一种转基因动物的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转基因动物的构建方法，本发明是申请号为2023112728678，发明名称为一种基于免疫激活特定启动子诱导B细胞自发永生化的方法的分案申请。

背景技术

杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术：将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，可以得到既能产生抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，利用杂交瘤细胞可以大量的生产单克隆抗体。单克隆抗体由单一B淋巴细胞分泌得到，但B淋巴细胞在体外不能长期存活(最多两周)，因此无法制备单一B淋巴细胞群，也无法进行单抗的大量生产。骨髓瘤细胞不具备分泌抗体的能力，但是可以在体外培养条件下无限繁殖。将免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，得到的杂交细胞具有双亲细胞的遗传特性，既能像B淋巴细胞一样分泌抗体，又能像骨髓瘤细胞一样无限增殖，成功克服了B淋巴细胞在体外存活周期短的问题。对杂交瘤细胞进行培养，即可得到单克隆抗体。

细胞融合技术是杂交瘤技术的基础，通过聚乙二醇(PEG)(最常用)、仙台病毒、电转等方法对细胞进行人工诱导，可使两个细胞通过膜融合形成单个细胞。

HAT培养基筛选技术是杂交瘤技术中另一个关键的技术，在B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，会产生多种融合结果(未融合的骨髓瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、B淋巴细胞自身融合细胞、骨髓瘤细胞自身融合细胞、正确融合的杂交瘤细胞)，为了得到所需的杂交瘤细胞，必须利用HAT培养基对融合后的细胞进行筛选。HAT培养基的筛选原理为：DNA合成途径有生物合成途径与应急合成途径两种，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)等物质，氨基喋呤可以对DNA的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在HAT培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于HAT培养基中培养，其他的融合结果会全部死亡，最终筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具备抗体分泌功能、能够保持细胞永生性。

杂交瘤技术的优点是：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。杂交瘤技术的缺点是：a.操作步骤繁琐，有效融合的比例不高，抗体的序列非常有限；b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆细胞抗体序列高度同源。

EB病毒(EBV)是一种常见的人类疱疹病毒，是双链脱氧核糖核酸病毒(dsDNA病毒)；其主要感染B淋巴细胞，但也可感染上皮细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞。被EBV感染的B细胞会出现永生化和大量扩增的特征。被EBV感染的B细胞或者是表达EBV病毒特定的蛋白，并诱导B细胞出现永生化和大量扩增的特征。从而突破了原来B细胞无法体外培养和扩增的限制。现有技术使用的野生型动物包括兔子、小鼠、大鼠等，主要是昆明鼠。整个抗体的序列获得的过程周期漫长，而且获得的抗体的序列版本非常有限，主要集中在1～5个不同序列，而且高度同源，由于免疫的过程中其他亲和力弱的克隆都没有在脾脏内获得增殖优势。其次是由于通过杂交瘤技术，其中脾细胞和骨髓瘤细胞的融合效率低，导致抗体序列更少，同时操作周期长。EBV病毒表达的效应蛋白对于小鼠都是有致死效应的，因而不能设计成组成型表达。

B细胞的发育过程涉及多种基因的调控的过程，很多特异性的启动子驱动相关基因的表达，使得B细胞发育成为一个能够稳定表达抗体的成熟细胞(浆细胞)，EBV病毒基因组中的各个特殊基因片段的功能与病毒感染不同的物种，不同的细胞的类型发生着不同变化，是复杂的病毒学研究领域知识和内容；通过动物免疫激活的B细胞，再通过与骨髓瘤细胞融合获得“杂交瘤细胞”的方法产生抗体是目前主流的获得抗体表达B细胞的方法，是抗体生物工程内容，而且由于EBV病毒的表达蛋白对很多动物模型都有毒性，会导致动物死亡，这是目前的研究热点也是难点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用成熟B细胞特异的启动子(主要是保证与抗体表达同步的启动子)驱动“方向与启动子相反”的表达EBV病毒特异蛋白的表达框，也就是一种重组表达载体(组成型EBV病毒蛋白对动物有致死作用)。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种通过该表达载体表达得到的蛋白能够诱导B细胞自发转化为B细胞瘤的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种转基因小鼠的构建方法，通过构建特定的载体再构建转基因动物模型。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种基于免疫激活特定启动子诱导动物模型特定的B细胞自发永生化的方法，可以绕开杂交瘤技术，直接提高效率，大幅提升获得的抗体序列数量。

技术方案：为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种表达框，所述表达框包括含有特定启动子以及与其表达方向相反的编码组成型EBV病毒蛋白的基因。

