一种阴道壁组织类器官模型构建的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种阴道壁组织类器官模型构建的方法。

背景技术

依据目前已发表专利《一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法》(CN112680404A)，公开了将阴道的组织块清洗、碎解、离心、加入胶原酶I型消化，时间为180min，消化过程中振荡，过滤、重悬等步骤获得活性较高杂质较少的阴道壁组织单细胞悬液。该方法消化酶单一，消化耗时长。

专利《一种阴道上皮细胞分离培养方法》(CN111088219A)公开了：剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中，得到阴道上皮细胞，在体外进行二维培养阴道上皮细胞扩增。二维培养只有与培养表面接触的一侧发生细胞吸附。许多细胞从组织中分离出来并置于平面细胞培养表面时，会逐步变得更加扁平，分裂异常，并丧失其分化表型。

专利《一种胃癌类器官的无血清专用培养基与类器官培养方法》(CN116536266)，公开了消化过程采用1)将剪碎的胃癌组织进行预处理后进行消化，收集细胞沉淀；2)将细胞与matrigel胶按一定比例混匀并接种在低吸附板上，待混合胶凝固后，加入配制的专用培养基，并于37℃、5％CO

3D培养优势，整个细胞表面都可以发生细胞吸附，细胞吸附和伸展的程度影响其增殖、凋亡和分化功能。3D培养可以建立起生理上的细胞-细胞与细胞-细胞外基质相互作用，模拟天然组织的特异性。3D培养模型的另一个重要的生理特性是适宜的细胞极性。体内的极性取决于细胞类型和组织微环境。上皮细胞通常都是有极性的，有顶面和基底外侧表面，这对组织的结构和生物活性分子的定向分泌很重要。

因此如何缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，以及如何实现在体外进行3D培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建成为需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的提供了一种用于培养阴道壁组织类器官的培养基，包括基础培养基S-Reduce减血清DMEN/F12(1:1)培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：B-27

本发明的目的提供了一种阴道壁组织类器官模型构建的方法，为了解决如何缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，以及如何实现在体外进行3D培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建的问题，本发明提供的方法，通过改进酶解液配制，缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，本发明的用于培养阴道壁组织类器官的专用培养基，用于在体外进行3D培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建。

为了解决上述技术问题，本发明的阴道壁组织类器官模型构建的方法该方法包括：

(1)组织酶解：将清洗后剪碎至小块或糊状的人阴道壁手术组织经组织酶解液重悬剪碎组织，酶解40-80min；

(2)过滤收集细胞：将酶解后的细胞过滤，用含血清的DMEM培养基清洗细胞、离心、弃上清，后用红细胞裂解液进行红细胞裂解、离心、弃上清后得到阴道壁组织细胞沉淀；

(3)细胞原代培养：将细胞沉淀用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

(4)类器官传代培养：将D1阴道壁组织类器官经过清洗、离心、弃上清，加入消化液消化2-10min，加入含血清的DMEM培养基终止消化、离心、弃上清后重复步骤(3)，待细胞生长为D2阴道壁组织类器官；

步骤(1)中，置于37℃，5％CO

步骤(1)中，组织酶解液为高糖DMEM培养基,DispaseII含量0.1-1mg/ml,胶原酶含量0.1-1mg/ml，青霉素链霉素混合液1-5×，FBS含量总体积1-10％，DNA酶0.1-0.2mg/ml；

在步骤(2)中，细胞过滤使用70μM细胞筛网进行过滤；

在步骤(2)中，离心200-400g，时间为3-5min；

在步骤(2)中，含血清的DMEM培养基为高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，1-5×，FBS含量总体积1-10％；

在步骤(3)中，孵育时间20-30min，在培养过程中，每隔2-3天补加一次液体培养基，培养4-7天后得到D1阴道壁组织类器官；

在步骤(4)中，采用PBS清洗1-2次，200-400g,离心3-5min，加入0.5-3mL细胞消化液在37℃培养箱消化2-10min，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化；

在步骤(4)中，细胞消化液为Tryple Express或Trypsin-EDTA Solution或Acctuase，优选为Tryple Express。

相比于现有技术，本发明的有益效果在于：通过改进酶解液配制，缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，本发明公开的阴道组织专用培养基，用于在体外进行3D培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建，本发明公开的培养基和培养方法用于三维阴道壁组织类器官培养可有效促进细胞生长，最终形成类器官数量多，成活率高。

