一种枯草芽孢杆菌及其在生产脂肽中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种枯草芽孢杆菌及其在生产脂肽中的应用。

背景技术

生物表面活性剂是一类主要由细菌、酵母菌和真菌产生的具有较强表面/界面活性的微生物次生代谢产物，包括脂肽、糖脂、磷脂、糖蛋白质复合物、脂肪酸或天然脂质等。微生物脂肽是具有代表性的一类生物表面活性剂，其特点是一系列不同家族的结构类似物。微生物脂肽不仅能够显著降低溶液表界面张力、乳化性能稳定、生物相容性良好，而且还具有抗菌、抗病毒、杀虫、溶血栓等多种生物功能。因此微生物脂肽在石油开采、日化用品、食品添加剂、生物医药、环境修复和生物农药等领域有广泛的应用。

但目前大多数微生物仅仅能在氧气充足的条件下生产生物表面活性剂，据报道只有58株可在厌氧条件下生产生物表面活性剂的细菌菌株，数量十分有限，然而，环境中存在大量无氧或缺氧环境，例如深海和地下油藏。因此，可以在厌氧和好氧条件下生产生物表面活性剂菌株可以在石油开采、深层油污土壤生物修复等领域发挥至关重要的作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在生产脂肽中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11，其保藏编号为CGMCC No.28191，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧条件下生产脂肽中的应用。

在本发明的一个实施方式中，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧条件下生产脂肽，包括以下步骤：

(A1)种子液的制备：将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11接种至种子培养基中，培养得到种子液；

(A2)好氧条件下生产脂肽：将步骤(A1)制备得到的种子液在好氧状态下接种至好氧发酵培养基中，好氧培养后纯化处理，得到脂肽。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A1)中，种子培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述种子培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间为20～30h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，种子液的接种量为1～2wt％。

在本发明的一个实施方式中，步骤(A2)中，好氧发酵培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述好氧发酵培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间48～72h。

本发明的第三个目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在厌氧条件下生产脂肽中的应用。

在本发明的一个实施方式中，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在厌氧条件下生产脂肽，包括以下步骤：

(B1)种子液的制备：将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11接种至种子培养基中，培养得到种子液；

(B2)好氧条件下生产脂肽：将步骤(B1)制备得到的种子液在氮气保护下接种至厌氧发酵培养基中，静置培养后纯化处理，得到脂肽。

在本发明的一个实施方式中，步骤(B1)中，种子培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述种子培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间为20～30h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(B2)中，厌氧发酵培养基的组分具体如下：

蔗糖10.0～20.0g，NaCl 50.0g，NaNO

所述厌氧发酵培养基的pH为7.0～7.2，使用时将厌氧发酵培养基在氮气的保护下煮沸培养基除去溶解氧后，并在氮气的保护下分装于血清瓶后用丁腈橡胶塞密封后于115℃灭菌30min。

种子液的接种量为1～2wt％；

静置培养过程中，温度为37℃，时间3～10天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的枯草芽孢杆菌ME11能够在好氧或厌氧条件下生产脂肽，克服了传统生物表面活性剂产生菌在缺氧环境下无法生产生物表面活性剂的缺陷；拓展了枯草芽孢杆菌在缺氧或无氧环境下的应用范围，例如在极端环境的生物修复或油藏原位微生物增强石油采收率等领域的应用。

附图说明

图1为菌株ME11的系统发育树图；

图2为实施例3中枯草芽孢杆菌ME11在好氧条件下生产的脂肽的电喷雾质谱图。

图3为实施例3中枯草芽孢杆菌ME11在厌氧条件下生产的脂肽的电喷雾质谱图。

具体实施方式

本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11，其保藏编号为CGMCCNo.28191，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧条件下生产脂肽中的应用。

进一步的，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧条件下生产脂肽，包括以下步骤：

(A1)种子液的制备：将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11接种至种子培养基中，培养得到种子液；

