DSS及其衍生物制备防治高原病药物的应用

技术领域

本发明涉及丹参素(DSS)和其衍生物丹参素异丙酯(IDHP)的新应用，具体涉及参素(DSS)和其衍生物丹参素异丙酯(IDHP)用于预防和治疗高原缺氧诱导急慢性疾病及制备相关药物。

背景技术

β-(3,4-二羟基苯基)乳酸(DSS)是从丹参根及根茎中分离得到的一种酚性芳香酸类水溶性化合物。丹参素异丙酯(IDHP)是DSS的衍生物。DSS和IDHP均在心血管疾病方面有治疗作用。

发明内容

发明人构建低压缺氧诱导的急性高原反应(AMS)动物模型用于研究DSS和及其衍生物IDHP等的药理作用，发现：DSS和其衍生物IDHP可显著提高缺氧诱导的急性高原反应小鼠生存率和存活时间；其中未用药组AMS小鼠死亡率高，心肌纤维大量断裂，心肌组织结构不完整、层次混乱，有不同程度的水肿、坏死、空泡变性及核固缩现象；脑细胞排列稀疏，界限不清，空泡化现象严重，海马结构被破坏，细胞核固缩、胞质染色加深，有明显的炎性细胞浸润；给予DSS或IDHP的小鼠心肌纤维纹理较整齐、组织层次清晰，界限较完整，水肿较少，细胞核固缩和空泡变性明显减少；小鼠脑细胞周围间隙缩小，核固缩减轻，细胞排列和海马结构整齐；DSS或IDHP能够升高AMS小鼠血糖水平，降低血乳酸、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-1β(IL-1β)、S100β、核转录因子-κB(NF-κB)水平，抗组织氧化应激，升高抗氧化谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平，升高脑组织和肺组织线粒体复合物活性。证实了DSS和其衍生物IDHP等可用于抗急性高原反应。

发明人通过采用低压氧舱模拟高原环境制备高原脑水肿(High altitudecerebral edema，HACE)大鼠模型，经研究发现DSS和其衍生物IDHP可降低HACE大鼠脑指数和脑含水量。未用药HACE大鼠的脑细胞核固缩，部分细胞呈空泡样，海马CA3区丧失正常结构，椎体细胞层次混乱并大量萎缩，海马区紧密连接蛋白occludin和神经元标志物Neun表达下降；IDHP显著改善大鼠脑组织海马结构损伤，增强脑组织中occludin和神经元标志物Neun的表达；未给药模型大鼠的脑含水量增加了7.92％，脑组织中GSH-Px水平降低，血中LD、IL-1β、TNF-α、NF-κB、S100β、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和水通道蛋白4(AQP4)浓度增加；IDHP能够升高机体GSH-Px、Na

基于上述发现，本发明提供了丹参素及其衍生物丹参素异丙酯IDHP及药学上可接受的盐用于制备预防和治疗缺氧诱导的急性高原反应或/和急性脑水肿药物的应用。所述药物剂型可为滴丸剂、口颊片、片剂、缓释片、糖衣片或口服液。

附图说明

图1为IDHP对缺氧诱导的急性高原反应小鼠的死亡率影响。

图2为AMS模型小鼠脑组织病理切片HE染色，A图为AMS小鼠脑组织皮层(200×)；B图为AMS小鼠脑组织海马(200×)。

图3为IDHP降低急性高原反应小鼠炎症因子(A)和血脑屏障相关因子(B)指标测定结果(Mean±SD，n＝7),与Con组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，

图4为IDHP对急性高原反应小鼠氧化应激指标影响(Mean±SD，n＝7)，与Con组相比，*P<0.05；与Mod组相比，

图5为IDHP对急性高原反应小鼠能量代谢指标影响(Mean±SD，n＝7)，与Con组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，

图6为IDHP对急性高原反应小鼠脑组织线粒体复合物活性测定代表性曲线(A)和数据(B)(Mean±SD，n＝8)，与Con组相比，**P<0.01；与Mod组相比，

图7为IDHP降低高原脑水肿大鼠脑含水量(B)和脏器指数(A)(Mean±SD，n＝7)，与Con组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，

