一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及乳制品检测技术领域，尤其涉及一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用。

背景技术

目前市售乳及乳制品多种多样，特色乳品因其丰富的营养价值更受市场广泛关注。当前市售乳品除常见的牛乳外，还有水牛乳、牦牛乳、驼乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳7种动物源性乳品。近年来，商品化的水牛乳、羊乳、驼乳、马乳和驴乳等特色乳产品进入大众消费市场，已有研究表明多种特色乳营养价值高于牛乳，是特需人群重要营养来源且对某些疾病的辅助治疗具有独特的效果。但另一方面，由于这些乳品因产量低、价格高，市场上频频出现不法商家为谋取利益，将乳品以次充好或使用假冒伪劣乳品进行售卖的现象。这种行为不仅侵害了消费者权益，且标签不明或故意隐藏成分导致人体过敏反应和饮食文化的不利影响，影响了乳品产业的健康发展。

如今，已有多种检测技术和标准用于乳品掺伪的源性鉴定。基于蛋白质或脂肪的理化鉴定方法，如色谱、质谱、光谱和等电聚焦等技术，由于市售乳及乳制品多经过高温高压等加工过程造成部分蛋白质、脂肪变性，检测特异性差而导致检测结果呈假阴性，且所需设备昂贵。相比之下，基于物种特异性DNA的分析技术在物种鉴定中更具优势。乳中含有乳腺体细胞，是DNA分子的主要来源，可以用于乳源鉴定，且DNA分子相对于蛋白质更稳定，特异性更高。因此，基于DNA分子的检测技术在乳及乳制品源性检测领域得到广泛应用。其中，基于PCR及其衍生技术开发的检测方法应用最为广泛，此类技术仅需少量DNA分子，便可获得足够分析的基因组信息，准确鉴定到物种，灵敏度高，特异性强。但同时，普通PCR方法受到时间以及检测通量的限制，不能满足大批量以及多物种混合成分同时筛选鉴定的需求。随着荧光定量PCR仪的多通道荧光检测的开发和应用，多重荧光PCR方法可在单管反应体系中一次检测多个物种靶标，PCR效率更高，可实现快速高通量检测分析。目前已有基于荧光PCR技术开发的乳制品真伪检测相关技术方法和标准，但主要基于单通道荧光或非特异性显色以及针对单一源性成分的检测，尚不能满足高通量快速筛查检测的需求。而基于多通道的多重PCR方法存在乳用动物覆盖种类少以及反应体系可能的交叉反应和体系优化繁琐等不足，因此基于这一平台的动物乳源性高通量检测技术相对较少。

因此，基于市售乳品掺伪现状和其源性成分鉴定需求，建立一种可同时检测市售乳品成分来源的检测方法，为市场监管和乳品鉴定提供技术支持，对提高市场监管能力和维护消费者权益都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用。本发明使用1对通用引物和2对特异性引物，以及多个物种特异性探针，组合成双管双重PCR体系，实现了2管PCR反应对8个物种的高通量检测，降低了多重PCR体系引物间的交叉反应和优化难度，提高了检测效率。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括内参上游引物16S1F、内参下游引物16S1R、马源上游引物HF1、马源下游引物HR1、驴源上游引物DF1、驴源下游引物DR1、通用上游引物A2-F、通用下游引物B4-R、内参探针16SP2、水牛特异性探针BP4、山羊特异性探针GP1、绵羊特异性探针SP、马特异性探针HP1-1、骆驼特异性探针CP2、牦牛特异性探针YP1、驴特异性探针DP1S、奶牛特异性探针TP2；

所述内参上游引物16S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述内参下游引物16S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述马源上游引物HF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述马源下游引物HR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述驴源上游引物DF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述驴源下游引物DR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述通用上游引物A2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述通用下游引物B4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述内参探针16SP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述水牛特异性探针BP4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述山羊特异性探针GP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述绵羊特异性探针SP的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述马特异性探针HP1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述骆驼特异性探针CP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

所述牦牛特异性探针YP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述驴特异性探针DP1S的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

所述奶牛特异性探针TP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

优选的，所述内参探针16SP2、水牛特异性探针BP4和骆驼特异性探针CP2序列的5'端修饰有报告基团FAM，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；山羊特异性探针GP1和牦牛特异性探针YP1序列的5'端修饰有报告基团VIC，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；绵羊特异性探针SP和驴特异性探针DP1S序列的5'端修饰有报告基团ROX，3'端修饰有淬灭基团BHQ2；马特异性探针HP1-1和牛特异性探针TP2序列的5'端修饰有报告基团CY5，3'端修饰有淬灭基团BHQ3。

本发明还提供了一种上述引物和探针组合在制备基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品试剂或试剂盒中的应用，所述动物源性乳及乳制品来自奶牛、水牛、牦牛、骆驼、山羊、绵羊、马和驴。

本发明还提供了一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针组合。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒鉴定8种动物源性乳及乳制品的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)采用上述引物和探针组合配制荧光PCR反应体系，并设置阳性对照和空白对照，对所述待测样品的DNA进行荧光PCR扩增；

(3)根据荧光PCR扩增结果，进行结果判定；

所述荧光PCR反应体系包括管1体系、管2体系、内参体系；所述阳性对照包括管1阳性对照和管2阳性对照；

所述管1阳性对照以水牛、山羊、绵羊和马的混合DNA为模板进行扩增，所述管2阳性对照以骆驼、牦牛、驴和奶牛的混合DNA为模板进行扩增；

所述空白对照为ddH

优选的，所述管1体系为2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上、下游引物mix各0.5μL，探针mix 1.0μL，待测样品的DNA2.0μL，ddH

