一种玉屏风多糖合生元及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，特别是一种玉屏风多糖合生元及其制备方法和应用。

背景技术

大口黑鲈作为一种肉质细嫩且少刺的高价值水产品，目前在我国的养殖量逐年提高。伴随养殖量的增加，大口黑鲈疾病的爆发时有发生并造成较大经济损失。血液是循环系统的重要组成部分，血液中免疫相关物质时刻帮助机体抵御并清除病原体。因此，需要提高大口黑鲈免疫能力。

中药多糖是中药活性成分之一，具有增强免疫、抗炎、抗氧化等功能，且中药多糖本身无毒无公害，在养殖过程中使用后机体易代谢无残留，是一种理想免疫增强剂。玉屏风多糖是从中药玉屏风散中提取的复合多糖成分，兼具该方剂中单种多糖的功能，大量研究表明玉屏风多糖具有促生长，增强免疫等作用。玉屏风多糖作为中药玉屏风其他活性物提取过程中产生的主要副产物，将其作为饲料添加剂有广阔应用前景，有利于玉屏风副产物的资源化利用。鱼类对糖类物质的吸收利用能力较低，水产养殖过程中直接使用玉屏风多糖可能导致其利用效率低下，益生菌能有效将大分子多糖分解为小分子物质，使之更易被鱼体吸收，尤其是大口黑鲈这种肉食性鱼。益生菌的使用同样具有明确的增强免疫作用，将玉屏风多糖和益生菌联合使用可能效果更显著。

中国专利申请号CN201911182988.7公开了一种多糖益生菌复合饲料添加剂的制备方法，其包括如下工艺步骤：1)取玉屏风药渣与离子水混合浸泡，真空抽滤，得浓缩液；2)将浓缩液加入酒精中混合，静置，过滤得沉淀物，再经干燥，得玉屏风粗多糖粉末；3)在无菌环境条件下，对乳酸杆菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌分别进行分离纯化、液体培养，将菌液混合，得混合菌液；4)将步骤2)所得的玉屏风粗多糖粉末配制成溶液，灭菌冷却后与步骤3)所得的混合菌液混合，发酵48～72h，经真空冷冻干燥，得成品。

虽然上述方案声称利用益生菌混合菌液对玉屏风多糖的分解代谢，充分发挥两者对鱼类肠道菌群平衡和糖代谢水平提升的作用，同时使该饲料添加剂可有效提高鱼类抗应激能力和免疫力。但是并不清楚其具体机理，更无法确定其能提高大口黑鲈的免疫能力。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种玉屏风多糖合生元及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的目的之一是要提供一种玉屏风多糖合生元的制备方法，包括以下步骤：

S1、将从健康大口黑鲈鱼肠道中分离获得的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别经过驯化、扩大培养后，得到枯草芽孢杆菌液、植物乳杆菌液和副干酪乳杆菌液，取枯草芽孢杆菌液、植物乳杆菌液和副干酪乳杆菌液分别加入到50mL离心管中得到每种益生菌含量均为1×10

S2、按质量体积比为0.2g：20mL取玉屏风多糖粉和灭菌蒸馏水加入上述离心管中拧紧盖子涡旋混匀，得到未发酵玉屏风多糖合生元；

S3、将离心管盖拧紧后置于恒温摇床中28℃，150r/min发酵36h，发酵完成后即得发酵玉屏风多糖合生元。

进一步地，所述步骤S1中的驯化包括：

S101、分别称取1g玉屏风多糖粉于多个250mL锥形瓶，然后分别量取100mL蒸馏水溶解玉屏风多糖，再经过121℃高压灭菌20min，得到多个浓度为0.01g/mL的玉屏风多糖驯化液；

S102、然后在超净台分别挑取枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的单菌落分别接种到不同的玉屏风多糖驯化液中，接种有副干酪乳酸菌和植物乳杆菌的锥形瓶加封口膜密封；

S103、然后分别将接种有枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的锥形瓶置于37℃恒温摇床中，于150r/min转速下分别进行一次驯化36h；