图8为IDHP降低高原脑水肿大鼠BBB损伤相关指标盒炎症反应相关指标测定结果(Mean±SD，n＝7),与Con组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，

图9为IDHP对高原脑水肿大鼠氧化应激GSH-Px和能量代谢指标影响(Mean±SD，n＝7)，与Con组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Mod组相比，

图10为HACE模型大鼠脑组织病理切片HE染色，A图为HACE大鼠脑组织皮层(200×)；B图为HACE大鼠脑组织海马CA3区(200×)。

图11为HACE模型大鼠脑组织海马区occludin和Neun免疫荧光双染图。

图12为IDHP预防处理对急性高原脑水肿大鼠VEGF、MMP-9和AQP4蛋白表达的影响(Mean±SD，n＝3)，与Mod组相比，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

除非有特殊说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的认识理解或采用已知相关方法实现。

缺氧(hypoxia)是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧诱导的高原脑水肿是高原病发生发展过程中最为严重的阶段，其临床表现为头痛、协调丧失、虚弱、意识水平降低，有时还会造成神经功能损伤，如果没有适当治疗，可能会引起昏迷或死亡。

在缺氧的作用下，机体发生炎症反应、能量代谢障碍、缺氧损伤，炎症反应在HACE中起重要作用，核转录因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)在缺氧条件下刺激细胞黏附、免疫刺激和炎性细胞趋化等相关的基因引起炎症反应。缺氧还可以通过激活NF-κB信号通路增加皮质内炎症细胞因子白细胞介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的表达。IL-1β是最重要的促炎因子，IL-1β可以通过激活NF-κB来促进MMP-9的表达，IL-1β的产生和NF-κB信号通路激活会放大炎症信号并加重脑损伤。人体所需能量的90％以上由线粒体提供，线粒体是机体释放能量和进行有氧呼吸的场所，在缺氧条件下线粒体密度下降，能量代谢从有氧变为无氧，促使乳酸产生增多，能量消耗增加，血糖水平降低，肝脏通过分解糖原维持血糖水平。线粒体呼吸链是线粒体中活性氧形成的主要来源，主要通过氧化还原反应产生活性氧。线粒体合成ATP在大脑能量代谢过程中发挥着重要的作用，缺氧会造成自由基蓄积引起线粒体损伤导致ATP合成障碍，引起Na

当机体长时间处于缺氧状态时，有报道表明HACE大鼠血浆中ROS得不到及时有效的清除，丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量增加，进而攻击富含脂质的脑组织细胞膜，导致过氧化脂质的形成和血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)损伤进而引起HACE。以下实施例选用AMS模型以代表急性高原反应疾病；HACE模型用于代表急性脑水肿疾病。

以下实验所用的DSS及其衍生物IDHP(式Ⅰ)色谱纯度大于等于98％，所用试剂为市场采购，所使用的实验动物均为SPF级实验动物，并在SPF级实验室开展研究。

如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。

实施例1:发明人研究发现DSS和IDHP能够降低缺氧诱导的AMS的小鼠的死亡率步骤：

(1)药品配制：

丹参水提液(DSW)的制备：称量180g丹参药材于圆底烧瓶内，加入800mL纯水浸泡30min，加热回流提取3次，每次1h，过滤，将3次提取液合并浓缩，得到浓度为1g/mL的药材水提取液，分别用纯水稀释为0.125g/mL和0.25g/mL的丹参水提取液。HPLC检测丹参中DSS含量为0.36％，因此1.25g/kg丹参水提物同剂量的DSS设置给药剂量为4.5mg/kg。

DSS药液的配制：精密称量DSS 0.45g置于50mL容量瓶中，用纯水定容，配制成终浓度为9mg/mL的DSS溶液，取适当体积用纯水分别稀释为0.1125mg/mL、0.45mg/mL、1.8mg/mL的DSS溶液。

IDHP药液的配制：精密称量IDHP 0.45g置于50mL容量瓶中，用纯水定容，配制成浓度为9mg/mL的IDHP溶液，取适当体积用纯水分别稀释为0.1125mg/mL、0.45mg/mL、1.8mg/mL的IDHP溶液。

