一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA、sgRNA表达载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA、sgRNA表达载体及其应用。

背景技术

化学控草是现代农业的必要措施和重要标志，杂草在除草剂选择压力下进化出抗药性是必然规律和现实危害，全球已有1581例杂草生物型对167种除草剂产生抗药性且呈愈演愈烈之势，任其发展将面临“无药可用”、草害猖獗的困境。

植物毒素作为一种针对植物不同过程的新型除草剂，已逐渐被人们所认识(Macías et al.,2019)。在几种中链脂肪酸中，如壬酸(CH

发明内容

为了获得抗羊脂酸作物，本发明提供以下技术方案：

一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA，所述OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA包括如SEQ ID NO.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

优选地，所示OsSHMT1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种sgRNA表达载体，所述sgRNA表达载体包含sgRNA，所述sgRNA包括如SEQ IDNO.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

一种制备sgRNA表达载体的方法，所述方法包含以下步骤：

(1)在OsSHMT1基因的第7外显子区域设计sgRNA，所述OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将得到的sgRNA插入表达载体中，得到所述sgRNA表达载体。

优选地，在步骤(2)中所述表达载体为evoAPOBEC1-SpRYCas9n、evoCDA1--SpRYCas9n和ABE8e-SpRYCas9n。

一种培育耐羊脂酸的水稻品种的方法，所述方法包含以下步骤：

(1)在OsSHMT1基因的第7外显子区域设计sgRNA；

(2)将得到的sgRNA插入表达载体中，得到所述sgRNA表达载体；

(3)将sgRNA表达载体通过农杆菌转化水稻愈伤组织，采用含有羊脂酸的培养基进行筛选，得到水稻阳性苗后采用PCR扩增或者分子测序对OsSHMT1基因的第194、207或209位进行鉴定；所述PCR扩增采用的引物组为以下任一一组：

第一对引物组：

F:TGTGTGCTGATACTAAGAAGATTTC SEQ ID NO.6，

R:AAACGAAATCTTCTTAGTATCAGCA SEQ ID NO.7；

第二对引物组：

F:TGTGTGCTGAAATCTTCTTAGTATC SEQ ID NO.8，

R:AAACGATACTAAGAAGATTTCAGCA SEQ ID NO.9；

第三对引物组：

F:TGTGTGATACTAAGAAGATTTCAGC SEQ ID NO.10，

R:AAACGCTGAAATCTTCTTAGTATCASEQ ID NO.11。

优选地，在步骤(1)中所述sgRNA包括如SEQ ID NO.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

OsSHMT1基因在培育抗羊脂酸作物中的应用，所述OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述OsSHMT1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的有益效果：

本发明在OsSHMT1基因的第7外显子区域设计sgRNA，所述OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA包括如SEQ ID NO.2-4所示的核苷酸序列中至少一种，对OsSHMT1基因进行基因编辑，可以显著提高植物对羊脂酸的耐受性。

附图说明

图1为碱基编辑器载体示意图；分别为evoAPOBEC1-SpRYCas9n碱基编辑器、evoCDA1--SpRYCas9n碱基编辑器、ABE8e-SpRYCas9n碱基编辑器；

图2为SHMT基因的序列结构；

图3为水稻转化CBE和ABE碱基编辑文库产生的SHMT基因抗性突变位点测序峰图；

图4为水稻转化CBE碱基编辑文库产生的OsSHMT1基因抗性突变位点统计；

图5为水稻转化CBE碱基编辑文库产生的OsSHMT1基因抗性突变位点表型；

图6为T1代植株T-DNA和基因型鉴定；

图7为5个株系突变体(BJ-8、BJ-9、BJ-52、BJ-69、BJ-299和BJ-120)和野生型在羊脂酸；(0.69、1.39、2.78、4.17、8.34和11.12mM)处理3d后结果图；