S104、一次驯化完成后各取200μL驯化完成的液体，重复步骤S103的步骤进行二次驯化；

S105、二次驯化完成后分别将3种驯化完成的液体进行分装4℃保存。

进一步地，所述步骤S1中的扩大培养包括：

S111、分别称取0.7g玉屏风多糖粉和1.62g MRS肉汤培养基于多个250mL锥形瓶，然后分别量取100mL蒸馏水溶解，再经过121℃高压灭菌20min，得到多个培养液；

S112、然后分别吸取3种驯化完成的液体200μL接种于3个培养液中，接种副干酪乳酸菌和植物乳杆菌的锥形瓶加封口膜密封；

S113、然后将3个锥形瓶置于28℃恒温摇床中，于150r/min转速下扩大培养48h，扩大培养完成后立刻分别吸取3种培养液1mL进行平板计数。

进一步地，所述步骤S2中的未发酵的玉屏风多糖合生元中，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌含量均为5×10

优选地，所述步骤S1中混合菌液于6000r/min转速下离心15min。

本发明的目的之二是要提供一种利用上述方法制得的玉屏风多糖合生元。

本发明的目的之三是要提供一种玉屏风多糖合生元在作为提高大口黑鲈免疫能力的饲料添加剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、从健康大口黑鲈鱼肠道中分离获得具有针对性和亲和性的益生菌菌株(植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、副干酪乳杆菌)与玉屏风多糖进行复合，制得一种玉屏风多糖和复合益生菌联合发酵的玉屏风多糖合生元，能够作为提高大口黑鲈免疫能力的饲料添加剂。

2、饲料中添加玉屏风多糖、复合益生菌及发酵玉屏风多糖合生元都能提高大口黑鲈LPS注射后免疫水平，发酵玉屏风多糖合生元效果更强；发酵和未发酵的玉屏风多糖合生元都可以提高大口黑鲈头肾和肠道SOD抗氧化效果和血清抗氧化能力，发酵玉屏风多糖合生元还能提高肝脏SOD活性。

3、玉屏风多糖及其发酵和未发酵多糖合生元能更快恢复LPS引起的肝脏炎症反应损伤，发酵玉屏风多糖更能保护肝组织。发酵玉屏风多糖合生元能促进头肾的生长，在LPS引起的头肾炎症反应时有更强的抗炎活性。

4、发酵玉屏风多糖合生元组相较其他试验组，能够下调促炎性细胞因子IL-1β和IL-8的表达，更快上调抗炎细胞因子IL-10的表达。

附图说明

图1为从健康大口黑鲈肠道中分离出的菌株FSL1、FSL2、YP1的菌落形态。

图2为菌株FSL1、FSL2、YP1的菌体形态(1000×油镜)。

图3为菌株FSL1、FSL2、YP1的16S rRNA电泳图。

图4为菌株FSL1基于16S rRNA序列同源性系统发育树。

图5为菌株FSL2基于16S rRNA序列同源性系统发育树。

图6为菌株YP1基于16S rRNA序列同源性系统发育树。

图7为扩大培养后益生菌含量标准曲线。

图8为利用标准葡萄糖通过硫酸-苯酚法制作标准曲线。

图9为大口黑鲈饲养试验不同分组的免疫器官生长指数(n≥14)。

图10为大口黑鲈饲养试验不同分组的血清生化指标的测定结果：A为AKP酶活力测定结果；B为ACP酶活力测定结果；C为血清GOT酶活力测定结果；D为血清GPT酶活力测定结果；E为血清IgM含量测定结果；F为血清溶菌酶活力测定结果。

图11为大口黑鲈饲养试验不同分组的抗氧化指标的测定结果：A为头肾SOD测定结果；B为头肾MDA测定结果；C为肠组织SOD酶活力测定结果；D为肠组织MDA含量测定结果；E为肝脏SOD酶活力测定结果；F为血清T-AOC测定结果。

图12为大口黑鲈饲养试验不同分组的组织免疫指标的测定结果：A为头肾IL-1测定结果；B为头肾TNF-α测定结果；C为肠组织IL-1测定结果；D为肠组织TNF-α测定结果；E为肝脏IL-1测定结果；F为肝脏TNF-α测定结果。