红景天苷(SAL)药液的配制：精密称定SAL 22.5mg置于50mL容量瓶中，用纯水定容配制成为0.45mg/mL的SAL溶液。

乙酰唑胺(ACZ)药液的配制：精密称定ACZ 100mg置于50mL容量瓶中，用纯水定容配制成为2mg/mL的ACZ溶液。

(2)分组及造模：

使用昆明雄性小鼠(18-20g)，提前三天饲养动物使其适应动物房环境，提供饲料和水，实验前12小时禁食禁水；

SPF级雄性昆明小鼠165只，体重18-22g，适应性喂养3天后按体重随机分组，每组15只，随机分为常氧Con组，低氧Mod组(采用低压氧舱抽真空减压至氧分压为5.2kpa，并保持1小时)，低氧1.25g/kg DSW组(1.25g/kg DSW指每天每1kg体重量给药1.25gDSW，其他组含义类同)，低氧2.5g/kg DSW组(低氧的氧分压为5.2kpa，2.5g/kg DSW指每天每1kg体重量给药2.5gDSW)，低氧1.125mg/kg DSS组(1.125mg/kg DSS指每天每1kg体重量给药1.125mgDSS)，低氧4.5mg/kg DSS组(4.5mg/kg DSS指每天每1kg体重量给药4.5mgDSS)，低氧18mg/kg DSS组(18mg/kg DSS指每天每1kg体重量给药18mgDSS)，低氧1.125mg/kg IDHP组(1.125mg/kg IDHP指每天每1kg体重量给药1.125mgIDHP)，低氧4.5mg/kg IDHP组(4.5mg/kg IDHP指每天每1kg体重量给药4.5mgIDHP)，低氧18mg/kg IDHP组(18mg/kg IDHP指每天每1kg体重量给药18mgIDHP)，低氧4.5mg/kg SAL组(4.5mg/kg SAL指每天每1kg体重量给药4.5mgSAL)组，低氧20mg/kg ACZ组(20mg/kg ACZ指每天每1kg体重量给药20mgACZ)，每天灌胃给药2次，连续给药3天。空白对照组灌胃给予等体积水。

在第4天给药40min后将动物放入低压舱，密闭舱门，以1km/min速度减压，上升海拔高度至5km时停留3min，继续以1km/min速度减压，上升海拔高度至8km时停留3min，最终以1km/min速度减压上升至海拔高度10000m，维持1h，观察记录动物死亡时间和死亡数量，调节进气孔阀门，缓慢降至正常海拔高度，打开舱门，取出动物，收集血液及主要脏器组织，用于测定各项生化指标；统计动物死亡率，并进行方差分析。

(3)统计：用统计软件GraphPad Prism 6.02绘制小鼠生存率曲线进行统计分析。预防实验结果：

如图1所示，急性减压缺氧实验结果表明，Con组作为正常对照组未进舱且生存率100％；海拔1万米维持1h期间，Mod组小鼠生存率为40％，与Mod组相比，DSS组小鼠生存率提升至为80％；IDHP组小鼠生存率均升高，1.125mg/kg IDHP组、4.5mg/kg IDHP组、18mg/kgIDHP组生存率分别为80％、90％、60％；ACZ组小鼠生存率为50％。

实施例2:发明人研究发现DSS和IDHP能改善急性高原反应小鼠脑组织病理学改变。

该实施例通过取实施例1中各组三只小鼠右脑组织，4％多聚甲醛固定24小时以上，石蜡包埋、固定、切片，苏木精伊红(HE)染色。

步骤：

(1)将小鼠眼眶取血后取出右脑组织，每组三只；摘取后培养皿中用PBS冲洗表面血渍，用滤纸吸干水分，固定于4％多聚甲醛中24小时，石蜡包埋，切片5μm，苏木精伊红(HE)染色；

(2)制备好的切片于显微镜下观察并拍摄观察脑组织大脑皮层和海马区缺氧损伤和组织水肿程度。

预防实验结果：

如图2所示，Con组小鼠脑组织层次清晰，海马结构完整，细胞核染色均匀。Mod组脑组织有明显水肿现象，细胞排列稀疏，界限不清，空泡化现象严重，海马结构被破坏，细胞核固缩数目增多、胞质染色加深，有明显的炎性细胞浸润。DSW、DSS和IDHP均能预防AMS引起的脑组织缺氧损伤，DSW组小鼠脑组织核固缩减轻，DSS组和IDHP组小鼠脑组织细胞周围间隙缩小，核固缩减轻，细胞排列和海马结构整齐。SAL组和ACZ组小鼠脑组织核固缩情况和海马结构较模型组排列整齐。结果表明DSS和IDHP均能预防AMS引起的脑组织缺氧损伤，IDHP的改善作用明显。

