一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体的说是一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

蝴蝶兰植物有重要的观赏价值和经济价值，但是近年来随着蝴蝶兰植物贸易的增加，加速了病毒病等的发生和蔓延。建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CyMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,ORSV)、白三叶草花叶病毒(White clovermosaicvirus,WCMV)、淮山药X病毒(Yammosaic virus,YaVX)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PoVX)是危害蝴蝶兰的五种主要病毒。病毒病能使叶片形成褪色斑、坏死斑、花叶斑等症状，致使蝴蝶兰植株生长不良、叶片无光泽、花朵质量下降，甚至植株死亡，降低了蝴蝶兰的观赏价值和经济价值，给蝴蝶兰的生产企业带来严重的经济损失。

目前国际上对蝴蝶兰病毒病还未有防治的有效药剂，因此在蝴蝶兰病毒病的防治过程中，多采用早发现，早隔离的防治措施，但蝴蝶兰病株早期通常只有轻微的症状表现，或根本不表现病症，通过单纯的症状观察已经无法有效防治蝴蝶兰的病毒病。目前，植物病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术(即ELISA方法)，但抗血清价格高、且一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，在一定程度上还会存在假阳性反应、检测灵敏性低的问题。近年来，为了提高病毒检测效率，RT-PCR和mRT-PCR等基于PCR技术的病毒检测技术正在迅速发展，与单重逆转录PCR检测方法相比，多重逆转录PCR检测技术具有可同时检测多种病毒，操作简单，检测时间短、成本低的优点，因此备受关注。

CyMV、ORSV、WCMV、YaVX以及PoVX均是RNA单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，且本发明所要检测的WCMV、YaVX以及PoVX与现有技术对应已知病毒序列的同源性低至80％，存在较大变异。因此，利用多重实时荧光定量PCR技术检测其难点在于保守序列的选择和引物组合的设计以及检测体系的优化。然而目前仅存在文献号为：CN 104372108 B，发明名称为：一种文心兰病毒检测引物及方法的现有技术，仅涉及CyMV、ORSV的检测，样品稀释10

因此，如何提供检测灵敏度高，且同步检测CyMV、ORSV、WCMV、YaVX以及PoVX的mRT-PCR特异性引物组，以及检测方法，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的引物组、试剂盒及其应用。可同时检测CyMV、ORSV、WCMV、YaVX以及PoVX五种蝴蝶兰中的主要致病病毒，具有检测效率高、成本低，检测灵敏度高的优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的引物组，包括如下5组引物对：

建兰花叶病毒正向引物F1：5'-AGTCTCAACCTGACGTGGAG-3'，SEQ ID NO.1，

建兰花叶病毒反向引物F2：5'-GGGGAAGCGGTGAATATTA-3'，SEQ ID NO.2；

齿兰环斑病毒正向引物F3：5'-TATGACAAATCCCAGAACGA-3'，SEQ ID NO.3，

齿兰环斑病毒反向引物F4：5'-GCAAATAGAAACAAACTCCA-3'，SEQ ID NO.4；

白三叶草花叶病毒正向引物F5：5'-GTTGTGCTCCCTGTTGAA-3'，SEQ ID NO.5，

白三叶草花叶病毒反向引物F6：5'-GTCCCAAATGGATAAGGATAG-3'，SEQ ID NO.6；

淮山药X病毒正向引物F7：5'-GGCAGAATCTATTGGAAAAA-3'，SEQ ID NO.7，

淮山药X病毒反向引物F8：5'-CCATGAATGACTAAGGGAAG-3'，SEQ ID NO.8；

马铃薯X病毒正向引物F9：5'-GAGGGTCCCACTTTTGATGC-3'，SEQ ID NO.9，

马铃薯X病毒反向引物F10：5'-CAAGCGGTTGGTGATTTTAT-3'，SEQ ID NO.10。

本发明的另一目的在于提供上述引物组在制备鉴定蝴蝶兰病毒基因产品中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的检测试剂盒，包括上述引物组。

