用于高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品及其制备方法和用途。

背景技术

宫颈癌是影响全球妇女的第四大常见癌症。人乳头瘤病毒(HPV)导致了几乎所有的宫颈癌病例，并导致了其他几种癌症，包括：阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌，包括舌根和扁桃体。HPV有200多种类型，根据其致癌潜力分为低危型和高危型。最常见的高危HPV亚型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。16型和18型约占宫颈癌的70％，16、18、45、31、33、52、58和35型是已知的导致全球宫颈癌的常见HPV类型。在高危HPV类型中，16型和18型是最常见和致癌的，这两种HPV类型共导致了大约70％的宫颈癌病例。大约有40种HPV基因型别感染生殖器上皮，其中约三分之一是致癌的。虽然大多数HPV感染是短暂的，但持续的高危HPV感染可能会导致宫颈细胞学的肿瘤性变化，有可能导致宫颈癌。

对于HPV感染情况的确认，目前主要依赖于HPV基因检测。与检测高级别宫颈病变的细胞学检测相比，HPV基因检测可以确定妇女有患宫颈浸润性前期病变和随后的浸润性癌症的风险，同时降低了宫颈细胞学评估固有的主观性。人乳头瘤病毒基因检测在检测宫颈侵袭前高度病变方面显示出更高的敏感性。由于HPV基因检测产品均是基于临床进行使用的，在其研发、临床样品检测等方面都需要参考品的参与，合理参考品是非常重要的。如果参考品的设置不合理或者存在缺陷，那就会造成整个产品的原材料选择、生产工艺的确定和反应体系的组成均存在较大的问题，导致产品的质量不能达到临床使用的安全性和有效性，容易在临床检测过程中出现错误结果而影响临床的诊断和治疗。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品及其制备方法和用途，用于填补现有技术的空白。

一种制备高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品的方法，所述方法包括以下步骤：

1)制备含有高危型人乳头瘤病毒基因的质粒；

2)将质粒转染至人卵巢癌细胞系中并培养；

3)筛选得到稳转细胞系；

4)单细胞克隆筛鉴定确认获得的细胞系为目的细胞系。

进一步地，所述高危型人乳头瘤病毒包括HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、或HPV82中的至少一种或几种。

进一步地，所述人卵巢癌细胞系为SKOV3细胞系。

进一步地，所述高危型人乳头瘤病毒基因组两端添加有酶切位点，5’端的酶切位点为BamH I，3’端的酶切位点为EcoR I。

进一步地，所述质粒可以为本领域常用的质粒，例如pcDNA3.1。

进一步地，所述转染的方法为用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine

进一步地，所述步骤4)单细胞克隆筛鉴定方法包括以下步骤：

a.转染后48h，将培养基换成包含氨苄西林抗生素的G418培养基，筛选稳定转染株；

b.用胰蛋白酶制备单细胞悬液，待细胞变圆，开始脱落时，加入含胰蛋白酶抑制剂的培养基终止消化，分散细胞；

c.细胞计数，将细胞悬液稀释至1×10

d.接种3个平皿，每个平皿中5ml培养基含末次稀释浓度的细胞，将培养皿放在透明的塑料盒中，将塑料盒放置于湿润的CO

e.静置培养一周有集落形成后克隆筛选，取部分细胞进行扩增及测序鉴定，其余细胞扩大培养备用。

进一步地，所述步骤4)中采用的鉴定引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1-108。

本发明的另一方面提供了上述方法制备的高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品。

本发明的另一方面提供了上述高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品在制备诊断HPV感染产品中的用途。

如上所述，本发明的用于高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的阳性质控品及其制备方法和用途，具有以下有益效果：

高危型HPV基因分型检测阳性质控品是通过将含有高危型HPV全基因组序列的分型质粒转染至SKOV3人卵巢癌细胞系中，随后药物筛选得到的稳转细胞系单细胞克隆筛选及鉴定，获得含有高危型HPV全基因组序列的SKOV3单克隆稳转细胞系，即高危型HPV基因分型检测阳性质控品。所得阳性质控品遗传背景稳定，接近临床样本，性能稳定，可以长时间保存，并且生产成本低，可大规模生产，无生物传染性。