实施例3:发明人研究发现DSS和IDHP能够抑制高原脑水肿大鼠炎性因子和血脑屏障损伤相关因子表达。

步骤：

(1)对于实施例1各组存活小鼠，每组7只，麻醉后摘眼球采全血，肝素钠抗凝，12000rpm离心15min取血浆，分装，-80℃冻存剩余血浆。按生化试剂盒说明书测定指标NF-κB、TNF-α、IL-1β和S100β浓度。

(2)运用SPSS22软件进行数据处理统计，采用单因素ANOVA 分析显著性，数据以平均值±方差

预防实验结果：

如图3A所示，与Con组相比，Mod组小鼠血浆中IL-1β升高35.26％，TNF-α升高63.38％，NF-κB升高62.97％(P<0.05)。与Mod组相比，DSS和IDHP能够降低小鼠血浆促炎因子水平，DSS能够剂量依赖性的降低血浆中IL-1β和NF-κB水平，IDHP能够剂量依赖性的降低IL-1β水平，同时各剂量IDHP均能够显著下调升高的NF-κB和TNF-α。

如图3B所示，与Con组相比，Mod组小鼠血浆S100β升高43.94％(P<0.01)。与Mod组相比，给药1.25g/kg DSW可以降低S100β浓度，4.5mg/kg IDHP和18mg/kg IDHP降低S100β浓度作用优于同剂量DSS，ACZ对S100β无改善作用。结果表明DSS和IDHP能有效抑制缺氧引起的炎症反应，保护缺氧状态下的血脑屏障功能发挥抗AMS作用。

实施例4:发明人研究发现DSS和IDHP能显著影响急性高原反应小鼠氧化应激指标步骤：

(1)分别取实施例1各组存活7只小鼠脑组织用预冷的生理盐水冲洗去除血液残渣，滤纸吸干水分后准确称取50mg加入相应体积的生理盐水，在预冷的匀浆器中研磨，离心10min，收集上清液，按照生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书中步骤测定脑组织指标MDA的表达水平。

(2)运用SPSS22软件进行数据处理统计，采用单因素ANOVA分析显著性，数据以平均值±方差

预防实验结果：

MDA是过氧化的常用指标。如图4所示，与Con组相比，Mod组MDA含量升高65.09％(P<0.05)，IDHP组能够剂量依赖性的降低MDA，18mg/kg IDHP作用最强，降低了35.68％，DSS的作用不如IDHP显著，ACZ和SAL均能降低MDA含量。结果表明IDHP能够抑制缺氧引起的脑组织氧化应激损伤，

实施例5:发明人研究发现DSS和IDHP能影响急性高原反应小鼠能量代谢指标。

步骤：

(1)对于实施例1各组存活小鼠，每组7只，摘眼球采全血并用血糖试纸测量血糖，将全血低温下8000r/min离心10min，吸取上层血浆用生化试剂盒(北京怡成生物电子技术股份有限公司)检测血乳酸(LD)和肝糖原。

(2)运用SPSS22软件进行数据处理统计，采用单因素ANOVA分析显著性，数据以平均值±方差

预防实验结果：

通过测定血糖、LD与肝糖原指标考察DSS和IDHP调节能量代谢紊乱的作用。如图5所示，与Con组相比，Mod组小鼠血糖、肝糖原、LD浓度显著升高。与Mod组相比，各实验药物均可升高血糖、降低LD水平，4.5mg/kg IDHP组和18mg/kg IDHP组降低LD生成作用优于同剂量的DSS，18mg/kg IDHP组改善作用最强，降低了59.68％，IDHP同时升高肝糖原含量。结果表明IDHP和DSS通过改善血糖和血乳酸代谢紊乱发挥抗AMS作用。