其中，所述特定启动子包括但不仅限于B细胞特异性启动子和浆细胞特异性启动子，其他能够启动组成型EBV病毒蛋白进行表达的启动子也可以用于本发明。其中，所述组成型EBV病毒蛋白包括LMP1蛋白和LMP2A蛋白。

本发明还包括一种重组载体，所述重组载体包括所述的表达框。其中，所述重组载体包括在骨架载体上依次插入ProA-CreERT2基因片段、cdsA-IRES-cdsB-TK基因片段和ProB基因片段。其中，所述重组载体还包括SDA(Self-deletion anchor)位点和LoxP位点。其中，所述骨架载体可以为任意能够作为骨架的载体，作为优选地，所述骨架载体为pDonor[Gateway]-DTA-hFOXG1LA:EGFP:SV40 pA:FRT Puro FRT:hFOXG1 RA。其中，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还包括所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：将骨架载体依次插入ProA-CreERT2基因片段、cdsA-IRES-cdsB-TK基因片段和ProB基因片段即得。

本发明还包括一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的表达框或所述的重组载体。

本发明还包括所述的表达框、所述的重组载体或所述的重组细胞在构建转基因动物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种转基因动物的构建方法，包括以下步骤：

1)将含有表达对动物致死作用的蛋白表达框反向导入ES细胞中得到基因倒位表达的细胞；

2)将基因倒位表达的细胞注射到动物囊胚腔中得到含目的表达框的囊胚；

3)将步骤2)得到的囊胚移植到雌性动物体内，出生后得到转基因动物。

其中，步骤1)中所述对动物有致死作用的蛋白包括但不仅限于组成型EBV病毒蛋白，其他对动物有致死作用的蛋白也适应于本发明。

其中，步骤1)中所述组成型EBV病毒蛋白包括LMP1蛋白和LMP2A蛋白。

其中，编码所述LMP1蛋白的基因为cdsA，编码所述LMP2A蛋白基因为cdsB。

其中，所述表达框还包括B细胞特异性启动子和浆细胞特异性启动子。

其中，所述B细胞特异性启动子包括ProA启动子，所述浆细胞特异性启动子包括ProB启动子。

其中，所述含有表达对动物致死作用的蛋白表达框包括在骨架载体上依次插入ProA-CreERT2基因片段、cdsA-IRES-cdsB-TK基因片段和ProB基因片段。

其中，所述骨架载体为pDonor[Gateway]-DTA-hFOXG1 LA:EGFP:SV40 pA:FRTPuro FRT:hFOXG1 RA。

其中，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明内容还包括所述的转基因动物的构建方法在用于制备永生化细胞中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种基于激活动物体内特定启动子诱导B细胞自发永生化得到永生化B细胞的方法，包括以下步骤：

1)用他莫昔芬诱导转基因动物，得到在特定B细胞中正向表达组成型EBV病毒蛋白的转基因动物，所述转基因动物包括含有特定启动子以及与其表达方向相反的编码组成型EBV病毒蛋白的基因的表达框；

2)将步骤1)得到的动物的脾脏或外周血中分离所得的细胞采用B细胞扩增培养基培养后收集细胞悬液；

3)将细胞悬液离心后收集底部细胞，加入含有TK基因底物的B细胞扩增培养基进行筛选培养；

4)将细胞悬液离心分离收集底部细胞，用RPMI1640完全培养基培养筛选后的细胞，获得永生化B细胞。

其中，所述组成型EBV病毒蛋白包括LMP1蛋白和LMP2A蛋白。

其中，进一步地，编码所述LMP1蛋白的基因为cdsA，编码所述LMP2A蛋白基因为cdsB。

其中，进一步地，所述含有特定启动子以及与其表达方向相反的编码组成型EBV病毒蛋白的基因的表达框为含有cdsA-IRES-cdsB基因片段的表达框。

其中，步骤1)中所述特定启动子包括B细胞特异性启动子和浆细胞特异性启动子。

其中，所述B细胞特异性启动子包括ProA启动子，所述浆细胞特异性启动子包括ProB启动子。其中，步骤1)中所述表达框包括在骨架载体上依次插入ProA-CreERT2基因片段、cdsA-IRES-cdsB-TK基因片段和ProB基因片段。其中，作为优选地，所述骨架载体为pDonor[Gateway]-DTA-hFOXG1 LA:EGFP:SV40 pA:FRT Puro FRT:hFOXG1 RA。