本发明中的高危型HPV基因分型检测阳性质控品平台兼容性强，适用性广，适用于所有不同的高危型HPV基因分型检测，包括PCR-荧光探针法、PCR-反向点杂交法、PCR-毛细管电泳法等。

附图说明

图1显示为高危型HPV分型质粒示意图。

图2显示为高危型HPV16分型质粒准确性验证示意图。

图3显示为高危型HPV18分型质粒准确性验证示意图。

图4显示为高危型HPV26分型质粒准确性验证示意图。

图5显示为高危型HPV31分型质粒准确性验证示意图。

图6显示为高危型HPV33分型质粒准确性验证示意图。

图7显示为高危型HPV35分型质粒准确性验证示意图。

图8显示为高危型HPV39分型质粒准确性验证示意图。

图9显示为高危型HPV45分型质粒准确性验证示意图。

图10显示为高危型HPV51分型质粒准确性验证示意图。

图11显示为高危型HPV52分型质粒准确性验证示意图。

图12显示为高危型HPV53分型质粒准确性验证示意图。

图13显示为高危型HPV56分型质粒准确性验证示意图。

图14显示为高危型HPV58分型质粒准确性验证示意图。

图15显示为高危型HPV59分型质粒准确性验证示意图。

图16显示为高危型HPV66分型质粒准确性验证示意图。

图17显示为高危型HPV68分型质粒准确性验证示意图。

图18显示为高危型HPV73分型质粒准确性验证示意图。

图19显示为高危型HPV82分型质粒准确性验证示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：以HPV-16为例制备用于HPV-16的阳性质控品

1、构建HPV-16分型质粒

(1)在Genbank获取HPV-16全基因组DNA序列信息，合成序列两端添加酶切位点(5-BamH I，3-EcoR I)。

(2)将HPV-16全基因组连接至表达载体上，所用表达载体名称为pCDNA3.1；抗性：Amp；酶切位点：BamH I和EcoR I，连接完HPV-16全基因组序列后的重组载体的名称为pCDNA3.1-HPV(16)，抗性为Amp。

具体连接方法如下：

a.同步双酶切：将pCDNA3.1载体和HPV-16全基因组序列分别用BamH I和EcoR I两种内切酶在37℃酶切1小时；

b.连接反应：配置20μL连接体系，酶切产物和载体的比例为9：1，室温连接反应1小时；

c.转染：用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine

2、单细胞克隆筛选及鉴定，构建HPV-16全基因组序列的稳转细胞系

a.转染后48h，将培养基换成包含氨苄西林抗生素的G418培养基，筛选稳定转染株；

b.用胰蛋白酶制备单细胞悬液，待细胞变圆，开始脱落时，加入含胰蛋白酶抑制剂的培养基终止消化，分散细胞；

c.细胞计数，将细胞悬液稀释至1×10

d.接种3个平皿，每个平皿中5ml培养基含末次稀释浓度的细胞，将培养皿放在透明的塑料盒中，将塑料盒放置于湿润的CO

e.静置培养一周有集落形成后克隆筛选，取部分细胞进行扩增及测序鉴定，其余细胞扩大培养备用。

实施例2用于不同高危型HPV基因检测阳性质控品的制备

利用实施例1所述HPV-16质控品的制备方法，合成不同高危型HPV亚型的全基因组序列，如HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82的全基因组序列，构建得到相应的高危型HPV基因检测阳性质控品。

表1细胞克隆鉴定引物

实施例3性能验证实验

(1)参考品制备

对实施例1构建的HPV-16参考品细胞系进行复苏，传代培养，收集足量细胞制备参考品，-20℃及以下冷冻存储。

(2)精密度验证

采用PCR-荧光探针法原理的检测试剂盒，取2个水平标本，短时间内连续重复测定20次，要求批内精密度变异系数(CV，％)值小于5.0％，目标基因的CT值范围在20-30之间；分别取5份标本，冻存于-20℃冰箱内，分别测定2批次，每批次测2遍，2次间隔大于2小时，连续测定5天，要求批间精密度CV值小于5.0％，目标基因的CT值范围在20-30之间。