实施例6:发明人研究发现DSS和IDHP能提高急性高原反应小鼠线粒体复合物活性

精密称量实施例1各组存活小鼠脑组织50mg，加到含有0.5mL预冷新鲜线粒体呼吸培养基(MIR05)的Ep管中转移到FT500-PS粉碎机脉冲管中进行组织依匀浆。将谷氨酸盐和苹果酸盐加入样品室，为复合物I(NADH脱氢酶)提供NADH，用鱼藤酮抑制复合物I，加入饱和浓度的ADP和琥珀酸以支持复合物II(琥珀酸脱氢酶)呼吸，用丙二酸抑制复合物II，并加入甘油-3-磷酸以支持复合物III(细胞色素bc1氧化还原酶)的呼吸，用抗霉素A抑制复合物III(细胞色素c还原酶)，然后用三甲基-戊二醇和抗坏血酸盐刺激复合物IV(细胞色素C氧化酶)。耗氧率由血氧描记图计算。

预防实验结果：

如图6所示，与Con组相比，Mod组脑组织线粒体复合物V(F1F0-ATP合酶)活性降低55.78％，复合物I活性降低17.69％，复合物II活性降低32.03％，复合物III活性降低8.52％，复合物IV活性显著降低16.47％(P<0.05)。与Mod组相比，所有实验药物均能够增加缺氧引起的降低的脑组织线粒体复合体活性，IDHP组小鼠脑组织线粒体复合物II、V活性高于DSS，DSS组小鼠脑组织线粒体复合物III、IV活性高于IDHP，ACZ过度增强线粒体复合物II、III、V活性。

实施例7:发明人研究发现DSS和IDHP能够降低缺氧诱导的HACE大鼠的脑含水量和脑组织脏器指数。

步骤：

(1)药品配制：

丹参水提液(DSW)的制备：称量180g丹参药材于圆底烧瓶内，加入800mL纯水浸泡30min，加热回流提取3次，每次1h，过滤，将3次提取液合并浓缩，得到浓度为1g/mL的药材水提液，用纯水稀释为0.09g/mL的丹参水提取液。

DSS药液的配制：精密称量DSS 0.1g置于50mL容量瓶中，用纯水定容，配制成终浓度为2mg/mL的DSS溶液。

IDHP药液的配制：精密称定IDHP 1g置于50mL容量瓶中，用纯水定容，配制成浓度为20mg/m L的IDHP溶液，取适当体积纯水分别稀释为0.8mg/mL、2mg/mL、5mg/mL的IDHP溶液。

乙酰唑胺(ACZ)药液的配制：精密称定ACZ 75mg置于50mL容量瓶中，用纯水定容配制成为1.5mg/mL的ACZ溶液。

(2)分组及造模：

SPF级雄性SD大鼠饲养适应3天后按体重随机分组，每组9只，分别设为常氧Con组，低氧Mod组，低氧0.9g/kg DSW组，低氧20mg/kg DSS组，低氧8mg/kg IDHP组，低氧20mg/kgIDHP组，低氧50mg/kg IDHP组，低氧15mg/kg ACZ组，每天灌胃给药2次，连续给药3天，第4天给药40min后，低氧组大鼠放入低压低氧实验舱，以450m/min的速度上升至8000m维持10h后，以450m/min的速度降至平面高度。打开舱门，取出动物，麻醉后迅速收集大鼠全血加入肝素钠抗凝采血管。解剖取大脑，使用生理盐水清洗，用滤纸吸干表面水分并分为左右两个半脑，用精密电子天平快速称重左半脑，然后将左半脑置于100℃恒温烘箱中烘24h，以达到恒干重(平均称重误差<0.002g)。根据Elliot公式，计算脑含水量百分率：脑含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

(3)统计：用统计软件GraphPad Prism 6.02绘制

预防实验结果：

如图7所示,与Con组大鼠相比，Mod组大鼠脑脏器指数和脑含水量显著升高(P<0.01或P<0.05)，脑含水量增加7.92％。与Mod组大鼠脑脏器指数相比，ACZ、DSW、DSS、20mg/kg IDHP和50mg/kg IDHP均能够降低脑脏器指数，20mg/kg IDHP降低作用最显著，20mg/kgIDHP作用最明显。与Mod组脑含水量相比，DSS和50mg/kg IDHP降低脑含水量，DSS组降低作用最强，降低了7.51％。

