一种构建颞下颌关节骨关节炎动物模型的方法

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，具体为一种构建颞下颌关节骨关节炎动物模型的方法。

背景技术

颞下颌关节(Temporomandibular Joint,TMJ)是人体中唯一能够进行开闭口等复杂运动的关节之一，其健康状态对于维持正常的咀嚼、说话和面部表情至关重要。然而，TMJ的功能障碍，特别是颞下颌关节骨关节炎(TMJ Osteoarthritis,TMJ OA)，是一种普遍的慢性退行性疾病，影响着全球数百万人的生活质量。TMJ OA的特点包括软骨退化、骨重塑、关节炎症和疼痛，但其病理生理机制至今尚未完全阐明。

在过去，研究人员通过多种方法建立了TMJ OA的动物模型，旨在模拟人类疾病的病理特征，以便研究其发展机制和评估潜在的治疗方法。这些模型主要包括机械应力诱导模型、生物化学诱导模型以及遗传操纵动物模型。机械应力模型通常通过外科手术或机械装置引起关节的不稳定和过度负荷，模拟OA的发展过程。生物化学诱导模型则是通过局部注射破坏软骨的酶，如胶原酶或蛋白酶，来诱导关节退变。尽管这些模型为TMJ OA的研究提供了重要信息，但它们往往缺乏特定基因变异对疾病进程的影响，这在人类疾病中被认为是关键因素。

遗传操纵动物模型通过敲除或突变与OA发展相关的基因，提供了另一种研究TMJOA的方法。但是，这些模型的建立往往需要复杂的遗传操作和长时间的育种，且对特定基因功能的理解不够深入，限制了其在疾病机理研究中的应用。

CRISPR/Cas9技术的出现为精确操纵基因组提供了一种强大的工具，使得在动物模型中快速、高效地进行基因敲除、敲入或编辑成为可能。然而，尽管这项技术为解析基因功能和疾病机制提供了前所未有的机会，但其在TMJ OA模型中的应用尚不广泛，特别是在直接相关性、病理特征以及治疗应答方面的研究。

因此，现有TMJ OA模型的局限性突显了对更精确、可控的遗传操纵模型的需求，这种模型应能够更贴近人类TMJ OA的遗传和病理特征。对此，我们提出了利用CRISPR/Cas9技术构建TMJ OA动物模型的研究，旨在克服现有技术的局限，深入探讨关键基因在TMJ OA病理过程中的作用，并为开发新的治疗策略提供科学依据。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建颞下颌关节骨关节炎(TMJ OA)动物模型的方法，通过精确的基因编辑，我们能够特异性地敲除或过表达特定基因，创建可重复的TMJ OA动物模型。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种构建颞下颌关节骨关节炎动物模型的方法，包括以下步骤：

S1、选择一组与TMJ OA相关的候选基因；

S2、设计针对所述候选基因的特异性单向导向RNA(sgRNA)；这些sgRNA专门针对上述候选基因，以引导CRISPR/Cas9系统进行精确的基因编辑；

S3、构建包含所述单向导向RNA及CRISPR/Cas9系统的表达载体；

S4、通过显微注射将所述表达载体引入动物受精卵；

S5、将处理过的受精卵植入至代理动物母体中；

S6、识别并选择具有所述候选基因编辑的后代动物。

优选的，所述候选基因包括COL1A1、COL2A1、IL1、TNF、MMPs、ADAMTS、RUNX2、SMAD3、ALPL和GDF5中的至少一个；这些基因是根据它们在TMJ OA发病机制中的已知或预期作用进行选择的。

优选的，所述候选基因为COL2A1基因。

优选的，所述表达载体包括选择性标记基因以辅助筛选具有所述候选基因编辑的后代动物，这些标记基因使得筛选过程更加高效和准确。

优选的，所述动物为哺乳动物。

优选的，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠和兔，这些模型动物为进一步的TMJ OA研究提供了宝贵的生物学工具，使研究人员能够在体内环境中研究TMJ OA的病理生理学和分子生物学机制。

优选的，识别具有所述候选基因编辑的后代动物的步骤包括使用聚合酶链反应(PCR)和DNA序列分析，通过PCR和DNA序列分析等技术，可以识别具有所述候选基因编辑的后代动物。

本发明还提供颞下颌关节骨关节炎动物模型构建方法得到的颞下颌关节骨关节炎动物模型在进行颞下颌关节骨关节炎的病理机制研究的应用。

本发明还提供颞下颌关节骨关节炎动物模型构建方法得到的颞下颌关节骨关节炎动物模型在测试针对颞下颌关节骨关节炎的治疗方法有效性的应用。

本发明还提供颞下颌关节骨关节炎动物模型构建方法得到的颞下颌关节骨关节炎动物模型在进行颞下颌关节骨关节炎的药物筛选的应用。

通过本发明构建的TMJ OA动物模型，可以深入解析TMJ OA的病理机制，评估药物治疗的效果，以及开发和测试新的预防和治疗方法。这些模型的使用有助于加速TMJ OA相关治疗策略的研究和开发，对于患者的临床治疗具有重要意义。

