具有防病效果的油茶叶际合成菌群的构建方法和构建的菌群及应用

技术领域

本发明属于微生物菌种构建复合功能菌群的生物技术领域，具体涉及一种抗病复合菌群的构建方法、复合功能菌群及其防治植物病害的应用。

背景技术

植物的微生物群落，也称为植物微生物组(或植物微生物群)，存在于根际、叶际和植物内部。这些植物微生物组在提高植物发展免疫力，抑制疾病发生，提供生存所需营养以及保护免受生物和非生物环境胁迫方面发挥着重要作用。

两个或多个物种在已知的培养条件下共培养而人工创建的微生物群体称为合成功能菌群。植物病害的生物防治常常基于单一菌株的应用，但单一菌株难以适应田间复杂的环境，某些在实验室能发挥作用的菌株在田间则达不到理想效果。随着研究的不断发展，使用微生物群落或者合成菌群进行防治逐渐成为趋势，其目标是更高的有效性、多功能性以及在环境中的稳定性。

叶际微生物生活在宿主植物的特殊环境中并与宿主协同进化。一方面植物为其提供生长所必须的能量和营养物质；另一方面，叶际微生物又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。叶际微生物与宿主植物的健康生长息息相关，某些叶部病原菌可以导致植物发病，而叶片上非致病微生物的多样性则可以对植物起到保护作用。

油茶炭疽病是油茶的主要病害之一，其病菌能够侵染油茶的花芽、叶芽、果实、枝梢和叶片，通常引起油茶的落花、落果和枝枯现象，严重时可造成整株死亡。在我国各油茶产区均有发生，各省(区)每年因该病造成油茶籽实减产10％～30％，重病区40％～50％。在典型林分，病落蕾占落蕾总数的26％～45％。晚期病果虽可采收，但种子含油量仅为健康种子的一半，甚至更低。当前炭疽病防治以化学防治为主，但易产生环境污染及耐药性等问题，因此亟待开发生物防治方法。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种构建具有防病效果的油茶叶际合成菌群的方法及其构建的菌群，还有菌群的应用。

本发明依据油茶叶际微生物群落结构特点，根据菌株的抗病特性，利用油茶叶际微生物中分离到的细菌，构建出具有良好定殖效果且能抗病的复合菌群，避免由于长期使用单一菌剂应用时引发的生态失衡问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

具有防病效果的油茶叶际合成菌群的构建方法，包括以下步骤：

(1)采集油茶叶片，分析油茶叶际微生物群落结构，得到细菌群落相对丰度排名；(2)分析油茶叶际细菌群落的互作网络，获得微生物物种中心性排名；(3)从油茶叶际微生物中筛选具有抑菌和产铁载体能力的细菌，结合群落相对丰度以及中心性排名，选择同时具有拮抗油茶致病病菌及产铁载体能力的油茶叶际细菌构建群落；(4)测定合成菌群的叶面定殖时间以及炭疽病防效，选择最优合成菌群。

所述的构建方法，至少采集3个地区、3个品种的油茶健康叶片进行相对丰度、中心性排名分析和筛选。

所述的构建方法，采集湖南油茶主栽品种：普通油茶‘华硕’、普通油茶‘湘林210’，攸县油茶。

本发明还提供了具有防病效果的油茶叶际合成菌群，包含：

保藏编号为CCTCC NO:M 20231284的Bacillus sp.H12、保藏编号为CCTCC NO:M20231283的Pseudomonas sp.H28、保藏编号为CCTCC NO:M 20231285的Bacillus sp.H6-9、保藏编号为CCTCC NO:M 20231286的Bacillus sp.H6-19中的至少两种。

