用于半固体样品致病菌的双富集采样装置及快速检测方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，更具体的是涉及一种用于发酵乳(半固体)样品中致病菌双富集方式样品采样及检测的装置技术领域。

背景技术

食品安全问题关系到每个人的健康，故对其进行检测意义重大。而要做好检测，样品前处理是关键。食品安全是现在我国乃至世界各国都极为关注的一个重大问题，而致病菌污染食品引起的食源性疾病是影响食品安全的主要问题之一。目前中国食品安全检测工作特别是食品致病菌的快速检测技术的研究尚处于起步阶段，食品致病菌的法定检测方法大多还采用比较传统的检测技术。传统食品致病菌检测技术耗时较长，灵敏度、特异性都有待进一步提高。

通常对于食源性致病菌的检测与鉴别分型，经典的生物化学方法是采用菌体培养法结合大量生化实验而进行表型鉴定，这种传统方法繁琐费时，且分辨力低，已不能很好地满足细菌感染诊断和流行病学溯源的需要。随着分子生物学技术的发展，16SrRNA测序在细菌分类鉴定中得到发展和应用，但只能局限于种、属的水平上的鉴别，而且该方法的成本高于经典生化方法，耗时超过24h。遗传病学研究中通常使用的生物分型技术如，脉冲场凝胶电泳(PFGE)、扩增片段长度多态性技术(AFLP)、重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)以及多位点测序(MLST)等技术虽然能够提供准确的分型鉴定，但是这些方法同样具有耗时长、成本高、操作繁琐等弊端，而且还要求具备经验丰富的技术人员。鉴于此，目前迫切地需要一种更为快速、简便、经济的致病菌的检测与鉴别分型方法以便更好地适应食源性致病菌的控制预防、临床诊断和溯源追踪的需要。

另外，由于致病菌在食品中浓度低，甚至为痕量。为了提高检测处理效率，首先通过膜过滤收集微生物，再通过极性磁珠实现微生物的特异富集与鉴别，提高致病菌的检测限与检测效率。这些极性磁珠应用广泛，主要是通过在纳米Fe

发明内容

本发明的目的在于：为了解决现有国标方法(GB 19302-2010)培养周期耗时长，操作复杂，检测步骤多的技术问题，提供一种用于半固体样品致病菌的双富集采样装置及快速检测方法，通过开发一种集膜过滤、破壁、富集、检测与鉴别为一体快速鉴别致病菌的装置，其利用特意修饰的极性磁珠，对发酵乳中沙门氏菌和阪崎肠杆菌进行快速菌体富集、微波破壁和DNA纯化，然后利用LAMP技术对其进行快速检测和鉴别。

为了实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种用于半固体样品中致病菌的双富集采样装置，包括可分体的第一盖体、过滤瓶身、弹性腔、第二盖体、第三盖体，所述第一盖体的上侧开设有通气孔，所述第一盖体的内部贯穿连接有挤压装置，所述过滤瓶身的内侧固定设置有滤膜，所述滤膜为聚丙烯膜、混合膜和尼龙膜中的一种或多种，所述过滤瓶身的下端与弹性腔之间可拆卸连接有安装装置，所述第三盖体的内部贯穿安装有破碎装置，所述破碎装置包括有依次固定连接的下压把手、下压轴、刀头，所述下压轴与第三盖体活动贯穿连接，所述刀头位于第三盖体的内部，所述下压轴的外侧活动套接有回刀弹簧和套筒，所述回刀弹簧位于下压把手和第三盖体之间，所述套筒位于第三盖体与刀头之间，所述套筒的顶部与第三盖体的内侧固定连接，所述套筒的内壁开设有螺纹槽，所述下压轴的外壁镶嵌有滚珠，所述滚珠位于螺纹槽的内部。