优选的，所述试剂盒，还包括Taq酶、Taq酶buffer、dNTPs。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的检测方法，采用检测多种蝴蝶兰病毒的引物组或检测多种蝴蝶兰病毒的试剂盒，对待检测病毒进行mRT-PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的大小判断病毒的有无。

优选的，所述mRT-PCR反应体系的组成如下：

反应体系的总体积为50μL，含有0.3μL 5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL 2.5mmol/L的dNTPs、1μL 20ng/μL的模板、0.2-0.4μL的建兰花叶病毒正向引物、0.2-0.4μL的建兰花叶病毒反向引物、1-2.5μL的齿兰环斑病毒正向引物、1-2.5μL的齿兰环斑病毒反向引物、0.5-2μL的白三叶草花叶病毒正向引物、0.5-2μL的白三叶草花叶病毒反向引物，1.5-3.5μL的淮山药X病毒正向引物、1.5-3.5μL的淮山药X病毒反向引物，1-3μL的马铃薯X病毒正向引物、1-3μL的马铃薯X病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水。

优选的，所述mRT-PCR反应体系中所有正向引物和反向引物加入反应体系前的初始浓度均为10μmol/L，且反应体系中每对引物中的正向引物和反向引物的浓度均相等。

优选的，所述mRT-PCR反应体系中建兰花叶病毒正向引物和反向引物的终浓度均为0.04-0.08μmol/L；齿兰环斑病毒正向引物和反向引物的终浓度均为0.2-0.5μmol/L；白三叶草花叶病毒正向引物和反向引物的终浓度均为0.1-0.4μmol/L；淮山药X病毒正向引物和反向引物的终浓度均为

0.3-0.7μmol/L；马铃薯X病毒正向引物和反向引物的终浓度均为

0.2-0.6μmol/L。

优选的，所述mRT-PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，48-56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。

优选的，当出现908bp大小的电泳条带时，说明检测样品中含有建兰花叶病毒；当出现1156bp大小的电泳条带时，说明检测样品中含有齿兰环斑病毒；当出现561bp大小的电泳条带时，说明检测样品中含有白三叶草花叶病毒；当出现292bp大小的电泳条带时，说明检测样品中含有淮山药X病毒；当出现162bp大小的电泳条带时，说明检测样品中含有马铃薯X病毒。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明针对CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX五种病毒的小RNA测序序列，分别设计合成了五对相应的特异性引物对，并利用该五对引物对同时对蝴蝶兰叶片中的CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX进行mRT-PCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，得到了大小差异明显，长度分别为908bp、1156bp、561bp、292bp和162bp的五条CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX的扩增片段序列，实现了一次反应就能同时检测出5种蝴蝶兰病毒的目标，具有检测效率高、成本低，检测灵敏度高的优点。

(2)且本发明所检测的WCMV、YaVX和PoVX与现有技术对应的序列同源性低至52-76％，是现有技术中并不存在的新型变异毒株，而本发明提供的引物组却可以有效鉴别出上述变异毒株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1：本发明实施例2中1％琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DNA标准DL2000；1:ORSV；2:CyMV；3:WCMV；4:YaVX；5:PoVX；6:阴性对照；7:ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX；

图2：本发明实施例4中1％琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的引物组，包括如下5组引物对：