图13为大口黑鲈饲养试验不同分组的肝脏免疫相关基因相对表达量：A为IKK相对表达量；B为IL-1β相对表达量；C为IL-8相对表达量；D为IL-10相对表达量。

图14为大口黑鲈饲养试验不同分组的肝组织0h和48h HE染色切片：A：0h Control组；B：0h UYP组；C：0hFYP组D：0hYPF组；E：0h CPB组；F：48h Control组；G：48h UYP组；H：48hFYP组；I：48hYPF组；J：48h CPB组。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

下述实施例中所用玉屏风多糖喷干粉由国药集团德众(佛山)药业有限公司提供，枯草芽孢杆菌FSL1、植物乳杆菌FSL2和副干酪乳杆菌YP1从健康大口黑鲈鱼肠道中分离获得；所用主要仪器设备如表1所示。

表1

实施例1

本实施旨在提供一种玉屏风多糖合生元的制备方法，包括以下步骤：

S1、将从健康大口黑鲈鱼肠道中分离获得的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别经过驯化、扩大培养后，得到枯草芽孢杆菌液、植物乳杆菌液和副干酪乳杆菌液，取枯草芽孢杆菌液、植物乳杆菌液和副干酪乳杆菌液分别加入到50mL离心管中得到每种益生菌含量均为1×10

其中，从健康大口黑鲈鱼肠道中分离获得的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的具体操作如下：

从健康大口黑鲈鱼肠道取得内容物样品于50mL灭菌离心管，加入40mL灭菌生理盐水涡旋混匀后进行梯度稀释(10

将分离培养的不同菌株进行革兰氏染色，吸取2μL菌液涂在载玻片上，然后进行烤片，结晶紫染色60s，蒸馏水冲洗后碘液覆盖60s，蒸馏水冲洗后用脱色液脱色20s后水洗，吸干水分后番红染色60s，蒸馏水冲洗后干燥好载玻片，在显微镜下进行镜检，筛选出革兰氏阳性菌且有不同菌体形态的菌株。

将镜检筛选出的不同菌株在MRS平板上划线培养长出单菌落，然后在全自动微生物鉴定药敏系统中用革兰氏阳性菌鉴定板进行生化鉴定。按照鉴定板说明书挑取培养基上的待测菌落在去离子水中混匀，用Sensititire浊度计将待测菌液调整至标准管浊度。然后将待测菌液每孔吸取50μL加入鉴定板的32个孔中。在1A，2A，9A孔接种完以后加入矿物油完全覆盖；最后用封膜覆盖整块鉴定板。在SensititreARIS孵育器中35℃孵育24h后读取结果。

分离鉴定结果如图1，图1显示了从健康大口黑鲈肠道中分离出3株菌，分别命名FSL1、FSL2和YP1，菌株FSL1菌落形态为表面粗糙有褶皱，颜色为灰白色；菌株FSL2菌落形态为表面光滑凸起，颜色为白色；菌株YP1菌落形态为表面光滑凸起，单菌落形态规则呈圆形，颜色为白色。如图2所示，经革兰氏染色后3株菌均为革兰氏阳性菌，菌体形态都为杆状，FSL1菌体分散大小不一；FSL2菌体较小，常成对连在一起；YP1菌体不分散常为多个连长链。结合3株菌分离培养生长情况：FSL1为需氧培养，生长快速；FSL2为厌氧培养，生长比FSL1较慢；YP1为严格厌氧培养，生长比FSL2较慢。初步确定菌株FSL1为枯草芽孢杆菌，菌株FSL2和YP1为乳酸杆菌。

进一步对鉴定出的3中益生菌进行16S rRNA测序鉴定：

吸取经过镜检的不同菌株培养液1mL于不同的2mL离心管中，12000r/min离心2min后去上清。然后加入1mL灭菌蒸馏水涡旋混匀，12000r/min离心2min去上清，如此进行蒸馏水洗涤2次后涡旋混匀菌液。将此菌液作为菌液模板进行PCR扩增，细菌16S rRNA引物序列如下，菌液PCR反应体系见表2，PCR扩增完成后将扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检验条带质量及扩增产物大小，然后将条带明显且大小在1500bp处的扩增产物送生工生物工程股份有限公司测序。

细菌16S rRNA引物序列：

16S F：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'；

16S R：5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'；

表2

PCR反应程序为：

细菌16S rRNA测序结果用DNAstar软件包进行拼接，系统进化树用MEGA-X软件构建，用Origin 2021软件进行线性拟合及作图。两组数据之间用SPSS21软件进行独立样本t检验，数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，P<0.05为差异性标准，每个样品重复不少于3次。