其中，作为优选地，所述表达框即为前文提到的重组载体，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

具体的，当所述转基因动物为转基因小鼠，具体的方法如下：

1)用他莫昔芬诱导所述转基因小鼠，使转基因小鼠体内特定B细胞中的Cre蛋白酶发生作用，使cdsA-IRES-cdsB恢复正向表达框，启动cdsA-IRES-cdsB基因表达；所述转基因小鼠包括含有ProA-CreERT2基因片段，cdsA-IRES-cdsB-TK和ProB核心元件的表达框；cdsA-IRES-cdsB基因片段在ProB的调控下，仅在成熟浆细胞中表达，并激活该细胞的体内永生化过程；cdsA-IRES-cdsB的组成型基因表达对小鼠是致死的，但是本发明构建的特定启动子方向与cdsA-IRES-cdsB的组成型基因的表达方向相反的重组载体可在动物体内实现所述cdsA-IRES-cdsB基因的重组蛋白的精准定时(浆细胞成熟过程中表达)定位(B细胞内表达)表达，从而构建出不致死的动物模型；

2)将小鼠脾脏中分离所得的细胞采用B细胞扩增培养基培养后收集细胞悬液，加入含有TK基因底物的B细胞扩增培养基进行筛选培养，最后用RPMI1640完全培养基培养筛选后的细胞，即可获得永生化的可产生抗体的B细胞。

其中，所述ProA-CreERT2基因片段位于SEQ ID NO.1基因序列的第19640-25842位碱基，所述cdsA-IRES-cdsB-TK基因片段位于SEQ ID NO.1基因序列的第29851-34917位碱基，所述ProB基因位于SEQ ID NO.1基因序列的第35048-36580位碱基。

以上经所述方法获得的永生化B细胞，突破了B细胞无法进行体外培养和扩增的限制。

本发明内容还包括一种永生化B细胞，其由所述的方法培养得到。

最后一方面，本发明还提供了一种利用体外培养的永生化B细胞进行抗体药物筛选的方法，包括以下步骤：

1)将所述的永生化B细胞经RPMI1640完全培养基培养，得到B细胞克隆团；

2)挑取B细胞克隆团进行单克隆化，加入RPMI1640完全培养基进行培养，得到表达抗体的上清；

3)收集B细胞上清液，将B细胞培养液的上清液运用Elisa检测法进行检测筛选，得到抗原特异性抗体。

本发明的原理：本发明采用ProA启动子驱动CreERT2在B细胞特异性表达，在他莫西芬诱导下，CreERT2将cdsA和cdsB等元件翻转，使得cdsA和cdsB在ProB启动子的驱动下在成熟浆细胞中表达，未特异性表达cdsA和cdsB的B细胞则可以通过tk负筛去除。本发明的EBV病毒与B细胞内源性特异性启动子的结合，通过特定的药物诱导表达，诱导基因倒置发生相关功能的一系列复杂的设计才实现了该细胞的再生和稳定表达。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明通过转基因动物模型，利用EBV病毒基因诱导能够被抗原激活的产生抗体成熟B细胞直接发生永生化，并实现体外扩增，可以绕开杂交瘤技术，缩短了整个获得抗体的周期，大幅提升了工作效率。而且本发明通过特定的载体设计，使得只有在成熟的B细胞内才表达特定对动物有毒性的功能蛋白，也可以开发作为后续重点的抗体发现动物模型开启一个重要的基础。

附图说明

图1为杂交瘤制备单克隆抗体流程；

图2为本发明载体的构建过程；

图3为激活后B细胞的成熟过程，不同的发育阶段由不同的转录因子调控；

图4为本发明中转基因小鼠体内永生化B细胞的产生过程；

图5为载体骨架示意图；

图6为制备完成的载体包含3个核心元件：ProA-CreERT2基因片段，TK-cdsA-IRES-cdsB(反向)，Pro-B；

图7为ES细胞鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

图8为囊胚注射流程图；

图9为转基因小鼠鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

图10为构建的转基因小鼠脾脏中T/B细胞比例。左图：诱导前；右图：诱导后；

图11为诱导后，B细胞永生化引起T细胞增殖；

图12为构建的转基因小鼠B细胞体外培养情况；

图13为构建的转基因小鼠经抗原免疫后，血清中产生了特异性抗体；

图14为经抗原免疫后的转基因小鼠B细胞体外培养情况；B细胞克隆团培养情况(左上：第6天，100×；右上：第6天，200×；左下：第9天，100×；右下：第9天，200×)；

图15为经Elisa法检测的抗原抗体结合情况。

具体实施方式

本发明涉及的术语：

抗体与抗原：抗体(英语：antibody)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。

B细胞(英语：B cell，B lymphocyte)是白细胞中一种淋巴细胞的亚型，B细胞属于后天免疫系统的体液免疫，作用为分泌抗体。

浆细胞(plasma cell，PC)又称抗体分泌细胞(antibody secreting cell)。成熟B细胞接受抗原刺激后，成为活化B细胞，进而分化为浆细胞，合成和分泌各类免疫球蛋白IgG(又称为抗体)。

