TaNPFs基因及其作为小麦衰老标记物的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及TaNPFs基因及其作为小麦衰老标记物的应用。

背景技术

植物衰老是植物个体内部一系列程序化的渐行性衰退,最终走向死亡的过程。叶片衰老是植物生长发育的组成部分,构成了植物叶片发育的最后一个阶段,被认为是程序性细胞死亡(PCD)的一种,以依赖叶龄的方式进行,并由诸多环境因素诱导,受生长发育时期复杂的内、外因素的相互作用影响。叶片衰老与作物产量及品质息息相关，作物早衰或晚衰不利于完成其正常的生命周期，造成作物减产或者品质降低，严重影响农艺性状。叶片早衰会缩短有效光合作用时间，使小麦减产；适时晚衰则可以有效提高小麦产量；但过度晚衰又会使小麦生育周期延长，不利于农业生产耕作。

现有技术中已经发现了一些早衰的分子标记物，例如CN115992278 A中提供了一种检测作物早衰基因的分子标记能够检测到基因LOC_Os03g31550编码区的第11个外显子出现的4个碱基AACA缺失，导致移码突变形成的早衰相关基因。CN 108913808 A公开了一种用于控制小麦叶片衰老的引物、试剂盒及其应用，该技术方案包括根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，利用过量表达TaNACS基因促进小麦叶片的衰老，利用RNAi技术使TaNACS基因在小麦中沉默而延缓小麦叶片的衰老。

目前对于小麦衰老标记物的研究比较少，进一步研究获取更多的小麦衰老相关标记物对于小麦的培育有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术中存在的缺陷，提供一种TaNPFs基因及其作为小麦衰老标记物的应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供了一种TaNPFs基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种上述TaNPFs基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种基于上述TaNPFs基因特异性设计的引物对，所述引物对选自如下：

本发明还提供了一种含有上述TaNPFs基因重组过表达载体，其中所述植物表达载体为pCAMBIA1300。

本发明还提供了上述基因作为小麦衰老标记物的应用。

本发明还提供了上述基因、重组过表达载体或上述宿主细胞在小麦育种中的应用。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明研究发现了一种新的小麦衰老标记物TaNPFs基因，明确了过表达该基因作物会呈现早衰表型，干涉小麦中TaNPFs的表达水平会出现晚衰表型，从而为小麦的品种培育提供了新的思路。

附图说明

图1是TaNPFs基因在小麦旗叶不同发育时期表达量；其中：Booting为孕穗期Heading；抽穗期为Flowering为扬花期；Filling为灌浆期；

图2是TaNPFs基因在小麦旗叶不同部位表达量；其中：Base为基部；Middle为中部；Tip为叶尖；

图3是拟南芥呈现早衰表型的示意图；

图4是拟南芥叶片离子渗透率对比图；

图5为拟南芥叶片中叶绿素含量的相对值对比图；

图6是干涉小麦在黑暗处理三天后的性状表型；

图7是TaNPFs基因的表达量对比图；

图8为不同叶片中叶绿素含量的相对值对比图；

图9为不同叶片的离子渗透率对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。

实施例1TaNPFs基因的获取和测序

用中国春(Chinese Spring)中基因TraesCS4A02G283900进行扩增和测序。设计上游引物，序列为：TCCCACCCTCTGTATAAAGGGAG，如SEQ ID No.3所示，下游引物序列为TAGAATATAGATTGATTGATTTCGT，如SEQ ID No.4所示。采用测序验证扩增的基因是否正确，引物合成和测序工作由天津金维智有限公司完成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2TaNPFs基因在小麦旗叶不同发育时期和不同位置对比

分别在小麦中国春发育过程中的孕穗期(Booting)、抽穗期(Heading)、扬花期(Flowering)灌浆期(Filling)采集旗叶材料，提取RNA对TaNPFs基因进行转录水平含量检测，qRT-PCR引物的上游引物：AACCCACCCACCTTCACC，如图SEQ ID No.7所示，下游引物为：CATGCCCTTGCCGGAGTCCA，如图SEQ ID No.8所示。

结果显示：不同发育时期表达量结果见图1，TaNPFs基因在灌浆期表达最多，其次为扬花期，在孕穗期表达最少。如图2所示，TaNPFs基因在叶尖表达最多，基部和中部相当。

实施例3TaNPFs过表达拟南芥呈现早衰表型

1、植物总RNA的提取

(1)剪适量拟南芥植物叶片置于锡箔纸放于液氮中，研钵中充分研磨后，置于含有1mL trizol的RNAFree EP管中，充分反应15min。

(2)4℃，12000rpm离心10min。将上清吸取至新的1.5mL的RNA Free EP管中，加入200μL氯仿，用力颠倒离心管混匀3次，冰上静置15min。

(3)4℃，12000rpm离心10min。将上清吸取至新的1.5mL的RNA Free EP管中，加入400μL异丙醇，冰上放置20min。

(4)4℃，7500rpm离心5min，若没有看见白色沉淀，可提高离心速度至12000rpm，倒掉上清，用75％酒精清洗一次，95％酒精清洗一次。

(5)室温晾干10min，用DEPC水溶解沉淀。

2、植物RNA的反转录为cDNA

使用Vazyme(HiScriptⅡRT SuperMix)法进行。

按照如下表1体系加入各组分，去除基因组DNA：

表1反应体系

轻轻混匀，42℃反应2min。

在上一部体系中加入4μL5×HiScriptⅡRT SuperMixⅡ，轻轻混匀，之后在PCR仪中按照如下程序进行反应：37℃，15min；85℃.1min；4℃终止。反应结束后，利用获得的cDNA进行后续实验或放于负20℃冰箱保存。

3、实时定量PCR实验

以克隆得到的TaNPFs基因为参照设计荧光定量引物，引物序列为：引物SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8。

使用的为荧光定量PCR试剂为Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix(711，简称SYBR Mix)，使用的qPCR仪器为Bio-Rad公司的CFX96.