所述的具有防病效果的油茶叶际合成菌群，优选包含以下任一组合：

Bacillus sp.H12和Bacillus sp.H6-9；

Bacillus sp.H12和Bacillus sp.H6-19；

Pseudomonas sp.H28和Bacillus sp.H6-19；

Bacillus sp.H12、Pseudomonas sp.H28和Bacillus sp.H6-19；

Bacillus sp.H12、Bacillus sp.H6-9和Bacillus sp.H6-19；

Pseudomonas sp.H28、Bacillus sp.H6-9和Bacillus sp.H6-19；

Bacillus sp.H12、Pseudomonas sp.H28、Bacillus sp.H6-9和Bacillus sp.H6-19。

本发明还提供了所述的具有防病效果的油茶叶际合成菌群的应用，即用于炭疽病的防治。尤其是用于油茶炭疽病的防治。

本发明还提供了所述的具有防病效果的油茶叶际合成菌群的应用，用于提高油茶叶片POD、SOD、PPO和PAL等防御酶的活性。

本发明还提供了所述的具有防病效果的油茶叶际合成菌群的应用，用于诱导油茶POD、SOD1和PR1B1等抗性基因的表达上调。

本发明四株菌保藏信息如下：

分类命名：Bacillus sp.H12，保藏编号为CCTCC NO:M 20231284；

分类命名：Pseudomonas sp.H28，保藏编号为CCTCC NO:M 20231283；

分类命名：Bacillus sp.H6-9，保藏编号为CCTCC NO:M 20231285；

分类命名：Bacillus sp.H6-19，保藏编号为CCTCC NO:M 20231286；保藏时间均为：2023年7月12日。

保藏中心名称：中国典型培养物保藏中心

保藏地点：湖北省武汉市武汉大学。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

本发明合成菌群叶面定殖时间明显高于单菌，在室内条件下，接种30d后合成菌群活菌数是单菌的3.35倍，在室外条件下，接种30d后成菌群活菌数是单菌的2.96倍。合成菌群油茶炭疽病防治效果优于单菌，合成菌群防治效果最高为100％，如：单一菌株Bacillussp.H6-9防治效果仅为16.21％。本发明合成菌群可以明显提高油茶叶片防御酶的活性，还可以明显诱导油茶抗性基因的表达上调；具有很好的应用前景。

附图说明

图1：不同栽培品种和地区油茶大于5％属的叶际细菌群落组成和相对丰度；

图2：油茶叶际细菌群落相互作用网络；

图3：合成菌群诱导的油茶叶片防御酶活性变化；

图4：合成菌群诱导的油茶叶片防御相关抗病基因表达。

图3和图4中CK：无菌水(对照组)；CF：病原菌：BA：合成菌群；BF：接种合成菌群12h后接病原菌。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不限于该实施例。

实施例1

1油茶叶际细菌群落分析及互作网络分析

1.1 2021年5月、6月和7月下旬，在湖南省长沙市天心区(N 41°29.454′,W07′30.398°,C)、攸县(N 41°32.593′,W 07′07.445°,A)和望城(N 41°32.756′,W07′07.590°,B)，这三个地区油茶样地进行采集。采集的攸县油茶、普通油茶′华硕′和普通油茶′湘林210′。

1.2在每块样地中随机选取每个健康栽培品种油茶各3株。在选取的油茶植株上用消毒剪刀和手套随机采集叶片，放入无菌自封袋中，标记样品信息并编号。采取不同样品时及时更换手套及并对剪刀进行消毒，防止交叉污染。

1.3将所有样本用冰袋冻存送回实验室。分别在每块样地中取每个栽培种3株，总共有27个样品，一部分样品保存在-80℃冰箱，用于微生物群落分析。另外一部分样品暂存于4℃冰箱中，用于分离叶际细菌。

1.4称取油茶叶片10g剪碎放入无菌锥形瓶中，加入200ml无菌TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)。将装有样品的锥形瓶放入转速为200r/min摇床上振荡30min，振荡后放在40kHz超声波清洗机中15min，在无菌环境中使用真空抽滤装置将振荡液中的微生物收集到0.22μm的滤膜上，Power