附图说明

图1是阴道壁组织预处理后的细胞照片

图2是培养24h阴道壁组织类器官生长照片

图3是原代培养6天阴道壁组织类器官生长照片

图4是P1代阴道壁组织类器官生长照片

图5是P2代阴道壁组织类器官生长照片

图6是P3代阴道壁组织类器官生长照片

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

一些实施方式提出的阴道壁组织类器官模型构建的方法，其方法包括：

(1)组织酶解：将清洗后剪碎至小块或糊状的人阴道壁手术组织经组织酶解液重悬剪碎组织，酶解40-80min；

(2)过滤收集细胞：将酶解后的细胞过滤，用含血清的DMEM培养基清洗细胞、离心、弃上清，后用红细胞裂解液进行红细胞裂解、离心、弃上清后得到阴道壁组织细胞沉淀；

(3)细胞原代培养：将细胞沉淀用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

(4)类器官传代培养：将D1阴道壁组织类器官经过清洗、离心、弃上清，加入消化液消化2-10min，加入含血清的DMEM培养基终止消化、离心、弃上清后重复步骤(3)，待细胞生长为D2阴道壁组织类器官；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，步骤(1)中，置于37℃，5％CO

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，步骤(1)中，组织酶解液为高糖DMEM培养基,DispaseII含量0.1-1mg/ml,胶原酶含量0.1-1mg/ml，青霉素链霉素混合液1-5×，FBS含量总体积1-10％，DNA酶0.1-0.2mg/ml；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(2)中，细胞过滤使用70μM细胞筛网进行过滤；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(2)中，离心200-400g，时间为3-5min；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(2)中，含血清的DMEM培养基为高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，1-5×，FBS含量总体积1-10％；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(3)中，孵育时间20-30min，在培养过程中，每隔2-3天补加一次液体培养基，培养4-7天后得到D1阴道壁组织类器官；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(4)中，采用PBS清洗1-2次，200-400g,离心3-5min，加入0.5-3mL细胞消化液在37℃培养箱消化2-10min，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化；

上述实施方式的基础上，作为优选的实施方式，在步骤(4)中，细胞消化液为Tryple Express或Trypsin-EDTA Solution或Acctuase。

1、实验前准备

生物安全柜紫外照射30min，手术专用剪刀镊子提前高压灭菌处理，实验所需试剂提前从冰箱取出恢复室温，实验所需耗材提前酒精喷洒消毒处理；

2、检查实验组织

实验室接收到的手术组织，先检查样本管是否完好，是否存在漏液，若存在漏液在步骤3中用组织清洗液清洗5-10次；

3、组织破碎

将人阴道壁手术组织从手术组织保存液中取出，使用组织清洗液清洗2次，加入200-500μl组织酶解液(一般阴道壁组织样本小，若样本较大可增加组织酶解液用量)，用手术专用剪将组织剪碎至0.5～1.5mm3小块甚至糊状，整个过程在5-10min内完成；其中：手术组织保存液：RPMI1640培养基，加入青霉素链霉素混合液，1-5×，MEM非必需氨基酸溶液(100X)，1-5×，胎牛血清含量5％-10％，组织清洗液：Hanks'平衡盐溶液(HBSS),加入青霉素链霉素混合液，1-5×,硫酸庆大霉素,1/1000-5/1000；

实施例1

步骤1：组织酶解

用3-10mL组织酶解液，本实施例中选择3ml进行实验，重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，5％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过70μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心3min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心3min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心3min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，1×，FBS含量总体积1％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心3min，弃上清，加入1mLTrypsin-EDTA Solution细胞消化液在37℃培养箱消化2min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心3min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，5％CO

实施例2

步骤1：组织酶解

用5mL组织酶解液重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，5％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过70μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心4min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心4min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心4min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，2×，FBS含量总体积3％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心4min，弃上清，加入1mL Tryple Express细胞消化液在37℃培养箱消化3min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心4min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，5％CO

实施例3

步骤1：组织酶解

用8mL组织酶解液重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，5％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过70μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心5min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心5min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心5min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，5×，FBS含量总体积7％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心5min，弃上清，加入2mL Acctuase细胞消化液在37℃培养箱消化3min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心5min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，5％CO

实施例4

步骤1：组织酶解

用6mL组织酶解液重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，5％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过70μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心3min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心3min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心3min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，3×，FBS含量总体积8％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心5min，弃上清，加入1.5mL Tryple Express细胞消化液在37℃培养箱消化5min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心5min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，5％CO

实施例5

步骤1：组织酶解

用10mL组织酶解液重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，5％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过70μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心4min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心4min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心4min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，45×，FBS含量总体积10％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心5min，弃上清，加入3mL Tryple Express细胞消化液在37℃培养箱消化5min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心5min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，5％CO