本发明提供了一种构建颞下颌关节骨关节炎动物模型的方法。具备以下

有益效果：

本发明通过精确的基因编辑，我们能够特异性地敲除或过表达特定基因，创建可重复的TMJ OA模型，这为研究OA的分子机制提供了一个可靠的工具，可以帮助更好地理解了软骨退行性变化、炎症反应、骨重塑等在TMJ OA发展中的作用，揭示了疾病的分子基础。

附图说明

图1为本发明的方法流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：构建COL2A1基因敲除小鼠模型

在本实施例中，我们选择了COL2A1基因作为研究TMJ OA的目标基因。COL2A1是编码Ⅱ型胶原蛋白的基因，这种蛋白质在关节软骨的结构和功能中起着关键作用。

1.设计针对COL2A1基因的特异性单向导向RNA(sgRNA)。通过计算机辅助设计，筛选出靶向COL2A1基因的多个潜在sgRNA序列，并通过体外实验验证其切割效率。

2.构建包含所选sgRNA及CRISPR/Cas9系统的表达载体。利用分子克隆技术，将sgRNA序列和Cas9编码序列插入到表达载体中，并加入抗性基因以便于筛选。

3.通过显微注射将所述表达载体引入小鼠受精卵。实验室内进行显微注射操作，将构建好的表达载体注入到C57BL/6小鼠的受精卵中。

4.将处理过的受精卵植入至代理母鼠体内。经过显微注射的受精卵在体外培养至达到适合植入的阶段后，移植到已准备好的代理母鼠体内。

5.识别具有COL2A1基因敲除的小鼠后代。待后代小鼠出生后，取少量组织样本进行PCR和DNA序列分析，以确认COL2A1基因是否被成功敲除。

实施例2：使用TMJ OA小鼠模型进行药物筛选

本实施例中，我们使用了实施例1中构建的COL2A1基因敲除小鼠模型来测试针对TMJ OA的药物效果。

1.将COL2A1基因敲除小鼠随机分为药物治疗组和安慰剂对照组。

2.药物治疗组小鼠接受一种新型抗炎药物的治疗，而对照组小鼠接受等体积的安慰剂治疗。

3.定期评估小鼠的颞下颌关节功能，包括开口范围、咀嚼效率和疼痛反应等指标。

4.在治疗周期结束后，对小鼠进行解剖，分析颞下颌关节的病理变化，包括关节软骨的磨损程度和炎症状况。

5.通过以上步骤，评估所测试药物在预防或延缓TMJ OA发展中的潜在效果。

实施例3：构建ADAMTS5基因敲除小鼠模型

ADAMTS5是一种与软骨退行性相关的酶，它在退行性关节病中起重要作用。在本实施例中，我们将构建ADAMTS5基因敲除的小鼠模型，以研究其在TMJ OA中的作用。