(3)准确性验证

采用PCR-反向点杂交法等其他原理的试剂盒，取3个标本，每个标本重复检测3次，要求检测试剂盒检测范围内高危型HPV多个型别参考品反应结果一致，并且均达到阳性要求。

①人乳头瘤病毒(23个型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

②人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)

HPV分型膜上共有23种HPV亚型，设有生物素及内对照点质控点，根据膜条HPV分型分布图判断阳性点，确定HPV亚型。杂交结果中以“+”表示各阳性结果的深浅程度，“+++”表示深浅正常；“++”表示相对较浅；“+”表示相对过浅，“-”表示阴性结果。

按照厂家说明书中方法检测参考品，每亚型检测10份，每份检测1次，统计结果。

(4)检测结果

1)参考品荧光结果

HPV-16参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-16参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表2批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.99220/25.503)×100％＝3.8905％

CV(HPV-16)＝标准差/平均值＝(0.58268/25.731)×100％＝2.2645％

表3批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.20937/25.188)×100％＝4.8014％

CV(HPV-16)＝标准差/平均值＝(0.69230/25.372)×100％＝2.7286％

HPV-18参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-18参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表4批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.81810/25.253)×100％＝3.2396％

CV(HPV-18)＝标准差/平均值＝(0.57904/24.960)×100％＝2.3199％

表5批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.77790/25.531)×100％＝3.0469％

CV(HPV-18)＝标准差/平均值＝(0.57489/24.859)×100％＝2.3126％

HPV-26参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-26参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表6批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.88880/26.112)×100％＝3.4038％

CV(HPV-26)＝标准差/平均值＝(0.48500/25.243)×100％＝1.9213％

表7批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.21561/25.563)×100％＝4.7554％

CV(HPV-26)＝标准差/平均值＝(0.66340/24.781)×100％＝2.6770％

HPV-31参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-31参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表8批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.97805/25.291)×100％＝3.6299％

CV(HPV-31)＝标准差/平均值＝(0.36077/25.210)×100％＝1.4311％

表9批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.97835/25.681)×100％＝3.8096％

CV(HPV-31)＝标准差/平均值＝(0.50991/24.876)×100％＝2.0498％

HPV-33参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-33参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表10批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.78733/25.465)×100％＝3.0918％

CV(HPV-33)＝标准差/平均值＝(0.32723/25.059)×100％＝1.3058％

表11批内精密度ICct值和参考品ct值

/>

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.99207/25.678)×100％＝3.8635％

CV(HPV-33)＝标准差/平均值＝(0.42657/25.206)×100％＝1.6923％

HPV-35参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-35参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表12批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.78288/26.008)×100％＝3.0102％

CV(HPV-35)＝标准差/平均值＝(0.63402/25.075)×100％＝2.5285％

表13批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.96525/25.813)×100％＝3.7394％

CV(HPV-35)＝标准差/平均值＝(0.43807/25.088)×100％＝1.7461％

HPV-39参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-39参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表14批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.83306/25.571)×100％＝3.2578％

CV(HPV-39)＝标准差/平均值＝(0.45568/24.822)×100％＝1.8358％

表15批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.83405/25.189)×100％＝3.3111％

CV(HPV-39)＝标准差/平均值＝(0.54560/24.769)×100％＝2.2027％

HPV-45参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-45参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表16批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.96993/25.488)×100％＝3.8055％

CV(HPV-45)＝标准差/平均值＝(0.54614/25.067)×100％＝2.1787％

表17批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.76930/25.308×100％＝3.0397％

CV(HPV-45)＝标准差/平均值＝(0.53839/24.888)×100％＝2.1632％

HPV-51参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-51参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表18批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.94954/25.629)×100％＝3.7050％

CV(HPV-51)＝标准差/平均值＝(0.39763/24.433)×100％＝1.6274％

表19批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.86436/26.024)×100％＝3.3214％

CV(HPV-51)＝标准差/平均值＝(0.41304/24.950)×100％＝1.6555％

HPV-52参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-52参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表20批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.80355/25.394)×100％＝3.1643％