16S rRNA测序鉴定结果如3所示，3株菌经过PCR扩增后的扩增产物电泳结果，FSL1、FSL2、YP1三个条带明显，条带大小均在1500bp左右，与细菌16S rRNA引物PCR扩增产物大小相同，表明扩增结果良好可以将扩增产物送测序。将3株菌16S rRNA测序结果序列用SeqMan软件进行拼接。然后将拼接好的序列在NCBI网站上进行Blast比对，在GenBank中下载16S rRNA核酸序列利用MEGA-X软件进行同源性比对，并以邻接法构建16S rRNA系统发育树。如图4所示，确定菌株FSL1为枯草芽孢杆菌，图5为菌株FSL2为植物乳杆菌，图6为菌株YP1为副干酪乳杆菌。

之后即可对获得的枯草芽孢杆菌FSL1、植物乳杆菌FSL2和副干酪乳杆菌YP1进行驯化，具体包括：

S101、分别称取1g玉屏风多糖粉于多个250mL锥形瓶，然后分别量取100mL蒸馏水溶解玉屏风多糖，再经过121℃高压灭菌20min，得到多个浓度为0.01g/mL的玉屏风多糖驯化液；

S102、然后在超净台分别挑取枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的单菌落分别接种到不同的玉屏风多糖驯化液中，接种有副干酪乳酸菌和植物乳杆菌的锥形瓶加封口膜密封；

S103、然后分别将接种有枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的锥形瓶置于37℃恒温摇床中，于150r/min转速下分别进行一次驯化36h；

S104、一次驯化完成后各取200μL驯化完成的液体，重复步骤S103的步骤进行二次驯化；

S105、二次驯化完成后分别将3种驯化完成的液体进行分装4℃保存。

驯化完成后进行扩大培养，具体包括：

S111、分别称取0.7g玉屏风多糖粉和1.62g MRS肉汤培养基于多个250mL锥形瓶，然后分别量取100mL蒸馏水溶解，再经过121℃高压灭菌20min，得到多个培养液；

S112、然后分别吸取3种驯化完成的液体200μL接种于3个培养液中，接种副干酪乳酸菌和植物乳杆菌的锥形瓶加封口膜密封；

S113、然后将3个锥形瓶置于28℃恒温摇床中，于150r/min转速下扩大培养48h，扩大培养完成后立刻分别吸取3种培养液1mL进行益生菌含量计数；益生菌含量计数及标准曲线制作具体操作如下：

1)在超净工作台中移液器吸取1000μL培养菌液至2mL灭菌离心管，然后12000r/min离心收集细菌，弃上清。然后吸取1000μL 0.9％灭菌生理盐水涡旋重悬细菌后12000r/min离心收集细菌后弃上清，再次吸取1000μL 0.9％灭菌生理盐水涡旋重悬细菌后得到原浓度的菌液。

2)、吸取100μL原浓度菌液至装有900μL灭菌生理盐水的2mL EP管充分混匀，得到稀释10倍的菌液。然后将稀释10倍的菌液再次稀释10倍得到稀释100倍的菌液。重复稀释至10

3)、待平板在培养箱中生长出较明显的菌落后进行拍照计数，取3个平板计数的平均值为最终结果，将计数结果和稀释倍数相乘既得原始细菌含量。稀释10

4)、将3种离心的原菌液依次稀释5、10、20、40、80、100、200、400、1000倍，然后将稀释后各浓度的菌液吸取200μL到96孔酶标板孔中，在多功能酶标仪中读取600nm波长下的吸光度值。根据平板计数结果计算各稀释梯度的益生菌含量，然后和吸光度值制作3种益生菌的浓度标椎曲线，以不同稀释梯度的浓度为纵坐标，600nm吸光度为横坐标制作标准曲线。为确保益生菌含量和吸光度值有强线性关系，菌液浓度不宜过高，吸光度值不宜大于0.8。