杂交瘤技术：是用于产生大量相同抗体的方法。这个过程开始于给小鼠注射引发免疫反应的抗原。一种白细胞，B细胞，产生与注射抗原结合的抗体。然后从小鼠中收获这些产生抗体的B细胞，然后将其与永生的B细胞癌细胞(骨髓瘤)融合，以产生称为杂交瘤的杂交细胞系，其具有B细胞的抗体产生能力。

启动子序列(英语：promoter)，启动子是指一段能使特定基因进行转录的DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认,并开始转录合成RNA。本专利中启动子简称为Pro。

特异性启动子：只在特定的器官(或组织、或者细胞类型)中才能启动基因的表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的问题，包括基因毒性等，实现很多原来实现不了转基因的效果。在本发明中，B细胞特异性启动子CD19简称为ProA，浆细胞特异性启动子OCA-B简称为ProB。

Cre重组酶/Cre-LoxP：Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme)由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。LoxP(locus of X-overP1)位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向,可以实现片段的删除、插入、转座和倒位等功能。

CreERT2重组酶：CreERT2编码Cre重组酶(Cre)与突变的雌激素配体结合结构域(ERT2)融合蛋白，该结构域需要在他莫昔芬(Tamoxifen)存在才能发挥Cre重组酶活性。

SDA(Self-deletion anchor)位点：Rox位点。Dre重组酶/Rox系统是从噬菌体中发现的一种酪氨酸重组酶，其识别的是32bp的DNA序列rox，包含两个14bp反向回文序列和4bp的中间间隔序列。Dre重组酶和Cre重组酶在功能上具有相似性，但两者的识别位点具有特异性，Dre重组酶不能识别loxp位点，同时Cre重组酶也不能识别rox位点。

表达框：含有一个或多个基因的编码序列，并包含多个调控目标基因表达的调控元件，一般包括启动子、外源基因序列、终止子，并且按照固定的方向排列。如果排列顺序倒位则无法发挥功能，正常表达出目的基因。

Tamoxifen他莫昔芬：化学名称为(Z)-2-[4-(1,2-二苯基-1-丁烯)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，是一种有机化合物，分子式为C26H29NO，临床上用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌。他莫昔芬可阻断雌激素的作用，雌激素是一种生殖激素，会影响许多乳腺癌的生长和发育。

转基因动物：转基因动物指用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物。转基因小鼠是用人工方法将外源序列导入或整合到小鼠基因组内，并实现原先设计的外源序列的功能性。

基因定点敲入：基因敲入(gene knock in)是一种将外源功能基因序列，整合或替换到基因组特定位点，并在获得稳定表达的技术。

抗原免疫动物：用靶抗原免疫动物，通常是小鼠或大鼠，利用抗原刺激，被免疫动物产生特定的B细胞，并产生特定的抗体。这是生产单克隆抗体(mAb)早期最普遍、唯一技术上可行的方法，即用动物脾细胞取得候选B细胞，用于产生对靶标具有特异性的治疗性mAb。莫罗单抗-CD3(Orthoclone OKT3)便是这样得到的。

CDS是编码序列(Coding sequence)的缩写。DNA转录成mRNA，mRNA经剪接等加工后翻译出蛋白质，CDS就是与蛋白质序列一一对应的DNA序列。

EBV病毒：EB病毒(EBV)是一种常见的人类疱疹病毒，是双链脱氧核糖核酸病毒(dsDNA病毒)；其主要感染B淋巴细胞，但也可感染上皮细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞。被EBV感染的B细胞会出现永生化和大量扩增的特征。

EBV病毒表达的效应蛋白LMP1和LMP2A对于小鼠都是有致死效应的，故不能设计成组成型表达，需要将其设计为倒位序列，并在ProA和ProB的调控下发挥功能。编码LMP1蛋白的序列简称为cdsA，编码LMP2A蛋白的序列简称为cdsB。

B细胞瘤(B细胞永生化)：被EBV感染的B细胞或者是表达EBV病毒特定的蛋白，并诱导B细胞出现永生化和大量扩增的特征。从而突破了原来B细胞无法体外培养和扩增的限制。

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1构建打靶载体

打靶载体委托云舟生物制备，载体信息如下：

骨架载体，pDonor[Gateway]-DTA-hFOXG1 LA:EGFP:SV40 pA:FRT Puro FRT:hFOXG1 RA，购买于云舟生物科技(广州)股份有限公司，

制备完成的重组载体命名为：Rosa26:[proA/CreERT2/polyA]