实施例8:发明人研究发现DSS和IDHP能够抑制高原脑水肿大鼠炎性因子和血脑屏障损伤相关因子(S100β)表达。

步骤：

(1)对于实施例7各组存活大鼠，每组7只，采全血，肝素钠抗凝，12000rpm离心15min取血浆，分装，按南京建成生物工程研究所生化试剂盒说明书测定指标NF-κB、TNF-α、IL-1β和S100β浓度。

(2)运用SPSS22软件进行数据处理统计，采用单因素ANOVA分析显著性，数据以平均值±方差

预防实验结果：

如图8所示，采用ELISA试剂盒检测大鼠血液中TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达，与Con组相比，高海拔环境对大鼠脑组织造成了炎症损伤，缺氧使血液中TNF-α、IL-1β和NF-κB分别上调26.03％、106.35％、114.82％(P<0.05或P<0.01)；DSW、DSS和IDHP可以降低缺氧大鼠血中促炎因子的水平，IDHP组降低TNF-α、NF-κB的作用呈现量效关系，50mg/kg IDHP组使TNF-α降低了33.72％，NF-κB降低了57.41％，IL-1β降低了47.41％，接近正常动物水平；ACZ降低NF-κB和IL-1β生成。IDHP通过减轻炎症反应缓解HACE损伤。

采用ELISA试剂盒检测大鼠血浆中S100β的生成，与Con组相比，缺氧使血浆中S100β上调75.70％(P<0.05)，与Mod组相比，DSW、DSS和IDHP均降低S100β的生成，50mg/kg IDHP组降低作用最明显，降低了51.43％。

实施例9:发明人研究发现DSS和IDHP能提高高原脑水肿大鼠过氧化物酶活性和能量代谢指标。

步骤：

(1)戊巴比妥钠麻醉实施例7各组存活大鼠，每组7只，摘取大鼠脑组织用预冷的生理盐水冲洗去除血液残渣，滤纸吸干水分后准确称取50mg加入相应体积的生理盐水。在预冷的匀浆器中研磨，离心10min，收集上清液，按照生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书中步骤测定脑组织指标GSH-PX活力、Na

(2)运用SPSS22软件进行数据处理统计，采用单因素ANOVA分析显著性，数据以平均值±方差

预防实验结果：

如图9所示，与Con组相比，Mod组GSH-Px活性降低了17.85％(P<0.01)；与Mod组相比，DSW、DSS、IDHP均能够提高GSH-Px活力，50mg/kg IDHP组改善作用最强，GSH-Px活性增加了66.24％；ACZ提高GSH-Px活性。

与Con组相比，进入高海拔环境导致Mod组大鼠脑组织Na

实施例10:发明人研究发现DSS和IDHP能改善高原脑水肿大鼠脑组织病理学改变。

该实施例通过取实施例7各组三只大鼠右脑组织，4％多聚甲醛固定24小时以上，石蜡包埋、固定、切片，苏木精伊红(HE)染色。

步骤：

(1)将大鼠麻醉颈动脉取血后取出右脑组织，每组三只。摘取后培养皿中用PBS冲洗表面血渍，用滤纸吸干水分，固定于4％多聚甲醛中24小时，石蜡包埋，切片2mm，HE染色；

(2)制备好的切片于显微镜下观察并拍摄观察脑组织大脑皮层和海马CA1区、CA3区缺氧损伤和组织水肿程度。

预防实验结果：

如图10所示，Con组脑组织中皮质和海马显示正常的细胞结构和层次排列；Mod组脑组织中，皮质神经细胞核固缩，部分细胞呈空泡样改变，血管缝隙明显扩张，海马CA3区丧失正常结构，脑毛细血管充血，椎体细胞层次混乱不规则，可见大量萎缩的椎体细胞，细胞核呈黑色染色；DSW减轻核固缩和海马区结构损伤，DSS缓解皮质血管的充血和细胞核固缩，减少CA3区萎缩的椎体细胞数量；IDHP改善大鼠脑组织海马结构损伤，血管和细胞水肿减轻以及血管周围腔隙减小；ACZ可以缓解核固缩。DSW、DSS和IDHP可以防治HACE大鼠脑组织结构病理改变，IDHP防治作用最强。