枯草芽孢杆菌FSL1、植物乳杆菌FSL2、副干酪乳杆菌YP1计数结果分别为：1.22×10

表3

注：“∞”表示没有加细菌的0.9％生理盐水。

如图7利用软件进行对3株菌不同稀释浓度和吸光度进行线性拟合，得到扩大培养后3株益生菌标准方程：

枯草芽孢杆菌FSL1：y＝-2.01×107+4.31×108x(R

植物乳杆菌FSL2：y＝-3.49×107+8.01×108x(R

副干酪乳杆菌YP1：y＝-2.88×107+7.26×108x(R

其中y表示细菌含量(CFU/mL)，x表示波长600nm细菌吸光度

结果表明该方法拟合效果良好，可以用于后续定量分离细菌。

S2、称取0.2g玉屏风多糖粉和20mL灭菌蒸馏水加入步骤S1的离心管中拧紧盖子涡旋混匀，得到未发酵玉屏风多糖合生元；

S3、将离心管盖拧紧后置于恒温摇床中28℃，150r/min发酵36h，发酵完成后即得20mL发酵玉屏风多糖合生元。

对得到的玉屏风多糖合生元的总糖、总蛋白及pH值测定：

总糖测定：测定方法为苯酚-硫酸法，按照总多糖含量测定试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司)说明书测定总多糖含量。称取葡萄糖标准品与灭菌蒸馏水配置浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0mg/mL的标准品溶液。以吸光度值为横坐标，标准品浓度为纵坐标制作标准曲线，根据样品吸光度值代入标准曲线即得样品总多糖含量。由于玉屏风多糖和合生元样品中多糖含量较高，故检测的合生元多糖样品稀释50倍后测定。如表4为不同浓度标准葡萄糖浓度及吸光度值，如图8利用标准葡萄糖通过硫酸-苯酚法制作标准曲线，利用软件进行线性拟合，拟合公式为y＝-0.02356+0.19604x(R

表4

总蛋白测定：吸取5mL待测液加入5mL灭菌蓝盖螺口平底管中，然后将该液体100W超声10s间隔10s，超声10min得到合生元发酵液破碎悬液。将该处理悬液依照考马斯亮蓝总蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所有限公司生产)说明书测定其总蛋白含量。

pH值测定用pH/温度测定仪(Testo 205，德国testo公司)进行测定。

玉屏风多糖合生元检测结果如表5，利用多糖标准曲线计算多糖含量。结果表明玉屏风多糖合生元经过益生菌发酵后多糖含量显著下降(P<0.05)，pH值显著下降(P<0.05)。经过离心分离细菌后，发酵后合生元上清蛋白含量有升高，发酵后合生元的总蛋白含量较发酵前略有增加。

表5

注：同列右上标大写字母表示0.2g/20mL玉屏风多糖离心液发酵前后变化，字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示无差异；同列右上标小写字母表示合生元发酵前后差异，字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示无差异。

对发酵后多糖合生元中3种益生菌进行计数：将合生元原液按上面的方法离心分离，按不同比例稀释后吸取100μL涂布在营养琼脂上，在有氧条件下37℃培养，将最先长出的菌落计数并挑取菌落镜检，确定枯草芽孢杆菌含量；将不同比例稀释后吸取100μL涂布在MRS琼脂上，密闭后放37℃培养，将最先生长出的菌落计数并挑取菌落镜检，确定植物乳杆菌含量，MRS琼脂上后面长出的菌落进行计数并挑取菌落镜检，确定副干酪乳杆菌含量。如表6为玉屏风多糖合生发酵前后元益生菌含量变化。经过36h发酵后植物乳杆菌FSL2含量显著增加(P<0.05)，副干酪乳杆菌YP1含量略有增加，而枯草芽孢杆菌FSL1含量显著降低了3个数量级(P<0.05)。

表6

注：同行数据后标大写字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著(P<0.05)。

综上所述，枯草芽孢杆菌FSL1、植物乳杆菌FSL2和副干酪乳酸菌YP13株菌和玉屏风多糖体外发酵36h后，玉屏风多糖液总多糖含量显著下降，pH值也显著降低。相同浓度的3种益生菌联合玉屏风多糖发酵36h后，植物乳杆菌FSL2含量显著增加，副干酪乳杆菌YP1含量略有升高，而枯草芽孢杆菌FSL1含量显著降低了3个数量级。