SEQ ID NO.1：

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实施例2构建转基因动物

一、ES细胞打靶

将目的载体片段通过基因打靶的方式，构建携带该基因片段的ES细胞株，并通过自删除原件SDA(self deletion anchor)删除neo抗性片段，得到cdsA-IRES-cdsB倒位的ES细胞。

1、试剂、仪器

PBS(0.01M，pH7.4)：Solarbio，P1010；DMEM培养基：Gibco，12430047；

FBS：Gibco，26010066；M16培养基：Sigma，M7292；胰蛋白酶：Sigma T4799；DMSO：Solarbio，D8372；细胞冻存液：10％DMSO+90％FBS；电转仪，Neon

2、具体制备方法

2.1细胞准备

2.1.1滋养层细胞制备：将5只授精13.5天的雌鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，C57BL/6，品系代码213)安乐处置，剖开腹腔，取出子宫，将胚胎从子宫中剥膜取出，剪去胚胎的头和内部器官，留躯干部放入培养皿中用PBS冲洗。将躯干部胚胎组织剪碎并研磨成糊状，加入5mL PBS混匀，移入15mL离心管，自然沉降3分钟后吸取上清弃掉。加入3mL0.125％胰蛋白酶，混匀，室温下消化3分钟，收集上清至15mL离心管中，重复该步骤2～3次，直至组织完全消化。将收集好的细胞悬液，500g离心5分钟，弃上清，加入培养基(DMEM+10％FBS)中，调整细胞浓度至1×10

2.1.2ES细胞制备：将10只授精3.5天的雌鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，C57BL/6，品系代码213)安乐处置，剖开腹腔，将卵巢取出置于培养皿中(注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染)，在解剖镜下用镊子划开输卵管，收集发育良好的囊胚，置于滋养层细胞上(如上所述)培养，48小时后透明带自行脱落，内细胞群逐渐孵出。4～5天后挑取内细胞群，使之与滋养层细胞分离，置于消化液滴内(0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA)3～5分钟，期间轻轻吹吸混匀，直至内细胞群消化成单细胞，500g离心5分钟，弃上清，经培养基(DMEM+10％ FBS)重悬后，再接种于新的滋养层细胞板中，于37℃，5％ CO

按此方法传代3～5代后，按照1×10

2.1.3囊胚细胞制备：将10只授精2天的雌鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，C57BL/6，品系代码213)安乐处置，剖开腹腔，将卵巢取出置于培养皿中(注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染)，在解剖镜下用镊子划开输卵管，收集发育良好的囊胚。将囊胚细胞置于M16培养基中，37℃，5％ CO

2.2ES细胞电转

载体1：Rosa26:[proA/CreERT2/polyA]

载体2：Dre载体(购买于云舟生物科技(广州)股份有限公司，载体ID：VB900138-0634smk)

(https://www.vectorbuilder.cn/？sdclkid＝A5fs152_xrDibLgpALol&bd_vid＝11024794212114097530)

将上述制备好的ES细胞从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中融化，移入15mL离心管中，加入8mL培养基，1000rpm离心5分钟，弃上清，用5mL培养基重悬细胞，接种到6cm细胞培养皿中，每天更换新鲜培养基，待其长到80％，用于基因打靶。

电转：收集细胞，加入预冷(4℃)的电转缓冲液，调整细胞密度至3×10

按照以上体系，电转参数为1400V，20ms，1pulse，进行电转。电转完毕后将细胞稀释并均匀接到铺有滋养层细胞的96孔板中培养。48小时后进行药筛、传代，培养1周后，进行鉴定(如下)。

2.3ES细胞鉴定

引物信息(引物由金唯智生物科技有限公司提供)：

反应体系：

注：置于冰盒中操作

反应程序：

注：2-4步骤循环35次

鉴定结果判定，根据图7所示，扩增条带223bp的样本为阳性样本。

二、转基因动物制备

1、ES克隆进行囊胚注射：

囊胚准备：显微镜下挑选形态良好的囊胚，并转移至注射皿内。参见图8，囊胚均匀排列，密度适中(30～50个/皿)，每次进行注射的时间不超过30分钟，保证囊胚活性。

缓慢推动显微注射仪，将注射针内的ES细胞推到囊胚腔中的胚胎卵裂球之间，每个胚胎注射6～8个ES细胞。注射完毕后，将培养皿放入37℃，5％ CO

2、胚胎移植；

将需移植的胚胎吸入移植管，20个/管，备用。

体视镜下观察代孕雌鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，ICR，品系代码201)输卵管壶腹部状况，找到输卵管开口(伞部)，调整好小鼠及输卵管的位置，避开血管，撕开卵巢囊(输卵管和卵巢周围的一层有血管分布的透明的膜)。用显微移植镊通过撕口将输卵管开口拉出卵巢囊。左手用显微移植镊提起输卵管伞部开口，右手将已吸取胚胎的移植玻璃管插入到伞部开口中，调整移植管针头的位置，并用移植镊轻轻夹住输卵管与移植针的连接处，轻吹将胚胎送入壶腹部。若在壶腹部内看到2个气泡则说明移植成功。