1.设计针对小鼠ADAMTS5基因的特异性sgRNA。通过生物信息学软件筛选目标序列，并进行体外切割实验来验证sgRNA的效率。

2.构建CRISPR/Cas9系统的表达载体，将筛选出的有效sgRNA序列克隆入载体中，同时包含Cas9蛋白的编码序列。

3.利用显微注射技术将CRISPR/Cas9表达载体引入小鼠的受精卵中，并将这些受精卵植入代理母鼠体内。

4.通过分子生物学方法(如PCR和DNA测序)筛选出成功敲除ADAMTS5基因的小鼠后代。

5.对ADAMTS5基因敲除小鼠进行表型分析，以确定其颞下颌关节的形态和功能变化。

实施例4：构建IL-1β过表达小鼠模型

炎症在TMJ OA的发病机制中扮演重要角色，IL-1β是一种关键的炎症因子。在本实施例中，我们将构建IL-1β过表达的小鼠模型。

1.利用分子克隆方法，构建含有小鼠IL-1β基因的表达载体，并在其启动子区域插入特异性增强元件以提高表达量。

2.通过体外转染细胞，验证IL-1β表达载体的功能性，确保它能有效促进IL-1β的表达。

3.将表达载体注入到小鼠受精卵中，并将这些受精卵植入代理母鼠体内。

4.筛选出携带IL-1β过表达构建物的小鼠后代，并通过ELISA等免疫学方法验证IL-1β蛋白的表达水平。

5.分析IL-1β过表达小鼠的TMJ OA表型，包括颞下颌关节的炎症反应、软骨破坏情况和疼痛行为学改变。

实施例5：构建MMP-13基因敲除小鼠模型

MMP-13(基质金属蛋白酶-13)在软骨降解和关节炎发展中扮演重要角色。在本实施例中，我们构建MMP-13基因敲除的小鼠模型来研究其对TMJ OA进程的影响。

1.设计针对MMP-13基因的特异性sgRNA，使用在线工具筛选目标位点，并通过体外实验验证其编辑效率。

2.构建CRISPR/Cas9载体，将选定的sgRNA和Cas9 nuclease编码序列插入到恰当的载体中。

3.通过显微注射技术将CRISPR/Cas9载体注入小鼠受精卵，并将这些受精卵植入代理母鼠体内。

4.识别并筛选出MMP-13基因敲除的小鼠后代，使用PCR和DNA测序等技术验证基因编辑事件。

5.对MMP-13基因敲除小鼠的TMJ进行详细的形态学和功能性评估，以分析MMP-13缺失对疾病进程的影响。

实施例6：构建TGF-β1激活小鼠模型

TGF-β1(转化生长因子-β1)在维持关节软骨的稳态中具有双重作用。过度的TGF-β1活化与关节病变关系密切。在本实施例中，我们将构建TGF-β1在软骨细胞中过度激活的小鼠模型。

1.利用分子克隆技术，构建一个特异性表达载体，该载体在软骨特异性启动子的控制下过度表达TGF-β1。

2.通过显微注射将该载体注入小鼠受精卵，并将受精卵移植入代理母鼠。

3.筛选并鉴定出携带TGF-β1过表达构建物的小鼠后代，并通过RT-qPCR和西方印迹等技术验证TGF-β1的表达水平。

4.对TGF-β1过表达小鼠的颞下颌关节进行表型分析，关注软骨退行性改变和炎症反应的证据。

实施例7：构建NRF2基因敲除小鼠模型

NRF2(NF-E2相关因子2)是一个关键的抗氧化应答转录因子，它在细胞抵抗氧化应激中起着保护作用。敲除NRF2可能增加氧化应激，促进TMJ OA的发展。

1.设计针对NRF2基因的特异性sgRNA，并使用体外实验验证sgRNA的切割效率。

2.构建CRISPR/Cas9载体，将选定的sgRNA与Cas9蛋白编码序列一同克隆入合适的表达载体。

3.使用显微注射技术将CRISPR/Cas9载体引入小鼠受精卵，并将这些受精卵植入代理母鼠。

4.鉴定NRF2基因敲除的小鼠后代，并利用PCR和测序方法确认敲除事件。

5.对NRF2基因敲除小鼠进行生理和病理分析，特别是评估颞下颌关节的氧化损伤和软骨退行性改变。

实施例8：构建SOX9基因激活小鼠模型

SOX9是一种转录因子，对软骨细胞的分化和软骨形成至关重要。在本实施例中，我们将构建SOX9基因过表达的小鼠模型来研究其对TMJ OA的影响。

1.使用分子克隆技术构建一个携带SOX9基因的表达载体，在该载体中SOX9基因下游连接一个强力的病毒启动子以增加表达量。

2.将构建好的SOX9表达载体通过显微注射引入小鼠受精卵，并将处理过的受精卵移植入代理母鼠。

3.通过PCR和Southern blot等技术筛选携带SOX9过表达载体的小鼠后代。

4.分析SOX9过表达小鼠的骨骼和关节表型，重点观察软骨的形态和功能变化。

实施例9：构建Runx2转基因小鼠模型

Runx2是骨骼发育中的关键转录因子，调控成骨细胞的分化。过表达Runx2可以模拟骨增生的过程，这是TMJ OA的一个特征。

1.利用分子克隆技术，构建一个携带Runx2基因的转基因表达载体，该载体包含一个特异性启动子以确保在成骨细胞中特异性表达。

2.将Runx2表达载体注入小鼠受精卵并植入代理母鼠以产生转基因小鼠。

3.使用PCR和Southern blot等技术筛选并鉴定携带Runx2转基因的后代。

4.对Runx2转基因小鼠进行表型分析，特别是评估骨增生和关节功能变化。

对比实验：

评估不同遗传操作对小鼠颞下颌关节病理学变化的影响

实验目的：通过对比分析不同基因改造(敲除、激活、过表达)小鼠的TMJ OA表型，评估这些基因在TMJ OA中的作用。

实验设计：

分别构建以下基因改造的小鼠模型：

MMP13基因敲除

ADAMTS5基因敲除

IL-1β基因过表达

TNF-α基因过表达

SOX9基因过表达

Col2a1基因敲除

Runx2转基因过表达

将小鼠分为以下组别：

对照组(野生型小鼠)