实施例2

本实施例旨在提供一种玉屏风多糖合生元在作为提高大口黑鲈免疫能力的饲料添加剂中的应用，为了验证其可行性，进行如下试验：

本试验所用副干酪乳酸菌YP1、植物乳杆菌FSL2、枯草芽孢杆菌FSL1同实施例1，大口黑鲈鱼苗从广东何氏水产有限公司购得，剔除不符合试验要求重量的个体后，将450尾健康大口黑鲈(11±2g)放置在养殖桶(规格60cm×40cm×40cm)中暂养5d适应环境，养殖水体为经消毒曝气过的自来水，控制温度为26～28℃，pH值保持在6.9，溶解氧浓度保持在6.2mg/L以上，期间投喂大口黑鲈基础饲料(基础饲料为浮性膨化料，成分及含量见表7)。提取LPS的迟缓爱德华氏菌株GD080715-1由实验室前期分离获得。

表7

将实施例制备的玉屏风多糖合生元作为饲料添加剂添加到大口黑鲈的饲料中，进行动物试验：

450尾健康大口黑鲈随机分为5组进行28天的饲养试验：空白对照组(Control)、未发酵合生元组(UYP)、发酵合生元组(FYP)、玉屏风多糖组(YPF)、复合益生菌组(CPB)，每组设3个重复，每个重复30尾鱼。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中拌料添加0.2％玉屏风多糖进行拌料，复合益生菌添加量为3×10

1、试验分组：

空白对照组(Control)，取20mL高压灭菌水拌入100g基础饲料中。

未发酵合生元组(UYP)，按照实施例1方法直接称取0.2g玉屏风多糖溶解于20mL高压灭菌蒸馏水中，分离3种扩大培养益生菌加入多糖溶液中形成未发酵合生元液，使最终溶液中每种益生菌含量为1×10

发酵合生元组(FYP)，按照实施例1方法制作发酵玉屏风多糖合生元20mL拌入100g基础饲料中。

玉屏风多糖组(YPF)，直接称取0.2g玉屏风多糖溶解于20mL高压灭菌水中，然后拌入100g基础饲料中。

复合益生菌组(CPB)，按照实施例1方法分离3种扩大培养益生菌加入20mL高压灭菌水中，每种益生菌添加含量均为1×10

以上各组的拌料均现配现用，在3天内喂完。

2、迟缓爱德华氏菌LPS的制备

迟缓爱德华氏菌LPS按照细菌脂多糖(LPS)提取试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)说明书进行提取。本试验LPS含量以其总多糖浓度为标准，测定方法同实施例1，提取5mL的LPS进行混匀后检测多糖浓度，然后将浓度用双蒸水稀释至30μg/mL用于注射。

3、样品采集

饲养试验结束后停喂1天开始采样。采样时按次序对每个养殖桶的鱼注射迟缓爱德华氏菌LPS(30μg/mL)0.1mL，随机取7尾鱼立即用MS-222(10mg/L)麻醉进行第一次采样，其余的鱼放回原养殖桶。麻醉结束的7尾鱼，分1尾鱼尾静脉采血后取肝组织于甲醛固定液中；其余6尾鱼测体重后进行采血，然后取完整的肝和两侧头肾称重记录后分别取样到2mL无酶EP管中立刻放进液氮中保存，最后采集肠道组织(肠道内容物单独收集)液氮保存。

在注射LPS后8h、24h和48h都进行采样，采样方法参考第一次采样方案，但不进行称重和肠道内容物的收集。每个养殖桶的组织样品设置6个生物学重复，每次采样每个养殖桶取1尾鱼肝组织甲醛固定。4个时间点尾静脉采集的血样分开收集到2mL无酶EP管中，同一养殖桶的鱼血液进行单独混样，于4℃静置2h后3500r/min，4℃离心5min，吸取上层血清于新的1.5mL无酶EP管中，置于-80℃中保存备用。以总多糖为标准标定LPS浓度。提取混匀的LPS在490nm波长测得OD值为0.3101，代入公式得总多糖含量为0.037mg/mL。最终将该LPS浓度稀释至30μg/mL使用。