建兰花叶病毒正向引物F1：5'-AGTCTCAACCTGACGTGGAG-3'，SEQ ID NO.1，

建兰花叶病毒反向引物F2：5'-GGGGAAGCGGTGAATATTA-3'，SEQ ID NO.2；

齿兰环斑病毒正向引物F3：5'-TATGACAAATCCCAGAACGA-3'，SEQ ID NO.3，

齿兰环斑病毒反向引物F4：5'-GCAAATAGAAACAAACTCCA-3'，SEQ ID NO.4；

白三叶草花叶病毒正向引物F5：5'-GTTGTGCTCCCTGTTGAA-3'，SEQ ID NO.5，

白三叶草花叶病毒反向引物F6：5'-GTCCCAAATGGATAAGGATAG-3'，SEQ ID NO.6；

淮山药X病毒正向引物F7：5'-GGCAGAATCTATTGGAAAAA-3'，SEQ ID NO.7，

淮山药X病毒反向引物F8：5'-CCATGAATGACTAAGGGAAG-3'，SEQ ID NO.8；

马铃薯X病毒正向引物F9：5'-GAGGGTCCCACTTTTGATGC-3'，SEQ ID NO.9，

马铃薯X病毒反向引物F10：5'-CAAGCGGTTGGTGATTTTAT-3'，SEQ ID NO.10。

实施例2

一种同时检测多种蝴蝶兰病毒的检测方法

(1)建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、白三叶草花叶病毒、淮山药X病毒和和马铃薯X病毒的小RNA测序序列，设计五对特异性引物，对所设计的五对特异性引物进行校正，证实五对引物间不存在自身匹配和竞争性扩增，以确保上述五种病毒能扩增出差异明显的特异性片段，并由上海生工生物工程有限公司合成上述五对特异性引物。

(2)取被CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX五种病毒侵染的蝴蝶兰叶片0.2g、健康叶片0.2g，分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。

RNA提取过程如下：采用Trizol法，将0.2g蝴蝶兰带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加入液氮研磨成粉状，接着将粉状叶片置于第一离心管中，再加入1mL Trizol并剧烈震荡20～30S，然后将第一离心管置于室温下静置5min以使叶片充分裂解，接着将第一离心管于10000rpm下离心5min；将上清移至第二离心管中，往第二离心管中加入200uL氯仿，并振荡混匀，于室温下放置3min，接着在4℃、10000rpm下离心15min，然后吸取上层水相至第三离心管中，往第三离心管中加入0.5mL异丙醇混匀，并于室温下放置10min，接着将第三离心管于4℃、1000rpm条件下离心10min，并弃去上清液，则RNA沉于管底；加1mL 75％乙醇于第三离心管中并温和振荡第三离心管，得到悬浮液，再于4℃、10000rpm条件下离心5min，并弃去上清液，然后将第三离心管置于冰上晾干10min，最后用30uL DEPC处理水溶解RNA样品。

(3)将经步骤(2)处理所得的RNA反转录成cDNA

具体反转录过程如下：将反应管置于冰上，加入1uL Primer Oligo(dt)、1uL dNTP混合物(10mmol/L)、4uL DEPC处理水、4uL RNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于65℃水浴中加热5min后，立即将反应管置于冰上5min，接着将反应管稍微离心后再将反应管置于冰上，再加入4uL 5×反转录酶缓冲液、0.5uL 20U/uL的RNAase抑制剂、1uL200U/uL反转录酶、4.5uL DEPC处理水至反应管中，然后将反应管置于42℃水浴中加热60min，再将反应管置于70℃下热击10min，最后终止反应。

(4)以经步骤(3)处理所得的cDNA为模板，并以步骤(1)获得的五对引物同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。

本实施例进行了单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应，所以PCR扩增反应的反应体系包括单重PCR反应体系和多重PCR反应体系，其中，单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应的反应程序一致，但反应体系不同。

PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体内容如下：

单重PCR反应体系：反应体系的总体积为50μL，包括0.3μL 5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL 2.5mmol/L的dNTPs、1μL模板、1μL10μmol/LCyMV或ORSV或WCMV或YaVX或PoVX的正向引物、1μL10μmol/LCyMV或ORSV或WCMV或YaVX或PoVX的反向引物。

多重PCR反应体系：反应体系的总体积为50μL，含有0.3μL 5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL 2.5mmol/L的dNTPs、1μL 20ng/μL的模板、0.3μL的CyMV正向引物、0.3μL的CyMV反向引物、1.5μL的ORSV正向引物、1.5μL的ORSV反向引物、1μL的WCMV正向引物、1μL的WCMV反向引物，2.5μL的YaVX正向引物、2.5μL的YaVX反向引物，2μL的PoVX正向引物、2μL的PoVX反向引物，其余成分为灭菌双蒸水(其中，每个引物对中正向引物和反向引物的浓度均相等)。