(A2)好氧条件下生产脂肽：将步骤(A1)制备得到的种子液在好氧状态下接种至好氧发酵培养基中，好氧培养后纯化处理，得到脂肽。

进一步的，步骤(A1)中，种子培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述种子培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间为20～30h。

进一步的，步骤(A2)中，种子液的接种量为1～2wt％。

进一步的，步骤(A2)中，好氧发酵培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述好氧发酵培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间48～72h。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在厌氧条件下生产脂肽中的应用。

进一步的，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在厌氧条件下生产脂肽，包括以下步骤：

(B1)种子液的制备：将活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11接种至种子培养基中，培养得到种子液；

(B2)好氧条件下生产脂肽：将步骤(B1)制备得到的种子液在氮气保护下接种至厌氧发酵培养基中，静置培养后纯化处理，得到脂肽。

进一步的，步骤(B1)中，种子培养基的组分具体如下：

蔗糖20.0g，硝酸钠1.0～5.0g，KH

所述种子培养基的pH为7.0～7.2，115℃灭菌30min备用；

培养过程中，转速为180～200rpm，温度为37℃，时间为20～30h。

进一步的，步骤(B2)中，厌氧发酵培养基的组分具体如下：

蔗糖10.0～20.0g，NaCl 50.0g，NaNO

所述厌氧发酵培养基的pH为7.0～7.2，使用时将厌氧发酵培养基在氮气的保护下煮沸培养基除去溶解氧后，并在氮气的保护下分装于血清瓶后用丁腈橡胶塞密封后于115℃灭菌30min。

种子液的接种量为1～2wt％；

静置培养过程中，温度为37℃，时间3～10天。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：Bacillus subtilis ME11；

保藏号：CGMCC No.28191；

保藏日期：2023年08月17日；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂，所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。

实施例1

本实施例提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11的筛选培养方法，包括以下步骤：

(S1)样品富集培养：将油田产出液(油田产出液)按5％的接种量接种于50ml富集培养基中，在37℃、200rpm下震荡培养3天，随后转接培养三次(均为37℃、200rpm下震荡培养3天)获得富集培养液；

其中，富集培养基(115℃，灭菌30min)的成分是：市售石油10.0g、NaCl50.0g、KCl1.0g、NaNO

(S2)菌株分离与筛选：以分别为10

(S3)发酵液的获取：将步骤(S2)分离得到的单个菌落接种于富集培养基中，在37℃、200rpm下震荡培养72h，得到发酵液；

(S4)生物表面活性剂的生产：将步骤(S3)制备得到的发酵液离心，得到发酵上清液；

(S5)菌株产能验证：测定步骤(S4)得到的发酵上清液的表面张力，如果低于40mN/m则认为该菌株可以生产脂肽。

(S6)菌株的确认：利用细菌16S rRNA通用引物(Hopwood DA,etc.GeneticManipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual.Norwich:John InnesFoundation,1985)扩增菌株ME4的16S rRNA基因序列，获得的序列长度为1000bp。基于16SrRNA基因序列构建了系统发育树(图1)，结果表明，菌株ME11初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

实施例2

本实施例提供枯草芽孢杆菌菌株的获得及鉴定、保藏。

在油田产出液中筛选获得一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11，该菌株已于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28191。

分离得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧和厌氧条件下均能够生产脂肽。

经形态学鉴定和16S rRNA，ITS-2以及rncL扩增序列发育树分析，确定该菌株为枯草芽孢杆菌(按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为Bacillus、subtilis和ME11)，命名为Bacillus subtilis ME11，保藏号为：CGMCCNo.28191。该菌株具有如下优势：在好氧和厌氧条件下均能够生产脂肽。

实施例2

本实施例提供实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在好氧条件下生产脂肽的方法。

(S1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11的活化：通过接种环将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11划线于活化固体培养基上，并置于恒温培养箱中37℃培养12h，得到活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11；

