移至离心管内，进行离心处理，在1100r/min下离心3min。

步骤4、离心处理后，去除上清液，加入培养基进行重悬，吹打混匀；细胞计数后根据实验需求铺板，然后用含M-CSF的完全培养基培养36-48h待细胞贴壁；然后换液用含有30ng/ml的M-CSF和100ng/ml的RANKL的完全培养基，4-6天后，即可诱导出成熟的破骨细胞。如图3所示。

对比例1

4-6周龄C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡灭菌5-10分钟；转移至超净台内操作。取小鼠股骨、胫骨和肱骨，尽可能的取出肌肉组织。有无菌眼科剪剪去长骨两头。用5ml无菌注射器吸取α-MEM基础培养基或无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变为白色。用70μm的无菌滤网过滤冲洗液并收集冲洗液于15ml离心管中，离心机1200r/min，离心5分钟；弃上清液，加入2-3ml红细胞裂解液，冰上裂解5分钟；加入裂解液2倍体积的含10％胎牛血清的α-MEM培养基终止裂解，离心机1200r/min，离心5分钟，弃上清液，用含10％胎牛血清(FBS)的α-MEM完全培养基重悬后种于培养皿中，放入CO2浓度5％的37℃细胞培养箱过夜(约16小时)。收集上清，离心机1200r/min，离心5分钟，弃上清液，用6ml含有30ng/ml M-CSF的完全培养基重悬后，接种于25cm2培养瓶中。2天后贴壁细胞即为BMMs。弃上清液，用无菌PBS清洗2次。用细胞刮刀刮下贴壁细胞、反复吹打后收集含细胞悬液，离心机1200r/min，离心5分钟，弃上清液。

重悬后根据实验需要，细胞计数后选择合适细胞密度接种于不同细胞培养皿中。加入含有30ng/ml的M-CSF和100ng/ml的RANKL的完全培养基，4-6天后即可诱导出成熟的破骨细胞。如图4所示。

1.现有提取骨髓细胞的技术操作繁琐，步骤复杂，须在每次开始实验前处死小鼠并重新提取骨髓源性巨噬细胞。

2.现有提取骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的技术受适龄小鼠限制，如无适龄期小鼠则会延滞实验进程。

3.现有提取骨髓源性巨噬细胞的技术中，每次实验所需细胞数量远远少于提取细胞数量差距过大，且多余细胞会直接丢弃，造成浪费。

本申请提供的利用小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导为破骨细胞的方法，是将小鼠骨髓源性巨噬细胞进行冻存，制备破骨细胞时，即将冻存的细胞进行解冻，然后进行离心处理后，进行培养基重悬，之后在完全培养基中进行培养，至少4天后即可诱导出成熟的破骨细胞。该方法不需要每次实验都去处死小鼠，可随时取用，不受小鼠年龄和数量的限制，可在满足实验所需细胞数量的基础上保留更多的细胞，有效减少了对活体小鼠的需求量，降低了成本，便于推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。