PCR反应程序：94℃预变性5min、94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。

(5)取5μL PCR产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和120V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，实验结果如图1所示。

(6)将步骤(4)中的多重PCR反应体系得到的PCR扩增产物割胶回收，然后分别与pMD18-T simple vector(宝日医生物技术(北京)有限公司,TaKaRa)进行体外连接，再挑取阳性克隆，最后提取质粒测序，以检查CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX五种病毒的扩增结果。

结果分析：

由图1可知，ORSV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为1156bp的条带，CyMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为908bp的条带，WCMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为561bp的条带，YaVX引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为292bp的条带，WCMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为162bp的条带，由ORSV引物对、CyMV引物对、WCMV引物对、YaVX引物对、WCMV引物对五对引物参与的多重PCR扩增反应，可同时得到扩增片段长度1156bp、908bp、561bp、292bp和162bp五条明亮清晰的条带，可见，本发明可以一次性同时检测出蝴蝶兰的CyMV、ORSV、WCMV、YaVX和PoVX五种病毒，且特异性好、检测效率高。

实施例3

与实施例2不同之处在于：

步骤(4)：PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体内容如下：

多重PCR反应体系：反应体系的总体积为50μL，含有0.3μL 5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL 2.5mmol/L的dNTPs、1μL模板、0.25μL的CyMV正向引物、0.25μL的CyMV反向引物、1.5μL的ORSV正向引物、1.5μL的ORSV反向引物、1μL的WCMV正向引物、1μL的WCMV反向引物，2μL的YaVX正向引物、2μL的YaVX反向引物，2μL的PoVX正向引物、2μL的PoVX反向引物，其余成分为灭菌双蒸水；

PCR反应程序：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min、循环35次、72℃延伸10min、4℃终止反应。

其余步骤同实施例2。

结果分析：

实施例3测序结果为：ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX的扩增产物分别是由1156bp、908bp、561bp、292bp和162bp个核苷酸组成的序列：

所述ORSV扩增产物序列如SEQ ID NO：11所示；

所述CyMV扩增产物序列如SEQ ID NO：12所示；

所述WCMV扩增产物序列如SEQ ID NO：13所示；

所述YaVX扩增产物序列如SEQ ID NO：14所示；

所述PoVX扩增产物序列如SEQ ID NO：15所示。

用NCBI分析同源性结果表明：

所得的扩增产物序列SEQ ID NO：11与参考序列即ORSV的序列的同源率达到99％；

序列SEQ ID NO：12与参考序列CyMV的序列同源率达到98％；

序列SEQ ID NO：13与参考序列WCMV的序列同源率达到61％；

序列SEQ ID NO：14与参考序列YaVX的序列同源率达到52％；

序列SEQ ID NO：15与参考序列PoVX的序列同源率达到76％。

由此可见，所得的扩增产物SEQ ID NO：11-15序列分别为ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX的部分序列，从而证明了本发明检测结果的可靠性；且本研究通过小RNA测序获得的WCMV、YaVX和PoVX这三个序列，与NCBI里的同源性均小于80％，推测为新型病毒，本发明设计新型病毒引物，并成功建立了多重RT-PCR检测体系。

实施例4

本发明蝴蝶兰病毒的检测方法的灵敏度分析

对实施例3中的RNA样品进行10

结果分析：由图2可知，ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX五种病毒在样品浓度稀释10

本发明针对ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX三种病毒的小RNA测序的核苷酸序列，分别设计合成了五对相应的特异性引物，并利用该五对特异性引物同时对蝴蝶兰叶片中的ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX进行mRT-PCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，使mRT-PCR反应得到了大小差异明显，长度分别为1156bp、908bp、561bp、292bp和162bp的五条ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX的扩增片段序列，实现了一次反应就能同时检测出5种蝴蝶兰病毒即ORSV、CyMV、WCMV、YaVX和PoVX的目标，检测效率高，且本发明所用试剂为分子生物学常用试剂，所需成本低，即使样本中5种蝴蝶兰病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的检测灵敏度。

说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。