一种用于半固体样品中致病菌的采样及快速检测方法，包括以下步骤：

(1)第一次富集：利用最优的滤膜组合方式快速富集发酵乳中致病菌，并辅助微波破壁。

(2)第二次富集：利用特意修饰的极性磁珠，对发酵乳中沙门氏菌和阪崎肠杆菌进行快速菌体富集、微波破壁和DNA纯化。

优选的，双富集采样装置的使用过程：

S1.安装取样器：过滤瓶身的下端与弹性腔通过安装装置安装；

S2.前置处理半固体样品：半固体样品置入过滤瓶身中，将第三盖体与过滤瓶身上端安装，具体连接方式可为螺纹连接，通过下压把手带动下压轴上下移动，移动过程中滚珠在螺纹槽中移动，进而带动下压轴转动，当刀头下移至最底部时回刀弹簧自然伸长并带动刀头向上旋转移动，进而反复下压破碎装置并由旋转的刀头对过滤瓶身中的半固体样品进行破碎，破碎后的溶液通过过滤瓶身中的滤膜过滤，进而使液体进入弹性腔，固体杂质留在过滤瓶身中；

S3.膜富集：将使用后的第三盖体和过滤瓶身拆除，留下盛装样品液体的弹性腔，再将第一盖体、新的过滤瓶身与S1步骤中弹性腔安装，然后通过上下移动挤压装置对瓶身中的破碎后的溶液反复挤压，由于弹性腔采用橡胶、硅胶等弹性耐磨材质，因此当挤压装置反复挤压样品时，其中液体也反复经过滤膜，进而在滤膜上留下致病菌，完成膜富集工作；

S4.洗脱膜：拆卸并丢弃S3步骤中使用后的第一盖体、腔体，留下具有致病菌的过滤瓶身，再重新更换新的第一盖体和腔体，在过滤瓶身中加入洗脱溶剂，重复膜富集步骤的方法对滤膜上的致病菌进行洗脱，洗脱后的致病菌溶液留在弹性腔内，完成洗脱工作；

S5.磁珠富集：拆卸并丢弃S4步骤中使用后的第一盖体、过滤瓶身，留下盛装具有致病菌溶液的弹性腔及安装装置，再将磁珠富集溶液加入弹性腔内，最后使第二盖体与安装装置连接并进行振荡磁珠富集工作。

(4)选择引物组合物：用于发酵乳产品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的引物组合物，包括检测检测阪崎肠杆菌OmpA基因的引物，所述检测阪崎肠杆菌ompA基因SEQ ID No.1，所述引物包括SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；检测沙门氏菌invA基因的引物，所述检测沙门氏菌invA基因SEQ ID No.4，所述引物包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。

(5)建立SEA扩增体系：提取的基因组DNA加入到恒温检测的反应体系中，利用SEA法检测，判读是否检出致病菌；反应体系中添加了以上所述的引物组合物；反应体积为25uL，各反应组分如：引物F和R，浓度分别是1.0×10

(6)SEA扩增：对上述体系进行SEA扩增，反应条件如下：温度62℃，时间60min。

本发明的有益效果如下：

1.本发明利用不同孔径和材质的滤膜先富集发酵乳中的细菌菌体，另外，经过修饰的极性磁珠可以特异的吸附沙门氏菌/阪崎肠杆菌DNA并纯化，可直接应用于后续的扩增。同时，SEA检测简单快速，具有灵敏度高、特异性强、速度快、设备简单等优点,因此该方法开发和利用对于致病菌检测与食品安全具有重要意义。

2.本发明提供的发酵乳样品中微生物的富集主要是利用微孔滤膜和极性磁性颗粒双富集性能，致病菌采样装置通过设置可分体的三种盖体、过滤瓶身、弹性腔，可在外出时方便携带与采样，具有前置处理半固体样品的特点，同时可完成膜富集方法和磁珠富集方法，从而达到紧急情况下的快速检测效果。

附图说明

图1是本发明验证的特异性结果图；

图2是本发明验证的灵敏度结果图；

图3是本发明对样本验证的重复性结果图；

图4是本发明采样装置中膜富集和洗脱模结构的剖面图；

图5是本发明的第三盖体和破碎装置的剖面图；

图6是图2的A处示意图；

图7是本发明的第一盖体、过滤瓶身和弹性腔的分体图；

图8是本发明的弹性腔和第二盖体的分体图。

附图标记：1、第一盖体；101、通气孔；2、挤压装置；3、过滤瓶身；301、滤膜；4、安装装置；5、弹性腔；6、第二盖体；7、第三盖体；8、破碎装置；801、下压把手；802、下压轴；803、回刀弹簧；804、套筒；8041、螺纹槽；805、滚珠；806、刀头。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-8，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