图8为5个株系突变体(BJ-8、BJ-9、BJ-52、BJ-69和BJ120)和野生型在2.78mM羊脂酸处理7天后结果图；

图9羊脂酸处理下突变体和野生型幼苗的抑制率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1文库构建及抗除草剂突变位点的筛选

1、构建靶向水稻内源OsSHMT1基因特定结构域的碱基编辑文库。

利用构建效率高、编辑范围广的水稻evoCDA1-SpRYCas9n(CBE)和evoAPOBEC1-SpRYCas9n(CBE)，ABE8e-SpRYCas9n(ABE)碱基编辑器。碱基编辑器可以在一定的序列窗口范围内实现C/G->T/A(CBE)或A/T->G/C(ABE)的碱基转换(Komor et al.,2016)，而evoCDA1、和evoAPOBEC1在前人研究的碱基编辑器的基础上优化而来，靶向碱基编辑的效率有进一步的提高(Thuronyi et al.,2019；Wang et al.,2022)。SpRYCas9由SpCas9改进而来，SpCas9主要识别NGG的PAM序列，而SpRYCas9大幅降低了对PAM基序的要求，几乎可以以任何三个碱基作为PAM序列，但其中对NRN的识别效率高于NYN(R＝G/A，Y＝C/T)(Walton etal.,2020)。为了进一步提高水稻碱基编辑的效率及扩大碱基编辑的范围，设计把新的脱氨酶和Cas9蛋白融合在一起，在之前开发的Anc689BE4max-nCas9和ABEmax-nCas9碱基编辑器的基础上(Wang et al.,2019)，通过更换脱氨酶和Cas9蛋白，形成了新的evoAPOBEC1-SpRYCas9n(CBE)、evoCDA1-SpRYCas9n(CBE)和ABE8e-SpRYCas9n(ABE)碱基编辑器(图1，图2)。

水稻内源OsSHMT1基因(LOC_Os03g52840)由15个外显子组成，编码514个氨基酸，其中我们将OsSHMT1的第7外显子确定为突变靶点区域(图2)。我们把CT结构域里的一些特定区段设置为碱基编辑的靶标区，把DNA序列导入CRISPR-GE网站(Xie et al.,2017)，以NRN(R＝R＝G/A)为PAM基序设计sg靶点，共生成了29条sg。我们把这些sg序列送到生工生物工程有限公司(上海)合成，然后分别克隆至evoAPOBEC1-SpRYCas9n、evoCDA1--SpRYCas9n和ABE8e-SpRYCas9n载体上，形成靶向水稻内源OsSHMT1基因的碱基编辑文库。

OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

GTGTGGTGGGTGCTGGGGCTGATCACTGCAGATAAAAACGCCACGCGAATCCACTACCTCCCAAACCCCGAGACCCCCCCGCCTCCACCACCACCCGCCGCTCGCCGCTCGCCCACCATGGCCATGGCGACGGCGCTCCGCAAGCTCTCCTCCGACGCCCTCCGCCGCCAGCCGCTCTCCCGCATCACCCCGCTCTACTACATGGTTCCGCTCTTCTTCCTCCATTTTTTCTTTAATTTTTTTTTGTTTATATCGTTGCCCTCTTGAGAAATGGTGCTTAATCCGTTCCATGGATTGGTTTGGGTTCGTGCGCTCTCGCAGGCGTCCCTGCCGGCGACGGAGGAGAGATCCGGAGTCACCGTACGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTGACTATGTGTTCCGTTGCTCGTTGGTGTCTGTGGTTTGTTCATTCGTTTTTTTTTTATTATTATTTTGTTTGTGTGTTGGATGCAGTGGCCGAAGCAGCTGAACGCGCCGCTGGAGGAGGTGGATCCCGAGATCGCCGACATCATCGAGCACGAGAAGGCCCGCCAATGGAAGGTAACCAGCAACCACCAAAAAAAAAGTGCGTGGATTGTTCAGTGTTTGGTCCACCGACGCATTGCTGAATTGTGGCAATCTGTTTGGTGCAGGGTCTGGAGCTCATCCCGTCGGAGAACTTCACCTCGGTGTCAGTGATGCAGGCGGTGGGATCCGTCATGACCAACAAGTACAGCGAGGGGTACCCCGGCGCGAGATACTACGGTGGAAACGAGTACGGTTGATTGCGTTCTATCGGTTGCCTTTGTTCAGATTATTTGGGTGTTAAAAATGTTTAATCTGAAAGAGAAATCAGTGCCTGATGGGAGTGAATGATGTGAATTTCTGGTGGCTCTGGGTTTTCCTTGCGTGCAGATACATTGATATGGCCGAGTCATTGTGCCAGAAACGTGCTTTGGAGGCCTTCCGCTTGGACCCAGCGAAATGGGGAGGTAAATCATTTTCACTCTTTATCTTGCCTTGTCATGTTTTTATATGAACTCCAGCTTTCATGCGCATCAATAGCCTTTAGTCCTCTTTTGTTTCCTGCTTTGGGCGATGTAAATGAAAAAAAAAAAGGATAGGGGCAAAAAGGTTCCTTTGGATAAGACACAGTTTTTATGGTTCCATAGTTCACAAAAAAAAAAAAAGGGATTTTGATCAGAAAATTTCTTCTAGGTTCTTAATTTACTTAGCTTCCTCACTAGTACAATGAAAAGATTACATCGTTTATAAACCACTCGGTTCTTCAGTAACCTGAATACAAATGGTACACGAGTGGTCCTATTCATTTATATTTTTCGAATTGTTTGCTTTCATTATTAACCGCTTTGTACTTAAATTTATCTAGAATACTTATTCTCAAAATTTTAGTTTTCTTTCTCCAAAAAGGTGGCATTCTAACTTGACAACCAATTTCTACCTCTGCAGTGAATGTGCAACCTCTATCAGGGTCACCTGCCAACTTCCATGTTTACACTGCCCTATTGAAACCACATGAGAGAATCATGGCTTTGGATCTTCCTCATGGTGGACATCTTTCTCACGGCTACCAGGTACATGGGTCTGGACTTCTTCATTGCCTCCTTACTACTAGTTGTTTCAGTTGGCATGCAAGCATAATGCTTCCTTCCTTGTTGTCTTTCTTTGTCCTCACAAGTTTTTCAATTCTCTCATCGTTACTATATACCAATGAGTTTCTTCCCCCTCAATTCTTAGTTATGTTCAGATATAATGCTCTTGGTACTCTCATCCTCCCATGGCTTAGTTGTTCAACTTCTTGATGGTTGCAGACTGATACTAAGAAGATTTCAGCAGTTTCGATATTCTTTGAGACAATGCCCTACAGATTGGATGAAAGCACTGGCTTGATTGATTATGATCAGGTGCAATGTCCTCCTTATCTGTTTTGTTTTAATGCCATTTAACTTATTGAATTCTCTATCATTCTTTTATAGGTATGAGTTTTCATTGGACAAAACGTGTTCTTTTTGCATCTAGCAGATTCCACAGCTGAAAATATGGTTTCAAGTAGCATTATCTAGGATATTTTTCATTGCCTCATATCTCTTTCAATTGTGAAATTATTTCAAGATGAATTTCTGCTGACATGCTTGATTTGCTACTTCTGCACAGATGGAGAAAAGTGCCGTTCTTTTTAGGCCAAAGTTGATCGTTGCGGGTGCAAGTGCATATGCGCGTCTTTATGACTATGACCGCATGCGGAAGGTGAATTTTACTGCTCAATAGTGCATGCTGAATCTTCACCTTCTGTAATCAGTCAAATAATTCACTTGTTATGCAATCTGCAGGTTTGTGACAAGCAGAAGGCAATACTTCTAGCAGATATGGCACATATCAGTGGGCTTGTCGCAGCTGGTGTTGTTCCATCTCCTTTTGATTATGCAGATGTAGTGACTACCACTACTCACAAGTCACTCCGTGGACCACGTGGAGCCATGATCTTTTACAGGAAGGGGGTGAAAGGAGTAAACAAGCAAGGCAAAGAGGTATATACTTGAGCAGAACAATAGCAAGATAGTAGCGTAGGGTGTTGGTACTGTTTCTTCTCCATCCTGTGACTCTGTGAGCTTCAAAAAAATAAAAATGCCTAATGACCCTCTACCGTCTAGGTTATGTATGACTTTGAGGACAAGATCAATGCTGCTGTCTTCCCAGGTCTGCAAGGTGGACCACATAATCATACCATTACTGGCTTAGCTGTTGCGCTTAAGCAGGTCTGTAGCACTTCTGATCCCTGATGTTTTATATTTTATAGATCACATTGTTTGCCTTTGTCTTGGACTCTAAAAGGACTTTCTAACTTCCAGGCAACTACTCCGGAGTACAGAGCTTATCAAGAGCAAGTTATGAGTAACTGTGCAAAATTTGCACAGGTATGTGTTCAAATTTTGCTAGGTTTTTTTTTTTATCTACAATATGGCTTGATCTTTCTTTATTTCACAACACTTAATAATGATTTTGTTCTTCACTTAGTTCACCTCAGCATGTTACGAATTGCAAATTATTGGTTTTTCAACATGATGAATTGTGCTTTAACATTTGAACCACTTCCTTATCTGGTGGCAATTTATCACTTCCAGAGCTTGACAGCAAAAGGCTACGAACTTGTCTCTGGTGGGACTGACAACCATTTAGTGTTGGTAAATCTCAAGAGCAAGGTAAGACAAACATGTGGGACGCTTTGGGTGTTTTGAGATATTTTAGTTCTATCTTTCAGTTTCTCTTATGAGTGCTCACCAATAAACTTTCAGCTGCTTCCTTTTAAAAAATATCGATTGATGTCTATTTAACCTCAAGCTTGCTGTTTCTGTATATAAATGATAGCTAAATGTGCTTTGCAGATAAACTTGTTTTTTTTTTTCAAATTTTTATGCCATATGGGGACAATTATCATCCTCTTCAAATTTCATGTTTAGGGCATAGATGGTTCAAGAGTGGAGAAGGTTTTAGAAAACGTGCACATTGCAGCAAACAAGAACACAGTTCCTGGTGATGTTTCAGCTATGGTACCAGGAGGCATCAGGATGGGTAAAATCTGCCCCTATGTGGTTTTTTTTTTAATTTACTTAAAATAGATTTGCAAAATCTCAATATCAGCTCCATGATCATGCAGGAACCCCAGCACTGACCTCAAGAGGATTTGTTGAGGAGGACTTTGCTAAGGTTGCTGATTTCTTCGATGCAGCAGTGAACTTGGCTTTGAAGGTTAAGGCTGCAGCAGGTCTGTCAAATTCCTAGTTTTTTTTTTGTTTGAAAATGTTGAGAATACAAAACAATTGTTGCATGCATTGAGGTGCCCTCATATGATACTTCACCCTAGGATCATCGTATTCATCATTTTGTTTTTCCCCTTGCAATTTAGGTGGAACAAAACTGAAGGACTTTGTTGCCACTTTGCAATCTGATAGCAACATTCAATCCGAGATTGCAAAACTTCGCCATGATGTGGAGGAATATGCAAAACAGTTCCCCACAATTGGGTTTGAGAAAGAAACCATGAAGTACAAGAACTAAGAAACTTTGAATGGAACAGCAAGGTATTGTCCTGACAGATAAATTGGCTCCATTTTTTTTTAGCATGCTGCATGCAGTATATTAGTTGCCTAGGCCTTGGCTCCGATCATGAACCATGTTTACTCTTTCATTGTTGCCTCAGCTTGCACCCCTTCCAGTTCTTCCACCACCGCTCCTTCCTGCATGCCGTTTTCCAGAAGCAAATTAACTGTGCATTTCTGCTATCAGTCACCGAATTCTTCTGTCGCATTTATTTCAGGGTAAAAGAAAAGGCATCAAGCTGAATTCCTGAGGTGACTGTTGGAATTCTTGCAAGAACAAGTCGGTGTAAACATATATCCATGGAGTGCCATCTTATGTAAAAGGGACCCCTGGCATTTTACAGCGTGTGGAAACTTTGTCAATAGTTCTTATCGTAGACACCTACTGTAAGATGTTATGCTAATGCTATATTAACCTTCACTATCTTCTTGGACAAGCAGTTACACATACTTTGGTGTATTCTGTGAATAATTCGCATGATTGCGGAATTTTTCGTGTTTATAAATCGTAACTTGTAATCTTTTGGCCCTGCACGCAATTTGAAAGCCCTCGATCGGATTGTCGTTTACTGCACACAA。