其中，活化固体培养基(115℃灭菌30min)的组分为：酵母粉5wt％，蛋白胨10wt％，氯化钠10wt％，琼脂2wt％，以蒸馏水配制，pH为7.2。

(S2)种子液的制备：选取步骤(S1)得到的活化的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ME11的单菌落接种于盛装有种子培养基的三角瓶中(培养基装量50mL/250mL三角瓶)，然后将其置于恒温摇床(转速180rpm，温度为37℃)振荡培养24h后即得种子液；

其中，种子培养基(115℃灭菌30min)的组分为：蔗糖20.0g、硝酸钠1.0g、KH

(S3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11好氧生产脂肽：将步骤(S2)制备得到的种子液接种(接种量为1wt％)至好氧发酵培养基中，然后置于恒温摇床(转速180rpm，温度为37℃)振荡培养72h后即得含脂肽的好氧发酵培养液；

其中，好氧发酵培养基(115℃灭菌30min)的组分为：蔗糖20.0g、硝酸钠1.0g、KH

(S4)将步骤(S3)得到的含脂肽的好氧发酵培养液于8000rpm下离心10min，离心后弃菌体保留上清液，在上清液中加入6mol/L盐酸至pH小于2，4℃静置12h后，再次离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥(0℃，5min)对沉淀进行干燥后，得脂肽混合物。

(S5)脂肽混合物的提纯：将步骤(S4)得到的脂肽混合物加入乙酸乙酯中萃取三次后合并有机相，然后70℃旋蒸烘干有机相，得到的固体即为提纯后的脂肽产物。

(S6)称取5mg步骤(S5)得到的脂肽产物溶解于甲醇溶液中利用电喷雾质谱分析鉴定为surfactin。

其产物图谱如图2所示。

实施例3

本实施例提供实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11在厌氧条件下生产脂肽的方法。

(S1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11的活化：通过接种环将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11划线于活化固体培养基上，并置于恒温培养箱中37℃培养12h，得到活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11；

其中，活化固体培养基(115℃灭菌30min)的组分为：酵母粉5wt％，蛋白胨10wt％，氯化钠10wt％，琼脂2wt％，以蒸馏水配制，pH为7.2。

(S2)种子液的制备：选取步骤(S1)得到的活化的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ME11的单菌落接种于盛装有种子培养基的三角瓶中(培养基装量50mL/250mL三角瓶)，然后将其置于恒温摇床(转速180rpm，温度为37℃)振荡培养24h后即得种子液；

其中，种子培养基(115℃灭菌30min)的组分为：蔗糖20.0g、硝酸钠1.0g、KH

(S3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ME11厌氧生产脂肽：将步骤(S2)制备得到的种子液在氮气保护下接种(接种量为1wt％)至厌氧发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中(转速180rpm，温度为37℃)静置培养10天后即得含脂肽的厌氧发酵培养液；

其中，厌氧发酵培养基的组分为：蔗糖20.0g、NaCl 50.0g、NaNO

将厌氧发酵培养基配置好后在氮气的保护下煮沸培养基除去溶解氧后，并在氮气的保护下分装于血清瓶后用丁腈橡胶塞密封后于115℃灭菌30min。

(S4)将步骤(S3)制备得到的含脂肽的厌氧发酵培养液于8000rpm下离心10min，离心后弃菌体保留上清液，在上清液中加入6mol/L盐酸至pH小于2，4℃静置12h后，再次离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥(0℃，5min)对沉淀进行干燥后，得脂肽混合物。

(S5)脂肽混合物的提纯：将步骤(S4)得到的脂肽混合物加入乙酸乙酯中萃取三次后合并有机相，然后70℃旋蒸烘干有机相，得到的固体即为提纯后的脂肽产物。

(S6)称取5mg步骤(S5)得到的脂肽产物溶解于甲醇溶液中利用电喷雾质谱分析鉴定为surfactin，其产物图谱如图3所示。

通过图1和图2可以发现，好氧和厌氧条件下ESI-MS质谱分析结果显示均存在质荷比(m/z)值为978.6、992.6、1006.6、1020.7、1034.7和1048.7与C11surfactin[M-H]

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的解释，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。