1.5测序工作由上海美吉生物科技有限公司完成。以上述提取的DNA为模板，使用携带Barcode序列的上游引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，见SEQ NO.1)，和下游引物907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'，见SEQ NO.2)对16S rRNA基因V4-V5可变区进行PCR扩增，每个样本3个重复。

1.6利用R语言vegan包绘制Heatmap图根据样本间丰度的相似性进行聚类，通过颜色变化来反映样本属分类学水平上群落组成的相似性和差异性。

1.7在属的分类水平上对油茶叶际细菌群落组成和相对丰度进行分析，选择相对丰度>5.00％的菌群为优势菌群。结果见图1。

Networkx软件来分析和构建微生物之间的网络。基于spearman相关性，|r|>0.6p<0.05挑选物种进行相关性网络图绘制。结果见图2。

1.8在叶际细菌互作网络中，中心性排名前5的细菌有Exiguobacterium(微小杆菌属)、Methylobacterium(甲基杆菌属)、Paenibacillus(类芽孢杆菌)、Pseudonocardia(诺卡氏菌属)和Ochrobactrum(苍白杆菌属)这些物种具有高度的中心性和相关性。在中心性排名30的属中选择群落构建菌株。结果见图2。

2油茶叶际拮抗细菌筛选及鉴定

2.1采用对峙培养法筛选油茶炭疽病生防细菌。首先将病原菌菌饼(直径5mm)接种到PDA固体培养基平板中央，然后将叶际细菌点接至离板面中心15mm的三个呈三角形的对称位置，每个处理三次重复，以中间仅接种病原菌的平板为对照，然后将平板放入28℃恒温培养箱中培养7d后观察有无抑菌圈出现。筛选到对C.fructicola有拮抗作用的细菌总共214株。

2.2取油茶叶际拮抗细菌菌液1μL作为PCR扩增模板，以细菌16S rDNA的通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，见SEQ NO.3)和1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’，见SEQ NO.4)对其进行菌落PCR。将扩增的PCR原液送往北京擎科生物科技有限公司测序，得到的DNA序列在NCBI网站中进行比对分析。经分子生物学鉴定主要来自6个属，分别为芽孢杆菌属(Bacillus)139株、假单胞菌属(Pseudomonas)42株，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)19株、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)7株、微杆菌属(Microbacterium)5株和不动杆菌属(Acinetobacter)2株。

3产铁载体叶际细菌筛选

3.1产铁载体叶际细菌定性筛选油茶叶际拮抗细菌接种到LB平板上培养1d后，采用点接种法，用灭菌的牙签将菌落接在CAS固体检测平板上，每个菌种设置3个重复，置于28℃培养箱培养3至7d。观察菌落周围是否产生黄色晕圈，即噬铁圈。

3.2产铁载体能力定量检测用牙签取定性检测产铁载体的叶际细菌于装有20mLMKB液体培养基的三角瓶内，200r/min、28℃震荡培养2d。取2毫升菌液于10000r/min高速冷冻离心机中离心15min，取1mL上清液并加入装有同体积CAS检测液的离心管中，充分混匀，避光静置1h后，用紫外分光光度计测定反应液630nm波长处的吸光值。从214株油茶叶际拮抗细菌中筛选得到产铁载菌株32株。(表1)

表1油茶叶际拮抗细菌的产铁载体能力

4油茶叶际合成菌群构建

4.1结合群落相对丰度以及中心性排名，在具有产铁载体能力的32株油茶叶际炭疽菌拮抗细菌中，选择5株菌作为待试菌株。(表2)