OsSHMT1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：

>MAMATALRKLSSDALRRQPLSRITPLYYMASLPATEERSGVTWPKQLNAPLEEVDPEIADIIEHEKARQWKGLELIPSENFTSVSVMQAVGSVMTNKYSEGYPGARYYGGNEYIDMAESLCQKRALEAFRLDPAKWGVNVQPLSGSPANFHVYTALLKPHERIMALDLPHGGHLSHGYQTDTKKISAVSIFFETMPYRLDESTGLIDYDQMEKSAVLFRPKLIVAGASAYARLYDYDRMRKVCDKQKAILLADMAHISGLVAAGVVPSPFDYADVVTTTTHKSLRGPRGAMIFYRKGVKGVNKQGKEVMYDFEDKINAAVFPGLQGGPHNHTITGLAVALKQATTPEYRAYQEQVMSNCAKFAQSLTAKGYELVSGGTDNHLVLVNLKSKGIDGSRVEKVLENVHIAANKNTVPGDVSAMVPGGIRMGTPALTSRGFVEEDFAKVADFFDAAVNLALKVKAAAGGTKLKDFVATLQSDSNIQSEIAKLRHDVEEYAKQFPTIGFEKETMKYKN*。

29条sgRNA及其检测引物及Tm温度如下：

sgRNA1：

CTGATACTAAGAAGATTTC SEQ ID NO.2

F:TGTGTGCTGATACTAAGAAGATTTC SEQ ID NO.6Tm温度＝61.1℃，

R:AAACGAAATCTTCTTAGTATCAGCA SEQ ID NO.7Tm温度＝57.0℃；

sgRNA2

CTGAAATCTTCTTAGTATC SEQ ID NO.3

F:TGTGTGCTGAAATCTTCTTAGTATCSEQ ID NO.8Tm温度＝62.7℃

R:AAACGATACTAAGAAGATTTCAGCASEQ ID NO.9Tm温度＝58.7℃

sgRNA3：

ATACTAAGAAGATTTCAGC SEQ ID NO.4

F:TGTGTGATACTAAGAAGATTTCAGC SEQ ID NO.10Tm温度＝62.7℃

R:AAACGCTGAAATCTTCTTAGTATCA SEQ ID NO.11Tm温度＝58.7℃

sgRNA4：

GAAACTGCTGAAATCTTCTT

F:TGTGTGGAAACTGCTGAAATCTTCTT Tm温度＝62.7℃

R:AAACAAGAAGATTTCAGCAGTTTC Tm温度＝58.7℃

sgRNA5：

TAAGAAGATTTCAGCAGTTT

F:TGTGTGTAAGAAGATTTCAGCAGTTT Tm温度＝61.1℃

R:AAACAAACTGCTGAAATCTTCTTA Tm温度＝57.0℃

sgRNA6：

TCAGCAGTTTCGATATTCTT

F:TGTGTGTCAGCAGTTTCGATATTCTT Tm温度＝62.7℃

R:AAACAAGAATATCGAAACTGCTGA Tm温度＝58.7℃

sgRNA7：

TCAAAGAATATCGAAACTGC

F:TGTGTGTCAAAGAATATCGAAACTGC Tm温度＝62.7℃R:

AAACGCAGTTTCGATATTCTTTGA Tm温度＝58.7℃

sgRNA8：

AGCAGTTTCGATATTCTTTG

F:TGTGTGAGCAGTTTCGATATTCTTTG Tm温度＝62.7℃R:

AAACCAAAGAATATCGAAACTGCT Tm温度＝58.7℃sgRNA9：

GTCTCAAAGAATATCGAAAC

F:TGTGTGGTCTCAAAGAATATCGAAAC Tm温度＝62.7℃R:

AAACGTTTCGATATTCTTTGAGAC Tm温度＝58.7℃

sgRNA10：

TTCGATATTCTTTGAGACAA

F:TGTGTGTTCGATATTCTTTGAGACAA Tm温度＝61.1℃

R:AAACTTGTCTCAAAGAATATCGAA Tm温度＝57.0℃

sgRNA11：

GGCATTGTCTCAAAGAATAT

F:TGTGTGGGCATTGTCTCAAAGAATAT Tm温度＝62.7℃

R:AAACATATTCTTTGAGACAATGCC Tm温度＝58.7℃

sgRNA12：

TCTTTGAGACAATGCCCTAC

F:TGTGTGTCTTTGAGACAATGCCCTAC Tm温度＝65.8℃R:

AAACGTAGGGCATTGTCTCAAAGA Tm温度＝62.1℃sgRNA13：

TCTGTAGGGCATTGTCTCAA

F:TGTGTGTCTGTAGGGCATTGTCTCAA Tm温度＝65.8℃R:

AAACTTGAGACAATGCCCTACAGA Tm温度＝62.1℃

sgRNA14：

TGAGACAATGCCCTACAGAT

F:TGTGTGTGAGACAATGCCCTACAGAT Tm温度＝65.8℃R:

AAACATCTGTAGGGCATTGTCTCA Tm温度＝62.1℃

sgRNA15：

GAGACAATGCCCTACAGATT

F:TGTGTGGAGACAATGCCCTACAGATT Tm温度＝65.8℃R:

AAACAATCTGTAGGGCATTGTCTC Tm温度＝62.1℃

sgRNA16：

ACAATGCCCTACAGATTGGA

F:TGTGTGACAATGCCCTACAGATTGGA Tm温度＝65.8℃R:

AAACTCCAATCTGTAGGGCATTGT Tm温度＝62.1℃

sgRNA17：

TCATCCAATCTGTAGGGCAT

F:TGTGTGTCATCCAATCTGTAGGGCAT Tm温度＝65.8℃R:

AAACATGCCCTACAGATTGGATGA Tm温度＝62.1℃

sgRNA18：

TGCCCTACAGATTGGATGAA

F:TGTGTGTGCCCTACAGATTGGATGAA Tm温度＝65.8℃

R:AAACTTCATCCAATCTGTAGGGCA Tm温度＝62.1℃

sgRNA19：

TGCTTTCATCCAATCTGTAG

F:TGTGTGTGCTTTCATCCAATCTGTAG Tm温度＝64.3℃

R:AAACCTACAGATTGGATGAAAGCA Tm温度＝60.4℃

sgRNA20：

GTGCTTTCATCCAATCTGTA

F:TGTGTGGTGCTTTCATCCAATCTGTA Tm温度＝64.3℃

R:AAACTACAGATTGGATGAAAGCAC Tm温度＝60.4℃

sgRNA21：

AGTGCTTTCATCCAATCTGT

F:TGTGTGAGTGCTTTCATCCAATCTGT Tm温度＝64.3℃

R:AAACACAGATTGGATGAAAGCACT Tm温度＝60.4℃

sgRNA22

TACAGATTGGATGAAAGCAC

F:TGTGTGTACAGATTGGATGAAAGCAC Tm温度＝64.3℃

R:AAACGTGCTTTCATCCAATCTGTA Tm温度＝60.4℃

sgRNA23：

ACAGATTGGATGAAAGCACT

F:TGTGTGACAGATTGGATGAAAGCACT Tm温度＝64.3℃

R:AAACAGTGCTTTCATCCAATCTGT Tm温度＝60.4℃

sgRNA24：

GCCAGTGCTTTCATCCAATC

F:TGTGTGGCCAGTGCTTTCATCCAATC Tm温度＝67.4℃

R:AAACGATTGGATGAAAGCACTGGC Tm温度＝63.8

sgRNA25

ATTGGATGAAAGCACTGGCT

F:TGTGTGATTGGATGAAAGCACTGGCT Tm温度＝65.8℃

R:AAACAGCCAGTGCTTTCATCCAAT Tm温度＝62.1℃

sgRNA26：

GATGAAAGCACTGGCTTGAT

F:TGTGTGGATGAAAGCACTGGCTTGAT Tm温度＝65.8℃

R:AAACATCAAGCCAGTGCTTTCATC Tm温度＝62.1℃

sgRNA27：

AGCACTGGCTTGATTGATTA

F:TGTGTGAGCACTGGCTTGATTGATTA Tm温度＝64.3℃

R:AAACTAATCAATCAAGCCAGTGCT Tm温度＝60.4

sgRNA28：

ATCATAATCAATCAAGCCAG

F:TGTGTGATCATAATCAATCAAGCCAG Tm温度＝62.7℃

R:AAACCTGGCTTGATTGATTATGAT Tm温度＝58.7℃

sgRNA29：

TGATCATAATCAATCAAGCC

F:TGTGTGTGATCATAATCAATCAAGCC Tm温度＝62.7℃

R:AAACGGCTTGATTGATTATGATCA Tm温度＝58.7℃

2、水稻遗传转化及羊脂酸抗性突变体的筛选

把以上构建好的碱基编辑文库分别通过农杆菌转化水稻粳稻品种秀水134的愈伤组织，以潮霉素筛选出转基因阳性愈伤。在阳性愈伤分化阶段，我们在培养基上添加了靶向OsSHMT1的羊脂酸20uM：。在该培养基上，转入空载体的愈伤组织不能分化形成幼苗，而转入CBE或ABE碱基编辑文库的愈伤组织，当OsSHMT1基因实现碱基编辑导致氨基酸突变，并且该突变位点能够对羊脂酸产生抗性时，相应的突变植株就能正常分化形成幼苗。

3、抗性突变体的基因型鉴定

CBE碱基编辑文库经过通过农杆菌转化得到了数十株T0代阳性苗，我们提取筛选到的抗性植株的叶片DNA，通过PCR及Sanger测序对OsSHMT1基因靶标区进行鉴定(图3)，结果表明这些植株相对于野生型序列在靶点区出现一个或多个碱基替换，导致一个或多个氨基酸突变，具有25种不同的基因型(图4)。将T0代植株炼苗后种植到土壤中，一些基因型不能正常生长并死亡(图5)。在T1代中，通过PCR反应鉴定T-DNA分离情况，Sanger测序对SHMT基因靶标区进行基因型鉴定(图6)，找到T-DNA free和纯合的突变体进行进一步的实验。

4、抗性突变体对羊脂酸的耐受性

对T2代的T-DNA分离的纯合突变株体进行了羊脂酸耐受性实验(图7，图8)。大多数基因型与野生型无显著差异。只有3个基因型(T194A、D207N和D209N)突变体表现出对羊脂酸的耐受性，而野生型植株在2.78mM CAP处理后3天死亡(图8)。对于T194A、D207N和D209N突变体，羊脂酸的EC50分别为2.791mM、3.378mM和2.514mM，而野生型植株的EC50为1.675mM(图9)。这一数据表明，OsSHMT1基因突变的羊脂酸耐受性是可遗传的。