对比例1

步骤1：组织酶解

用20mL组织酶解液重悬剪碎组织至24孔低吸附细胞培养板的3-8孔，置于37℃，10％CO

步骤2：过滤收集细胞

酶解后的细胞，经过90μM细胞筛网过滤，用含血清的DMEM培养基冲洗筛网残留细胞，收集细胞300-400g,离心5min，弃上清，用含血清的DMEM培养基二次重悬细胞沉淀，300-400g,离心5min，弃上清，最后用红细胞裂解液进行红细胞裂解，300-400g,离心5min，弃上清，获得阴道壁组织细胞沉淀；其中，含血清的DMEM培养基：高糖DMEM培养基，加入青霉素链霉素混合液，5×，FBS含量总体积10％；

步骤3：细胞原代培养及原代细胞冻存

步骤2获得的细胞沉淀，一部分加入细胞冻存液冻存，作为后续种子细胞；另外一部分细胞用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％CO

步骤4：类器官传代培养

收集步骤3培养的D1阴道壁组织类器官，PBS清洗1次，200-400g,离心5min，弃上清，加入3mL胶原酶在37℃培养箱消化5min,类器官分散为较小细胞团聚集，或者多个单细胞聚集，加入2-8mL含血清的DMEM培养基终止消化，200-400g,离心5min，弃上清，用阴道壁组织类器官培养基重悬混合Matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，在37℃，10％CO

对比例2

一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备(CN112680404A)

(1)剪碎组织：

将洗净的组织块转入1.5mL离心管，加入400μL预冷的无血清培养基，用小剪刀将组织块快速剪碎成3mm3的细小碎块，整个过程在5min内完成，同时保持盛有组织的离心管在冰上操作；

(2)组织离心

补充800μL预冷的无血清培养基，4℃离心,500×g，5min；吸去上清，不要扰动离心管底部的组织碎块沉淀；

(3)酶解液消化

加入3mL、37℃预热的胶原酶I型酶解液，用宽口吸头将组织碎块和酶解液一起转移到新的15mL离心管，用封口膜封口；在37℃恒温箱中，平置离心管在水平旋转摇床上，振荡速度为95-105rpm，震荡孵育消化100-180min；

(4)中止反应并过滤

取出离心管，按1：5的比例加入细胞完全培养基终止消化，轻柔颠倒混匀，静置1min，选用不同孔径的细胞筛网过滤消化后的细胞悬液，并用无血清培养基冲洗离心管和细胞筛网，收集滤出液；室温离心2000rpm，8min；吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀；

(5)重悬细胞并去除死细胞。

对比例3

一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备(CN112680404A)

(1)剪碎组织：

将洗净的组织块转入1.5mL离心管，加入400μL预冷的无血清培养基，用小剪刀将组织块快速剪碎成3mm3的细小碎块，整个过程在5min内完成，同时保持盛有组织的离心管在冰上操作；

(2)组织离心

补充800μL预冷的无血清培养基，4℃离心,500×g，5min；吸去上清，不要扰动离心管底部的组织碎块沉淀；

(3)酶解液消化

加入3mL、37℃预热的胰酶、胶原酶I型酶解液，用宽口吸头将组织碎块和酶解液一起转移到新的15mL离心管，用封口膜封口；在37℃恒温箱中，平置离心管在水平旋转摇床上，振荡速度为95-105rpm；

(4)中止反应并过滤

取出离心管，按1：5的比例加入细胞完全培养基终止消化，轻柔颠倒混匀，静置1min，选用不同孔径的细胞筛网过滤消化后的细胞悬液，并用无血清培养基冲洗离心管和细胞筛网，收集滤出液；室温离心2000rpm，8min；吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀；(5)重悬细胞并去除死细胞。

实验对比结果参见表1：

表1：采用实施例1-5以及对比例1-3的方法的实验步骤及结果

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对比结果显示：可以看出采用实施例1-5的方法通过对酶解液的配制实现了缩短消化时间，进而在短时间内可获得较高活性的细胞，通过实施例1-5进行对比，采用实施例4的方法以及其组织酶解液的配置，类器官细胞成型时间最短且过程中组织消化时间最短，细胞活性最高，然而对比例1适当改变了组织酶解液所含物质的配比以及步骤中的实验条件，结果虽然细胞数目较多但其细胞活性和类器官细胞成型时间上与实施例1-4相比细胞活性相对较弱、类细胞成型时间延长，对比例2和对比例3中采用的酶解液，对比例3的细胞活性低至无法满足需求，而对比例2尽管符合要求但是其消化时间过长，因此也不利于保证细胞的较高活性，因此实施例4的方案优于对比例1-3以及其他实施例；

本发明通过优化细胞分离方法，改进酶解液配制，缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞；本申请中用于阴道组织类器官培养的培养基与Matrigel及获得的细胞混合，在体外进行三维培养类器官，在三维环境中培养特定组织器官包含多种细胞类群，实现细胞扩增完成模型构建，突破技术的局限性，体外培养的类器官在细胞成分和组织结构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征，与体内微环境更为相似。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。