CV(HPV-52)＝标准差/平均值＝(0.50846/24.932)×100％＝2.0394％

表21批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.05974/25.457)×100％＝4.1629％

CV(HPV-52)＝标准差/平均值＝(0.52864/24.858)×100％＝2.1266％

HPV-53参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-53参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表22批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.93285/25.213)×100％＝3.6999％

CV(HPV-53)＝标准差/平均值＝(0.52383/25.018)×100％＝2.0938％

表23批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.98094/25.675)×100％＝3.8206％

CV(HPV-53)＝标准差/平均值＝(0.43172/24.843)×100％＝1.7378％

HPV-56参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-56参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表24批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.89866/25.149)×100％＝3.5733％

CV(HPV-56)＝标准差/平均值＝(0.43720/24.629)×100％＝1.7751％

表25批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.00277/25.593)×100％＝3.9182％

CV(HPV-56)＝标准差/平均值＝(0.38705/24.675)×100％＝1.5686％

HPV-58参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-58参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表26批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.77960/25.330)×100％＝3.0778％

CV(HPV-58)＝标准差/平均值＝(0.46450/25.427)×100％＝1.8268％

表27批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.71603/25.724)×100％＝2.7835％

CV(HPV-58)＝标准差/平均值＝(0.44010/24.600)×100％＝1.7890％

HPV-59参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-59参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表28批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.78192/25.916)×100％＝3.0171％

CV(HPV-59)＝标准差/平均值＝(0.47275/25.067)×100％＝1.8859％

表29批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.13875/25.577)×100％＝4.4523％

CV(HPV-59)＝标准差/平均值＝(0.47703/24.954)×100％＝1.9116％

HPV-66参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-66参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表30批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.91358/25.671)×100％＝3.5588％

CV(HPV-66)＝标准差/平均值＝(0.50134/24.925)×100％＝2.0114％

表31批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.81218/25.220)×100％＝3.2204％

CV(HPV-66)＝标准差/平均值＝(0.38908/24.635)×100％＝1.5794％

HPV-68参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-68参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表32批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.95561/25.385)×100％＝3.7645％

CV(HPV-68)＝标准差/平均值＝(0.38547/24.241)×100％＝1.5902％

表33批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(1.07169/25.730)×100％＝4.1651％

CV(HPV-68)＝标准差/平均值＝(0.50772/24.966)×100％＝2.0337％

HPV-73参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-73参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表34批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.99073/25.339)×100％＝3.9099％

CV(HPV-73)＝标准差/平均值＝(0.49288/24.882)×100％＝1.9809％

表35批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.97954/25.281)×100％＝3.8746％

CV(HPV-73)＝标准差/平均值＝(0.48779/24.841)×100％＝1.9637％

HPV-82参考品的Ct值结果如下表所示。结果表明，所研制的HPV-82参考品检测结果，Ct值偏差小，无特异性扩增，批内精密度和批间精密度均达到要求。

表36批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.97387/25.415)×100％＝3.8319％

CV(HPV-82)＝标准差/平均值＝(0.50717/25.042)×100％＝2.0253％

表37批内精密度ICct值和参考品ct值

CV(IC)＝标准差/平均值＝(0.86035/25.656)×100％＝3.3534％

CV(HPV-82)＝标准差/平均值＝(0.44811/24.587)×100％＝1.8225％

2)参考品杂交结果

HPV-16参考品的杂交结果如下表所示，结果表明，10组结果一致，颜色清晰可辨，且无其他杂点，参考图2，表明HPV-16参考品的准确性达到要求。另外其他类型参考图3-19。

表38反向杂交法实验结果

对上述结果进行分析可知：

(a)采用PCR-荧光探针法原理的检测试剂盒，批内精密度和批间精密度符合Ct值的CV小于5％。

(b)采用PCR-反向点杂交法等其他原理的试剂盒，HPV-16反应结果一致，均为阳性。

由上述结果可知，本发明所述高危型HPV阳性质控品符合精密度要求和准确性要求，并且适用于不同的检测体系。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。