一种与萝卜抽薹性连锁的InDel及其应用

技术领域

本发明属于萝卜分子育种技术领域，具体涉及公开了一种与萝卜抽薹性连锁的InDel及其应用。

背景技术

萝卜的先期抽薹是指肉质根尚未达到商品成熟之前就已抽薹的现象。萝卜以贮藏器官(肉质根)为产品，萝卜抽薹以后其肉质根由致密变为疏松，失去食用价值，在生产上造成很大的损失。我国萝卜每年播种面积约1800万亩，在蔬菜周年供应中占有重要地位；近年来，在萝卜的周年生产中，越冬萝卜、春萝卜以及高山萝卜的比重逐年上升，逐渐形成了萝卜新的优势产区。先期抽薹严重制约着萝卜春季栽培和高山反季节栽培，不但影响了萝卜的产量和品质，也影响了萝卜的周年供应。因此，培育耐抽薹品种对于萝卜产业具有重要的意义。为了提高耐抽薹萝卜新品种的培育效率，应首先研究耐抽薹性的遗传规律，开发连锁的分子标记并用于种质资源筛选和创制。相较于传统的依赖大田鉴定方法，开发耐抽薹性连锁的分子标记和应用将能极大提高耐抽薹种质资源创制的效率，缩短育种时间，最终促进新品种的培育进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为创制耐抽薹萝卜种质资源提供一种新选择。

本发明的技术方案是一种与萝卜抽薹性连锁的InDel，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3和/或SEQ IDNo.4所示。

本发明还提供了扩增所述InDel的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。

本发明还提供了所述InDel和/或扩增所述InDel的引物对在萝卜育种中的应用。

进一步的，本发明还提供了所述InDel及其引物对在鉴定萝卜性状中的应用。

具体的，所述性状为抽薹性。

本发明还提供了一种鉴定萝卜抽薹性的方法，包括如下步骤：

a、提取待检测萝卜材料的基因组DNA；

b、以基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c、对PCR产物进行电泳，扩增得到的PCR产物片段大小为92bp，则表明检测的萝卜为耐抽薹材料；扩增得到的PCR产物片段大小为99bp，则表明检测的萝卜为早抽薹材料；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含92bp和99bp，则表明检测的萝卜为中度耐抽薹材料。

进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：50～100ng萝卜材料的基因组DNA，1μL 10×PCR Buffer，0.8μL dNTPs，浓度为10μmol的上下游引物各0.4μL，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μL。

具体的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min。

本发明的有益效果：本发明提供了与萝卜抽薹性紧密连锁的InDel位点。用InDel引物对待检测材料的基因组DNA进行扩增，然后对PCR产物进行凝胶电泳，扩增得到的PCR产物片段大小为92bp，则表明检测的萝卜为耐抽薹材料；扩增得到的PCR产物片段大小为99bp，则表明检测的萝卜为早抽薹材料；扩增得到的PCR产物片段大小同时包含92bp和99bp，则表明检测的萝卜为中度耐抽薹材料；本发明提供的检测方法准确率高达100％。本发明为萝卜育种提供了一种新的鉴别方式，尤其是创制不同抽薹性的萝卜材料和鉴定萝卜材料抽薹性中的应用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为QTL-seq检测抽薹相关QTL位点的△(SNP-index)分布图；横坐标为染色体名称，彩色的点代表计算出来的△(SNP-index)值，其中红色的虚线代表置信度为0.99的阈值线。

图2为InDel引物Rs-1285在F

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中所使用的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

实施例1

以一个白萝卜类型的极耐抽薹自交系“B669”(武汉市农业科学院提供)和一个紫皮萝卜不耐抽薹自交系“X28”(武汉市农业科学院提供)为遗传研究的亲本进行耐抽薹研究。在2022年春季的耐抽薹性调查结果显示，“B669”从播种到抽薹的时间为228天，而“X28”从播种到抽薹的时间为190天，杂种F

实施例2

在QTL-seq研究结果的基础上，根据参考基因组的信息，在实施例1中鉴定的QTL区间内，以每500～800kb的间距设计1对InDel引物，共设计了72对InDel引物。引物设计的原则包括退火温度在58～60℃，双亲间的碱基差异在3～8bp，扩增片段大小在80～150bp。利用设计的引物检测亲本“B669”和“X28”之间的多态性，筛选出在亲本间多态性好、扩增稳定的InDel引物39对。所述PCR扩增的反应体系为：50～100ng萝卜材料的基因组DNA，1μL 10×PCR Buffer，0.8μL dNTPs，浓度为10μmol的上下游引物各0.4μL，1U Taq酶，加ddH2O补足至10μL。所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min。

进一步，在F2群体中挑选极端耐抽薹和早花植株各30株，分布构成耐抽薹和早花的小群体用于分子标记的筛选和验证。提取耐抽薹和早花小群体植株的基因组DNA，利用筛选出的39对InDel引物进行扩增，发现5对InDel引物在极端耐抽薹和早花小群体之间表现出良好的多态性，且与亲本“B669”和“X28”之间的多态性一致。因此，通过亲本、选极端耐抽薹和早花小群体植株的验证，最终筛选出5个候选的抽薹位点连锁InDel标记。

利用一个包含133个植株的F2分离群体来验证5个候选的抽薹位点连锁InDel标记的可靠性，结合春季田间调查的抽薹时间，最后鉴定出InDel引物Rs-1285的检测数据与抽薹时间完全一致(图2)，所有的耐抽薹植株均只扩增得到了大小为92bp的PCR片段，所有的早抽薹植株均只扩增得到了大小为99bp的PCR片段，同时所有的中度耐抽薹植株均扩增得到了包含92bp和99bp的2种片段(表1)。以上研究结果表明，本发明提供的InDel引物Rs-1285能够精准的鉴定萝卜抽薹时间，可以作为分子标记进行辅助育种。

表1InDel引物Rs-1285在F2群体中的检测结果分析

SEQ ID No.1：上游引物

CTATATGCCTTGGATTGAATTTTG

SEQ ID No.2：下游引物

ACGCTCTAACAGACTCAATTCAGG

SEQ ID No.3：耐抽扩增片段

CTATATGCCTTGGATTGAATTTTGTTGGCTATTATTGCAGCTAATTTCAAGGTTTAGGGTTGTTATATCCTGAATTGAGTCTGTTAGAGCGT

SEQ ID No.4：早花扩增片段

CTATATGCCTTGGATTGAATTTTGTTGGCTATTATTGCAGCTATTGTGAAATTTCAAGGTTTAGGGTTGTTATATCCTGAATTGAGTCTGTTAGAGCGT。