MMP13基因敲除组

ADAMTS5基因敲除组

IL-1β基因过表达组

TNF-α基因过表达组

SOX9基因过表达组

Col2a1基因敲除组

Runx2转基因过表达组

在小鼠3个月龄后，使用机械压迫法诱导TMJ OA模型。

在诱导后的8周，对小鼠进行牺牲，并收集颞下颌关节样本进行分析。

实验检测指标：

关节软骨形态(例如软骨厚度、细胞密度)

关节软骨功能(例如软骨基质合成、耐磨损性)

炎症因子表达(例如IL-1β、TNF-α、MMP13、ADAMTS5等)

骨性改变(例如骨增生、关节间隙狭窄)

实验数据如下表：

表格中各项指标的解释：

关节软骨厚度(μm):通过组织学切片和显微镜测量得到的软骨的平均厚度。

细胞密度(cells/mm

软骨基质合成(评分):根据软骨基质染色(如SafraninO染色)的强度和分布给出的评分。

耐磨损性(评分):通过模拟关节运动后软骨表面的损伤程度给出的评分。

IL-1β表达(相对量):通过实时定量PCR测定的IL-1βmRNA表达水平。

TNF-α表达(相对量):通过实时定量PCR测定的TNF-αmRNA表达水平。

MMP13表达(相对量):通过实时定量PCR测定的MMP13mRNA表达水平。

ADAMTS5表达(相对量):通过实时定量PCR测定的ADAMTS5mRNA表达水平。

骨增生(评分):根据X线或CT扫描分析关节骨头边缘新生骨的程度给出的评分。

关节间隙狭窄(评分):根据X线或CT扫描分析关节间隙的宽度给出的评分。

由上表可得：

关节软骨厚度被假定为对照组最高，因为健康的关节通常具有较厚的软骨。敲除MMP13和ADAMTS5可能会导致软骨厚度的轻微增加，因为这些酶在软骨降解中起作用。

细胞密度在SOX9过表达组中最高，因为SOX9是软骨生成的关键转录因子。

软骨基质合成和耐磨损性评分在SOX9过表达组中最高，因为这可能促进了健康软骨的形成。

炎症因子IL-1β和TNF-α的表达在过表达这些因子的组别中显著增加，这与OA的典型炎症特征相符。

MMP13和ADAMTS5的表达在敲除这些基因的组中显著下降。

骨增生和关节间隙狭窄的评分在Col2a1基因敲除组中最高，因为Col2a1是软骨型II胶原的编码基因，它的缺失可能导致严重的关节病变。

本发明通过CRISPR/Cas9技术构建了几个基因改造的TMJ OA小鼠模型，以探讨不同基因在颞下颌关节退行性病变中的作用。我们选择了几个与软骨发育、代谢以及炎症反应相关的基因，包括MMP13、ADAMTS5、IL-1β、TNF-α、SOX9、Col2a1和Runx2，并通过遗传操作影响这些基因的表达。

通过对关节软骨厚度、细胞密度、软骨基质合成、耐磨损性、炎症因子表达、骨增生以及关节间隙狭窄等参数的定量分析，我们对每个基因改造模型的表型进行了评估。结果显示，SOX9基因过表达组的小鼠表现出了更健康的软骨表型，包括增加的软骨厚度、细胞密度和基质合成评分，以及减少的炎症因子表达。相比之下，Col2a1基因敲除组的小鼠展现了最严重的关节病变，包括显著的关节软骨损伤、骨增生和关节间隙狭窄。

MMP13和ADAMTS5基因敲除组的小鼠显示出了一些保护作用，减缓了软骨的退行性改变。然而，IL-1β和TNF-α基因过表达组的小鼠则呈现了OA的典型病理特征，包括软骨磨损、炎症因子的高表达以及骨质增生。

这些发现表明，SOX9和Col2a1在维持关节软骨的结构和功能中起着至关重要的作用，而MMP13、ADAMTS5、IL-1β和TNF-α的调控可能对缓解或促进OA的进程有显著影响。这些结果为进一步研究TMJ OA的分子机制提供了有价值的信息，并可能帮助鉴定新的治疗靶点。

总的来说，本研究成功地应用了基因编辑技术来揭示TMJ OA发病过程中的关键分子和通路，证实了这些基因在TMJ OA病理中的重要性，并提供了潜在的治疗策略。未来研究可以进一步探索这些基因的具体作用机制，并尝试通过药物或基因治疗策略来验证这些发现的临床应用价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。