SEA扩增体系的建立

反应体系为总体积为25μL，其中引物F和R，浓度分别是1.0×10-6M，体系中还包含dNTPs，浓度为5.0×10-4M，0.5×EvaGreen，1×Bst Buffer，0.8U Bst 2.0DNA聚合酶，所述等温扩增的反应条件为：62℃60min。

表1基因序列表

样品的处理

样品采用人工污染的方式。半固体样品：每份样品称取25g，加入到225mL无菌生理盐水中，再加入1mL的浓度为1.0×10

S1.安装取样器：过滤瓶身3的下端与弹性腔5通过安装装置4安装；

S2.前置处理半固体样品：半固体样品置入过滤瓶身3中，将第三盖体7与过滤瓶身3上端安装，具体连接方式可为螺纹连接，通过下压把手801带动下压轴802上下移动，移动过程中滚珠805在螺纹槽8041中移动，进而带动下压轴802转动，当刀头806下移至最底部时回刀弹簧803自然伸长并带动刀头806向上旋转移动，进而反复下压破碎装置8并由旋转的刀头806对过滤瓶身3中的半固体样品进行破碎，破碎后的溶液通过过滤瓶身3中的滤膜301过滤，进而使液体进入弹性腔5，固体杂质留在过滤瓶身3中；

S3.膜富集：将使用后的第三盖体7和过滤瓶身3拆除，留下盛装样品液体的弹性腔5，再将第一盖体1、新的过滤瓶身3与S1步骤中弹性腔5安装，然后通过上下移动挤压装置2对瓶身中的破碎后的溶液反复挤压，由于弹性腔5采用橡胶、硅胶等弹性耐磨材质，因此当挤压装置2反复挤压样品时，其中液体也反复经过滤膜301，进而在滤膜上留下致病菌，完成膜富集工作；

S4.洗脱膜：拆卸并丢弃S3步骤中使用后的第一盖体1、弹性腔5，留下具有致病菌的过滤瓶身3，再重新更换新的第一盖体1和弹性腔5，在过滤瓶身3中加入洗脱溶剂，重复膜富集步骤的方法对滤膜301上的致病菌进行洗脱，洗脱后的致病菌溶液留在弹性腔5内，完成洗脱工作；

S5.磁珠富集：拆卸并丢弃S4步骤中使用后的第一盖体1、过滤瓶身3，留下盛装具有致病菌溶液的弹性腔5及安装装置4，再将磁珠富集溶液加入弹性腔5内，最后使第二盖体6与安装装置4连接并进行振荡磁珠富集工作。

滤膜的选择

准备滤膜：聚丙烯膜10μm、20μm、40μm、60μm；混合膜0.22μm、0.45μm；尼龙膜15μm、40μm、60μm。取约10

特异性实验

实验采用阪崎肠杆菌、沙门氏菌，阴性对照和其他干扰实验菌株。其中干扰组实验菌株为：苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌。用反应体系和扩增方法对上述标准菌株和实验菌株进行特异性实验，以此来验证SEA方法的特异是否满足检测要求。结果如图1所示，仅阪崎肠杆菌、沙门氏菌有扩增曲线，其余干扰菌株均无扩增曲线，方法特异性好，双富集采样制样装置富集时间短，结果准确。

灵敏性实验

分别通过人工污染样品与阳性质粒样品对恒温扩增灵敏度进行检测。选取制备好的样品稀释至1.0×10

重复性实验

将含有2种菌发酵乳类半固体样品作为实验材料，其浓度为1×10

以此双富集装置对半固体样品中的致病菌进行富集，本装置可以有效提高对食源性致病菌的检测效果，并且操作简单、成本低以及便于携带，为多种致病菌防控的现场即时检验(POCT)提供技术支持。