(1)提前预混表2和表3两个反应体系(引物mix与cDNA mix)

表2引物mix反应体系

表3cDNAmix反应体系

按照试验设计，在荧光定量PCR专用的96孔或384孔板中分装上述预混液，一般每组试验会设计三次技术重复。之后用垂直式96孔板离心机对样品进行短暂离心后，用荧光定量PCR专用的封板膜覆盖在96孔。对qPCR仪器进行相关参数设置，将96孔板放于仪器中，待仪器运行结束后查看结果，具体参数设置如下表4:

表4荧光定量PCR反应程序

4、TaNPFs基因克隆及过表达载体构建

(1)利用引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10扩增出TaNPFs基因CDS序列，扩增程序为95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃2min，33个循环；72℃10min。

(2)将PCR扩增产物通过Xbal1酶连接到pCAMBIA1300过表达载体(35S驱动的过量表达)上，最终形成重组载体pCAMBIA1300-TaNPFs。

连接方法为：

(1)利用Xbal1单酶切pCAMBIA1300载体，片段回收后待用；

(2)建立连接体系：2.5μL酶切后的pCAMBIA1300载体；4.5μL PCR片段；1μL T4连接酶，2μL T4连接酶buffer：

(3)建立反应条件：22℃反应4h；转化大肠杆菌DH5a；进行阳性鉴定

并测序鉴定。

将测序正确的重组载体转入到农杆菌中，为下一步小麦转化做准备。

5、浸花法转化拟南芥

将构建好的TaNPFs-pCAMBIA1300菌液在锥形瓶中用500ml培养基过夜培养之OD为1.0左右。

集菌液，5500rpm离心10min收集菌体。

将菌体悬浮于转化介质，调OD600为0.8-1.0。

将拟南芥地上部分莫入到转化介质中5min，取出后倒放黑暗培养24h。

第二天正常培养，至植株成熟收种子，进行纯合植株的筛选。

结果：如附图3所示，过表达株系与野生型相比呈早衰表型；如附图4所示，离子渗透表达株系高于野生型；对其叶片进行叶绿素含量检测，过表达植株的叶绿素含量较野生型较低，结果见附图5。

实施例4对TaNPFs基因功能进行验证

1、LIC法构建BSMV载体

大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)是一种正义单链的RNA病毒,基因组包含RNAα、RNAβ和RNAγ三条链。只需用γ组分构建目的基因的表达载体即可，经过编辑的γ与原本的α和β共同发挥作用。

(1)选取TaNPFs基因序列中300bp的特异性片段设计引物，在正向和反向引物前添加LIC连接位点，PCR扩增目的片段。

(2)将PCR扩增的目的片段进行回收，将pCaBS-γLIC载体和回收目的片段加入到反应体系中，22℃静置30min，75℃静置15min，随后立即冰浴15min变性。

(3)吸取2μl处理好的载体与处理好的回收片段，混匀65℃，1min，随后室温退火。转化大肠杆菌DH5a。

(4)从大肠杆菌DH5a中提取质粒后再转化到EH105农杆菌中。

2、病毒诱导的基因沉默(BMSV-VIGS)

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一种不依赖转基因技术的基因功能缺失研究方法，其综合植物病毒的非转基因系统性侵染、植物的免疫应答及细胞RNAi沉默机制于一体，可以简易、快速且高效地沉默靶向基因，属于转录后基因沉默。本实验室所用小麦基因沉默诱导系统菌株为中国农业大学李大伟教授团队所赠。本研究中，将干涉系统中BSMV::α、BMSV::β和BSMV::γ空载体转染植株标记为BSMV::00，作为空载体转化对照植株。

(1)待二倍体野生型本氏烟长到6片时，将含有目的质粒的农杆菌EH105在含有Kan和Rif的YEP液体培养基中28℃，220rpm摇菌12h。

(2)4000rpm离心10min收集菌体，用等体积的农杆菌悬浮液重悬菌株。

(3)将菌液OD600＝0.7后，将分别含有BSMV::α、BSMV::β及BSMV::γ的菌液按1：1：1比例混合，28℃静置3-5h，将农杆菌注入烟草叶片。

(4)注射5～12天后，采集注射叶片及其上部第一片叶，加入20mL接种缓冲液充分研磨，将汁液涂抹于小麦一心。

(5)接种7～9天后记录病毒在小麦叶片扩展情况，并取第四片叶进行qRT-PCR，检测目的基因表达量。

对所干涉植株进行TaNPFs转录水平的检测。结果表明，获得TaNPFs沉默植株的分别1、3、5、8、9(图7)，对所获得的五个植株，选取未衰老第四片小麦叶片进行离体黑暗处理。发现处理三天后，相较于野生型及BSMV::00对照植株，TaNPFs干涉植株叶片呈现晚衰表型(图6)，分别测定处理前及处理后叶片叶绿素含量(SPAD值)及衰老相关指标离子渗透率，表明在未处理前上述叶片状态基本一致，黑暗处理三天后干涉植株叶绿素含量高于野生型，离子渗透低于野生型及对照植株，衰老相关生理数据与表型差异一致(图8、9)，说明TaNPFs干涉植株中黑暗促进的叶片衰老延迟。表明TaNPFs基因与衰老相关。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。