4、免疫相关生长指数计算

对大口黑鲈体重、肝重及头肾进行称重，肝体指数及头肾体指数计算公式如下：

肝体指数(Hepatosomatic index，HSI，％)＝(肝重/体重)×100％；

头肾体指数(Head kidney somatic index，HKSI，％)＝(头肾重/体重)×100％。

如表8和图9结果表明肝指数在各组之间无显著差异；头肾指数FYP组显著高于对照组和YPF组，而UYP组、FYP组和CPB组之间无显著差异。

表8

注：同行数据右上标字母不同表示差异显著(P<0.05)，有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，n≥14。

5、血清生化指标测定

血清酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶、谷草转氨酶(AST)、溶菌酶(LZM)的测定均按照南京建成生物工程研究所有限公司的试剂盒说明书进行。血清IgM浓度测定按照泉州市睿信生物科技有限公司鱼免疫球蛋白IgM Elisa试剂盒说明书进行测定。

测定结果如图10所示，图10中A和B，UYP和FYP组在LPS注射8h时AKP和ACP酶活都高于对照组，而在0h这两组AKP和ACP都低于对照组。48h时只有YPF组AKP和ACP都显著低于其他组(P<0.05)。如图10中的C和图10中的D，全部分组血清GOT和GPT酶活在8h时都显著高于0h(P<0.05)，在48h时UYP、FYP和YPF组的GOT和GPT酶活都显著低于其他组(P<0.05)。如图10中的E，相较0h各组血清IgM含量在8h均显著降低(P<0.05)，24h时UYP组显著高于其他组(P<0.05)，48h时FYP组显著高于其他组(P<0.05)。如图10中的F，除CPB组外其他组血清溶菌酶活在8h时相较0h都显著下降(P<0.05)，而在24h各组溶菌酶活较8h都显著升高(P<0.05)，48h时除UYP组外其他试验组均显著高于对照组(P<0.05)。

6、抗氧化指标测定

将-80℃保存的组织样品解冻后，10％组织匀浆制备，匀浆总蛋白含量、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力测定，血清总抗氧化能力(T-AOC)测定按照南京建成生物工程研究所有限公司相关试剂盒说明书测定。

测定结果如图11所示，如图11中的A，LPS注射8h时UYP、FYP和对照组头肾SOD相比0h都显著降低(P<0.05)，在48h时UYP和FYP组头肾SOD已经升高且显著高于对照组(P<0.05)。如图11中的B，FYP组头肾MDA含量在8h、24h和48h时均显著低于0h(P<0.05)，而对照组在应激后有升高趋势，在48h时UYP和FYP组头肾MDA含量显著低于对照组(P<0.05)。如图11中的C和图11中的D，在LPS注射0h UYP组肠组织SOD酶活显著高于其他组(P<0.05)，对照组MDA含量显著高于其他试验组(P<0.05)。8h时FYP组肠组织SOD酶活显著高于其他组(P<0.05)。对照组MDA含量在8h后逐渐升高，而其他试验组变化不大。如图11中的E和图11中的F，对照组在LPS注射0h肝脏SOD酶活显著高于其他试验组(P<0.05)，但血清T-AOC显著低于其他试验组(P<0.05)。在8h时FYP组SOD酶活最高显著高于对照组(P<0.05)。随着LPS注射开始，全部分组血清T-AOC均成不同程度下降。

7、组织免疫指标测定

将-80℃保存的样品组织解冻后，按照泉州市睿信生物科技有限公司的说明书制备10％组织匀浆，鱼白细胞介素-1(IL-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度测定按照泉州市睿信生物科技有限公司生产的Elisa试剂盒说明书进行测定。

测定结果如12所示，如图12中的A和图12中的B，相较LPS注射0h头肾IL-1和TNF-α浓度在8h时都降低，之后各组头肾IL-1和TNF-α浓度在24h后缓慢升高。0h时CPB组头肾IL-1显著高于其他组(P<0.05)。如图12中的C和图12中的D，在0h时UYP组肠组织IL-1和TNF-α浓度均高于其他组，在LPS注射后各组之间IL-1和TNF-α浓度差异不大。如图12中的E和图12中的F，0h和8h时UYP和FYP组肝脏IL-1和TNF-α浓度都高于对照组，在48h是则相反。对照组和YPF组肝脏IL-1和TNF-α浓度在应激后都在逐渐升高，而UYP和FYP组无太大变化。