缝合并用加热器给小鼠保温待其完全清醒后转移到饲养间。

3、获得转基因小鼠

小鼠经过18±1天妊娠后，产下F0小鼠。2周后，剪取鼠尾进行PCR鉴定，筛选转基因阳性小鼠。并将小鼠传代，获得目的基因纯合子小鼠，饲养至5～7周，进行后续实验。

引物信息(引物由金唯智生物科技有限公司提供)：

反应体系：

注：置于冰盒中操作

反应程序：

注：2-4步骤循环35次

鉴定结果判定，根据图9所示，cdsA的扩增条带为493bp，cdsB的扩增条带为～350bp，双阳性样本为阳性小鼠。

实施例3他莫昔芬诱导转基因鼠、B细胞分离与体外筛选

1、他莫昔芬注射

他莫昔芬可激活CreERT2活性，并将目的基因片段(cdsA和cdsB)倒位，参见图2，使得表达框恢复正向，启动目的基因在成熟浆细胞中的表达，以此来诱导特定的B细胞发生自发永生化。

试剂：Tamoxifen(Sigma，T-5648)、无水乙醇、葵花籽油(Cornoil，Sigma，C8276)；

配置：称取50mg Tamoxifen，置于无水乙醇中，55℃助溶，约1小时；待完全溶解后加入9.5ml葵花籽油，翻转仪上混匀约30min；适量分装储存于-80℃避光保存。

给药方式：腹腔注射，Tamoxifen注射量为100mg/Kg，连续给药7天，从而获得特定B细胞永生化的小鼠模型。(为保证Cre工作效率，停药7～10天后进行实验。)

2、动物解剖、制备小鼠脾脏单细胞悬液

取经他莫昔芬诱导后的B细胞永生化小鼠的脾脏，制备单细胞悬液。在小鼠体内，B细胞永生化会引起T细胞的活化，活化的T细胞杀伤细胞会攻击B细胞母细胞。通过检测他莫昔芬诱导前后的B细胞/T细胞变化情况，则能判定B细胞永生化小鼠是否构建成功。

动物解剖：脱颈法迅速处死小鼠，用75％酒精喷洒体表消毒，剪开皮肤及腹膜，取出脾脏，置于含有2％FBS的DMEM培养基中。

小鼠脾脏单细胞悬液制备：

使用研磨棒和筛网研磨湿润的(PBS润洗)脾脏，释放出脾脏组织中细胞，随后将研磨液移至15ml离心管中。将脾脏细胞研磨液以350g在4℃离心5分钟，离心后弃上清。

在离心结束后收集到的细胞中加入3ml 1X红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，重悬细胞，冰上孵育5分钟。

向离心管中加入10mL PBS以终止红细胞裂解，350g，4℃，离心5分钟，弃上清。

用B细胞培养基【ImmunoCult

流式检测-抗体孵育：

试剂：流式抗体CD3(clone：17A2，biolegend，100203)，CD19(clone：6D5，biolegend，115506)，stain buffer(BD，554656)。

流式抗体孵育步骤：

(1)吸取上述细胞悬液500μL(约5×10

(2)其中，空白对照样本进行以下处理：350g离心5分钟，弃上清，加200μL stainbuffer重悬，于4℃保存，待上机检测；

(3)将待检测细胞(约2.5×10

(4)将步骤(3)中的细胞加入抗体CD3(0.2mg/mL)和CD19(0.2mg/mL)孵育：轻柔涡旋，置于4℃条件下避光孵育20min，期间每间隔5min混匀1次；标记结束后，加入1mL stainbuffer，350g离心5分钟，弃上清，再加入250μL Stain buffer重悬细胞，待上机检测。

上机(仪器)、检测。检测结果参见图10和图11，他莫昔芬诱导前，小鼠的B细胞占比约为47.93％，B细胞总数约4.8×10

3、永生化B细胞体外筛选

细胞培养中可以加入TK基因底物Ganciclovir(GCV)，诱导没有发生倒位的其他免疫细胞死亡，连续培养一周形成B细胞克隆团，这样获得的细胞均是永生化的B细胞。