实施例11:发明人研究发现DSS和IDHP能够维持高原缺氧大鼠血脑屏障的作用。

步骤：

将实施例7各组存活小鼠组织切片洗涤置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；依次进行双氧水封闭与血清封闭，轻轻甩掉封闭液后，加紧密连接蛋白occludin和小鼠抗神经元核心抗原Neun单克隆抗体在黑暗中孵育50min；添加二级抗体山羊抗兔Alexa488共轭抗体和山羊抗兔CY3标记抗体。最后用4，6-二氨基-2-苯基环吲哚在26℃的黑暗中染色10min，在倒置荧光共聚焦激光扫描显微镜下观察染色结果。

预防实验结果：

如图11所示，与Con组相比，Mod组海马区紧密连接蛋白occludin和神经元标志物Neun表达下降，说明高原缺氧引起BBB破坏，导致大鼠脑损伤。DSW、DSS和IDHP可以增强脑组织中occludin和神经元标志物Neun的荧光信号强度，降低BBB透过率，减轻HACE脑损伤。

实施例12:发明人研究发现DSS和IDHP能够影响高原脑水肿大鼠脑组织中VEGF，MMP-9，AQP4的表达。

该实施例通过采用蛋白免疫印迹法测量实施例7各组小鼠组织中VEGF，MMP-9，AQP4的表达。

步骤：

(1)蛋白提取：每组3只，戊巴比托纳麻醉后固定，解剖大鼠取全脑组织用PBS清洗血渍，滤纸吸干后称取动物组织50mg左右，冰上置于1.5ml离心管中，按照比例100mg/ml，加入1％ PMSF裂解液500ul，然后在离心管中加入锆株于组织研磨器研磨2-4分钟，研成组织匀浆没有大型组织块即可，冰上反复吹打裂解30分钟后于4℃，12000rpm离心25分钟取上清；

(2)蛋白定量：采用碧云天BCA蛋白定量试剂盒，将待测样品按照说明书操作分别加入96孔板中，37℃孵育20-30分钟，震荡混匀，562nm处测量吸光度值，建立标准曲线，计算蛋白浓度；

(3)样品制备：将定量好的样品蛋白，加入1/4溴酚蓝缓冲液(SDS-PAGE sampleloading buffer)，震荡混匀，100℃，5分钟金属浴加热使蛋白质变性，放凉至室温，4℃，12000rpm离心5分钟，制好的样品可保存在-20℃冰箱待测。

(4)SDS-PAGE凝胶电泳：取样品蛋白，在制好的8％琼脂糖凝胶上样，恒压80V至蛋白跑出浓缩胶，进入分离胶后换成恒压100V，待蛋白跑至所需范围内之后，停止电泳开始转膜，将分子片段转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，恒压100V冰上转膜60分钟，然后用5％脱脂牛奶封闭60分钟，裁膜，用TBST缓冲液洗涤三次5分钟，一抗孵育过夜，次日同样用TBST缓冲液将膜洗涤三次5分钟，二抗孵育1小时，再用TBST缓冲液将膜洗涤三次5分钟，最后滴加化学发光液用化学发光成像系统(Chemiscope 6100)成像拍摄。

(5)用image J图像分析软件，对分子片段条带进行灰度分析统计。

预防实验结果：

对高原脑水肿大鼠脑组织进行组织蛋白Western blot分析结果，如图12所示，与Con组相比，Mod组大鼠脑组织VEGF、MMP-9、AQP4蛋白表达水平上升；与Mod组相比，DSW、DSS和IDHP降低HACE大鼠脑组织中VEGF蛋白表达，20mg/kg IDHP组降低VEGF作用最强；DSS、IDHP降低MMP-9蛋白表达(P<0.05)，50mg/kg IDHP组降低作用最强；DSW、DSS和IDHP降低HACE大鼠脑组织AQP4蛋白的表达，8mg/kg IDHP组降低作用最强。ACZ可以降低MMP-9、AQP4蛋白的表达。结果表明IDHP通过逆转VEGF、MMP-9在缺氧下的上升，减少AQP4蛋白的生成，降低血管透过性并且减少水分进入脑组织，防治HACE。