8、免疫相关基因表达测定

1)肝组织样品的总RNA提取及检测

肝组织样品的总RNA用AG RNAex Pro reagent试剂(湖南艾科瑞生物工程有限公司)提取，并测定提取的RNA样品浓度和纯度，OD

2)肝组织样品的总RNA反转录

使用

表9

表10

3)引物设计

以大口黑鲈鱼β-actin为管家基因(GenBank登录号：MH018565.1)，在网站(https://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计引物，设计IKK、IL-1β、IL-8、IL-10基因的引物，基因引物序列见表11，由生工生物工程股份有限公司合成引物。用β-actin引物将cDNA进行PCR扩增后，将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检验DNA质量，然后将扩增产物送生工生物工程股份有限公司测序，最后将测序结果在NCBI网站进行比对验证该引物特异性。

表11

4)实时荧光定量PCR

使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对cDNA进行相对荧光定量。RT-qPCR反应体系及反应程序见表12和表13。目的基因相对表达量采用2

对照组ΔCt＝对照组目的基因Ct值－对照组β-actin Ct值；

试验组ΔCt＝试验组目的基因Ct值－试验组β-actin Ct值；

ΔΔCt＝试验组ΔCt平均值－对照组ΔCt平均值；

目的基因相对表达量＝2

表12

表13

结果如图13所示，如图13中的A，0h时FYP和YPF组IKK表达量较对照组显著上调(P<0.05)，8h各试验组IKK相对表达量较0h都有所下调，48hUYP和YPF组相对表达菌高于对照组(P<0.05)。如图13中的B-图13中的D，0h时UYP、YPF和CPB组IL-1β表达量相较对照组显著上调(P<0.05)，UYP组IL-8表达量有下调，FYP和CPB组IL-10表达量显著下调(P<0.05)。与对照组相比，UYP组在LPS注射后8h时IL-1β、IL-8和IL-10表达量显著下调(P<0.05)，在24h和48h时都显著上调；FYP组IL-1β、IL-8和IL-10表达量在8h时显著下调，IL-1β和IL-10表达量在24h时显著上调；YPF组IL-8和IL-10表达量在8h时显著下调，而IL-1β表达量在8h显著上调，IL-1β、IL-8和IL-10表达量在48h是显著上调；CPB组IL-1β和IL-8表达量在8h和24h显著上调，在48h显著下调，IL-10表达量在8h和24h有下调。

9、肝脏组织病理检测

固定好的肝组织样品修切后放入组织包埋盒中标记，并使用流水过夜冲洗掉组织中的甲醛。使用不同含量无水乙醇分级脱水，二甲苯透明后用石蜡包埋机浸蜡并包埋。将包埋好组织的蜡块在组织切片机上切出连续的7μm厚度的蜡片，并在45℃烘箱中烤片2h后用二甲苯脱蜡，水化后分别用苏木素染液和伊红染液染色，过一遍蒸馏水后自然风干，最后用中性树胶封上盖玻片晾干保存。

如图14为肝组织0h和48h HE染色切片。0h相较于对照组，其他试验组的肝细胞分界更明显，48h全部试验组肝细胞均有不同程度的萎缩，对照组有明显的肝细胞肿大，肝损伤明显(如图14中的F黑色箭头)。

综上所述，饲料中添加玉屏风多糖、复合益生菌及发酵玉屏风多糖合生元都能提高大口黑鲈LPS注射后免疫水平，发酵玉屏风多糖合生元效果更强。发酵和未发酵的玉屏风多糖合生元都可以提高大口黑鲈头肾和肠道SOD抗氧化效果和血清抗氧化能力，发酵玉屏风多糖合生元还能提高肝脏SOD活性。

玉屏风多糖及其发酵和未发酵多糖合生元能更快恢复LPS引起的肝脏炎症反应损伤，发酵玉屏风多糖更能保护肝组织。发酵玉屏风多糖合生元能促进头肾的生长，在LPS引起的头肾炎症反应时有更强的抗炎活性。

发酵玉屏风多糖合生元组相较其他试验组，能够下调促炎性细胞因子IL-1β和IL-8的表达，更快上调抗炎细胞因子IL-10的表达。

上述试验证实本发明的玉屏风多糖合生元可以作为饲料添加剂添加到饲料中，并能提高大口黑鲈免疫能力。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。