试剂：

ImmunoCult

细胞培养流程：

第一天，将脾脏中分离所得的细胞使用ImmunoCult

第三天，将细胞悬液收集，350g，离心5分钟，收集底部细胞，用添加GCV(工作浓度为20μg/mL)的ImmunoCult

(注意，细胞培养前三天尽量减少细胞观察频次，换液前需将培养基置于37℃条件进行充分预热。)

第五天，将细胞悬液收集，350g，离心5分钟，收集底部细胞，用RPMI1640完全培养基(HyCyte，GUMD-R117)重悬并计数，调整细胞浓度至1×10

第七天，细胞计数，控制细胞浓度在1×10

第九天后，每天镜下观察，根据细胞密度或培养基颜色指示情况补充新鲜培养基，并控制细胞密度在1×10

参见图12，构建的转基因小鼠B细胞体外培养情况：培养第6天，出现了B细胞克隆团；培养第9天，B细胞克隆团持续增长。

实施例4抗体筛选验证(免疫+Tamoxifen诱导)

1、动物免疫及免疫情况检测

(1)、动物免疫

取2只转基因鼠进行抗原免疫，激活转基因鼠体内的B细胞对抗原产生反应。

试剂：抗原：卵清蛋白ovalbumin，以下简称OVA，(Sigama，A5503)；弗氏不完全佐剂(Sigma，F5506)；弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)

实验方法：将弗氏佐剂与抗原OVA按照1:1比例混合，调整抗原终浓度为1mg/mL。第一次免疫使用完全弗氏佐剂，第二、三次免疫使用不完全弗氏佐剂，第四次免疫无需佐剂。

注射计量为50μg/只，注射2只小鼠。小鼠注射方式为分点皮下注射，以保证抗原持续稳定刺激动物体。

接种周期间隔2周，实验中可进行外周血采集，通过检测抗原-抗体反应来确定免疫周期。

第三次免疫后，采血，分离血清，用Elisa检测法检测血清中OVA抗体的表达情况【检测方法和结果参见下文步骤(2)】。

然后进行第四次免疫，加强免疫效果，尾静脉注射25μg抗原OVA。

(2)、检测血清中抗体效价(Elisa检测法)

取2只他莫昔芬诱导后的转基因小鼠(编号Model 1，Model 2)的外周血进行OVA抗原-抗体效价测定，验证小鼠体内抗体产生的情况。具体试剂和实验方法如下：

试剂及配制：

PBST：取1ml Tween加入至1L PBS，搅拌均匀；封闭液：称取0.5g BSA溶解至10mlPBS；终止液：量取178.3ml去离子水至250ml试剂瓶中，再加入21.7ml浓硫酸。

实验方法：

(2.1)用PBS稀释OVA至5μg/ml，每孔100μl加入到一次性酶标板中，4℃过夜孵育。

(2.2)用PBS梯度稀释他莫昔芬诱导后的转基因小鼠的外周血血清，制备成1/10，1/100，1/1000，1/10000，1/100000浓度的血清样本。

(2.3)封闭：从4℃冰箱取出过夜包被的酶标板，倒去孔内液体，使用装有PBST的洗板机洗涤两次，洗涤体积为300μl，每孔加入200μl封闭液，置于37℃的培养箱中孵育1小时。

(2.4)血清孵育：从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，每孔100μl的体积将稀释好的血清加入到板子中，置于37℃的培养箱中孵育1h。

(2.5)二抗孵育：取1μl二抗(Rabbit anti-Mouse IgG，Thermo Fisher，SA5-10211)，加入2ml PBS，从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，每孔100μl的体积将稀释好的二抗加入到板子中，置于37℃的培养箱中孵育1小时。

(2.6)显色：从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，每孔100μl的体积加TMB到酶标板中，室温避光放置5分钟。

(2.7)终止：每孔加入100μl终止液。

(2.8)读数：使用酶标仪450nm读数，分析数据。结果见图13，构建的转基因小鼠经OVA抗原免疫后，经Elisa法检测，血清中OVA抗体效价～10000，说明小鼠体内产生了OVA特异性抗体。

2、他莫昔芬诱导

给第四次免疫后的转基因小鼠注射他莫昔芬，激活CreERT2活性，并将目的基因片段(cdsA和cdsB)倒位，使得表达框恢复正向，启动目的基因在成熟浆细胞中的表达，以此来诱导产生OVA抗体的B细胞发生自发永生化。

试剂：Tamoxifen(Sigma，T-5648)、无水乙醇、葵花籽油(Cornoil，Sigma，C8276)；

配置：称取50mg Tamoxifen，置于无水乙醇中，55℃助溶，约1小时；待完全溶解后加入9.5ml葵花籽油，翻转仪上混匀约30min；适量分装储存于-80℃避光保存。