表2构建合成菌群的菌株特性

5合成菌群在油茶叶表的定殖

5.1合成菌群的叶片接种在无菌操作台中将消毒后的叶片均匀平铺在吸水纸上，在同等距离条件下均匀喷施1ml浓度为10

表3合成菌群成员

5.2合成菌群的定殖情况观察分别于1d，3d，7d，15d，30d五个天数，观察定殖情况。将叶片放入无菌三角瓶中并加入10mL无菌水，超声波(40Hz)清洗5min，再放入200r/min、28℃恒温震荡培养箱20min，然后将油茶叶片取出，将液体分装至到5mL无菌离心管中，经8000r/min离心5min，弃去上清液，留下沉淀。再用无菌水定容至5mL。将悬浮液根据天数进行不同倍数的稀释。取每个稀释液100μL均匀涂布于LB固体平板上，设置3个重复，置于28℃的恒温培养箱培养2d，统计合成菌群的菌落数量。

5.3室内条件下第30d时合成菌群H12/H28/H6-9/H6-19活菌数为9.4893×10

6合成菌群对油茶炭疽病防治效果测定

6.1叶片表面消毒后接种拮抗菌，拮抗菌单株及合成菌群接种方法见5.1，喷无菌水为对照。待叶片晾干后，用灭菌后的牙签进行小范围的有伤处理，接种直径为5mm的果生刺盘孢菌饼于油茶叶面，每处理设置10个重复。将处理后的叶片至于培养皿中，放入25℃人工气候箱中保湿培养5d后观察侵染状况，计算病情指数和防治效果。油茶炭疽病分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积＜20％；2级：20％＜病斑面积＜50％；3级：50％＜病斑面积＜75％；4级：病斑面积>75％。

病情指数＝(发病级别×该级别发病数)/(总个数×最高病级别)×100

防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

6.2对于不同处理下油茶叶片离体防效检验，结果如表6所示。表6表明，合成菌群H12/H28/H6-9/H6-19和C2/H12/H6-9/H28防治效果为100％，单一菌株H6-9防治效果为16.21％，据此，合成菌群防效明显高于单一菌株。因此合成菌群对离体防治效果优于单菌。

表4单菌和合成菌群在油茶叶际的定殖情况(室内)

表5单菌和合成菌群在油茶叶际的定殖情况(室外)

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表6合成菌群离体叶片防效

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7合成菌群诱导油茶叶片防御酶活性变化

7.1本试验共设4个处理，分别编号为CF，BA，BF和CK，其中CF处理为只喷病原菌，BA处理为只喷H12/H28/H6-9/H6-19合成菌群，BF为先喷合成菌群12h后喷病原菌，CK处理为无菌水(对照组)，每个处理设5个重复。取200mL各处理所需的无菌水，10

7.2粗酶液提取共设10个时间点进行叶片采集，分别为接种后2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h和72h。称取0.5g叶片放入研钵中，加入10mL磷酸缓冲液(pH 7.8)和少量石英砂进行研磨匀浆后，转入10mL离心管中，8000r/min离心15min，上清液为SOD、POD和PPO活性测定所需的粗酶液。称取0.5g叶片放入预冷的研钵中，加10ml含5mmol/L的巯基乙醇的硼酸缓冲液(pH 8.8)、0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和少量石英砂进行研磨匀浆后，转入10mL离心管中，8000r/min离心15min，上清液为PAL活性测定所需的粗酶液。

7.3酶活测定SOD、POD、PPO和PAL酶活测定采用索莱宝试剂盒。

8合成菌群诱导油茶叶片防御相关抗病基因表达

8.1总RNA的提取称取0.1g样品液氮充分研磨，放入1.5mL离心管中，然后根据

8.2cDNA合成使用

8.3荧光定量PCR(qRT-PCR)使用TSINGKE TSE203

表7qRT-PCR使用的引物

表7中引物分别见SEQ NO.5-12。

8.4在油茶叶面接种C.fructicola，接种合成菌群可以明显提高油茶叶片POD、SOD、PPO和PAL等防御酶的活性。结果见图3。

8.5油茶抗性基因定量分析表明合成菌群诱导了油茶POD、SOD1和PR1B1等抗性基因的表达上调。结果见图4。