给药方式：腹腔注射，Tamoxifen注射量为100mg/Kg，连续给药7天，从而获得表达OVA抗体的B细胞永生化的小鼠模型。(为保证Cre工作效率，停药7～10天后进行实验。)

3、永生化B细胞体外筛选

(1)、动物解剖、制备小鼠脾脏单细胞悬液

取经他莫昔芬诱导后的B细胞永生化小鼠的脾脏，制备单细胞悬液。在小鼠体内，B细胞永生化会引起T细胞的活化，活化的T细胞杀伤细胞会攻击B细胞母细胞。通过检测他莫昔芬诱导前后的B细胞/T细胞变化情况，则能判定B细胞永生化小鼠是否构建成功。

动物解剖：脱颈法迅速处死小鼠，用75％酒精喷洒体表消毒，剪开皮肤及腹膜，取出脾脏，置于含有2％FBS的DMEM培养基中。

小鼠脾脏单细胞悬液制备：

使用研磨棒和筛网研磨湿润的(PBS润洗)脾脏，释放出脾脏组织中细胞，随后将研磨液移至15ml离心管中。将脾脏细胞研磨液以350g在4℃离心5分钟，离心后弃上清。

在离心结束后收集到的细胞中加入3ml 1X红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，重悬细胞，冰上孵育5分钟。

向离心管中加入10mLPBS以终止红细胞裂解，350g，4℃，离心5分钟，弃上清。

用B细胞培养基【ImmunoCult

(2)、永生化B细胞培养

细胞培养中可以加入TK基因底物Ganciclovir(GCV)，诱导没有发生倒位的其他免疫细胞死亡，连续培养一周形成B细胞克隆团，这样获得的细胞均是永生化的B细胞。

试剂：

ImmunoCult

细胞培养流程：

第一天，将脾脏中分离所得的细胞使用ImmunoCult

第三天，将细胞悬液收集，350g，离心5分钟，收集底部细胞，用添加GCV(工作浓度为20μg/mL)的ImmunoCult

(注意，细胞培养前三天尽量减少细胞观察频次，换液前需将培养基置于37℃条件进行充分预热。)

第五天，将细胞悬液收集，350g，离心5分钟，收集底部细胞，用RPMI1640完全培养基(HyCyte，GUMD-R117)重悬并计数，调整细胞浓度至1×10

第七天，换液，每天镜下观察，根据细胞密度或培养基颜色指示情况补充新鲜培养基，控制细胞浓度在1×10

第九天，挑取B细胞克隆团，放入铺满RPMI1640完全培养基的96孔板中。

参见图14，经OVA抗原免疫，他莫昔芬诱导后的转基因小鼠B细胞体外培养情况：培养第6天，出现了B细胞克隆；培养第9天，B细胞克隆团持续增长。

第12天，收集96孔板中的细胞上清，进行Elisa检测。

4、抗体亲和力初筛

对96孔板中的样品进行Elisa检测，检测OVA抗原-抗体结合情况。

检测方法如下：

试剂及配制：

PBST：取1ml Tween加入至1L PBS，搅拌均匀；封闭液：称取0.5g BSA溶解至10mlPBS；终止液：量取178.3ml去离子水至250ml试剂瓶中，再加入21.7ml浓硫酸。

实验方法：

(4.1)用PBS稀释OVA抗原至5μg/ml，每孔100μl加入到一次性酶标板中，4℃过夜孵育。

(4.2)封闭：从4℃冰箱取出过夜包被的酶标板，倒去孔内液体，使用装有PBST的洗板机洗涤两次，洗涤体积为300μl，每孔加入200μl封闭液，置于37℃的培养箱中孵育1小时。

(4.3)血清孵育：从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，将收集到的细胞上清，每孔100μl的体积，加入至孔板内，置于37℃的培养箱中孵育1h。

(4.4)二抗孵育：取1μl二抗(Rabbit anti-Mouse IgG，Thermo Fisher，SA5-10211)，加入2ml PBS，从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，每孔100μl的体积将稀释好的二抗加入到孔板中，置于37℃的培养箱中孵育1小时。

(4.5)显色：从培养箱中取出酶标板，倒去孔内液体，PBST洗涤两次，每孔100μl的体积加TMB到酶标板中，室温避光放置5分钟。

(4.6)终止：每孔加入100μl终止液。

(4.7)读数：使用酶标仪450nm读数，见图15，其中OD450在1.0～3.0之间的样本为初筛后的阳性样本，说明经永生化的B细胞经培养后可持续表达OVA抗原特异性抗体。