所述上游引物mix包括马源上游引物HF1、通用上游引物A2-F；所述下游引物mix包括马源下游引物HR1、通用下游引物B4-R；所述探针mix包括水牛特异性探针BP4、山羊特异性探针GP1、绵羊特异性探针SP、马特异性探针HP1-1；

所述管1体系中，马源上游引物HF1的终浓度为40～60nM，通用上游引物A2-F的终浓度为120～180nM，马源下游引物HR1的终浓度为40～60nM，通用下游引物B4-R的终浓度为120～180nM，水牛特异性探针BP4的终浓度为100～140nM，山羊特异性探针GP1的终浓度为100～140nM，绵羊特异性探针SP的终浓度为100～140nM，马特异性探针HP1-1的终浓度为30～50nM；所述待测样品的DNA的终浓度为0.4～2.0ng/μL。

优选的，所述管2体系为2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上、下游引物mix各0.5μL，探针mix 1.0μL，待测样品的DNA2.0μL，ddH

所述上游引物mix包括驴源上游引物DF1、通用上游引物A2-F；所述下游引物mix包括驴源下游引物DR1、通用下游引物B4-R；所述探针mix包括骆驼特异性探针CP2、牦牛特异性探针YP1、驴特异性探针DP1S、奶牛特异性探针TP2；

所述管2体系中，驴源上游引物DF1的终浓度为40～60nM，通用上游引物A2-F的终浓度为120～180nM，驴源下游引物DR1的终浓度为40～60nM，通用下游引物B4-R的终浓度为120～180nM，骆驼特异性探针CP2的终浓度为180～220nM，牦牛特异性探针YP1的终浓度为60～80nM，驴特异性探针DP1S的终浓度为60～80nM，奶牛特异性探针TP2的终浓度为60～80nM；所述待测样品的DNA的终浓度为0.4～2.0ng/μL。

优选的，所述内参体系为2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，内参上游引物16S1F、内参下游引物16S1R各0.5μL，内参探针16SP21.0μL，待测样品的DNA 2.0μL，ddH

优选的，所述荧光PCR的扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，40个循环。

优选的，所述结果判定的标准为：当内参和阳性对照Ct≤35，空白对照Ct为0时可以进行相应源性结果判定；当相应探针Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应多源性。

本发明提供了一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用。本发明使用1对通用引物和2对特异性引物，组合成双管双重PCR体系，并结合物种特异性探针，结合特异性探针实现2管PCR反应对奶牛、水牛、牦牛、骆驼、山羊、绵羊、马和驴8个物种的高通量检测，降低了多重PCR体系引物间的交叉反应并简化了优化过程，提高了检测效率。本发明可用于市售未知源性乳品或掺伪的快速定向筛查，是一种灵敏度高、特异性强的高通量检测方法，为加快乳及乳制品真伪、掺伪快速鉴定提供了新的思路。

附图说明

图1为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针对水牛、山羊、绵羊和马源性混合DNA进行四重实时荧光PCR的检测结果，以及利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、奶牛特异性探针对骆驼、牦牛、驴和奶牛源性混合DNA进行四重实时荧光PCR的检测结果。

图2为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，分别对奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、驴和马进行多重实时荧光PCR特异性测试的结果。

图3为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，分别对奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、驴和马进行多重实时荧光PCR特异性测试的结果。

图4为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对水牛DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图5为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对山羊DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图6为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对绵羊DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图7为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对马DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图8为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对骆驼DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图9为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对牦牛DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图10为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对驴DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图11为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对牛DNA(1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng、0.00001ng)进行的灵敏度测试结果。

图12为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对水牛乳和牛乳的混合样品(含水牛乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图13为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对山羊乳和牛乳的混合样品(含山羊乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图14为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对绵羊乳和牛乳的混合样品(含绵羊乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图15为利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，对马乳和牛乳的混合样品(含马乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图16为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对骆驼乳和水牛乳的混合样品(含骆驼乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图17为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对牦牛乳和水牛乳的混合样品(含牦牛乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图18为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对驴乳和水牛乳的混合样品(含驴乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

图19为利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，对牛乳和水牛乳的混合样品(含牛乳10％、1％、0.1％、0.01％)进行的检出限测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1乳样品DNA提取

收集新鲜乳品，包括牛乳、骆驼乳、水牛乳、山羊乳、绵羊乳、牦牛乳、马乳和驴乳。新鲜乳品的收集方式为直接取现挤乳液，保存于无菌50ml离心管中，采样量100mL，冰袋低温保存后带回实验室提取DNA。同时从乳品加工厂搜集50g加工乳粉，4℃保存于冰箱中用于提取DNA。共搜集液体乳样品24份，固体乳粉样品18份。此外，以大豆、小麦、玉米、大米、芝麻和荞麦为本发明设计的阴性对照。

液态乳样品取10mL置于50ml离心管中，于4℃下经5000rpm离心10min，去除脂肪和上清后，用PBS缓冲液洗涤两次，将沉淀按照AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(购自爱思进生物技术有限公司)说明书进行DNA提取。固态乳粉样品取25mg，使用TaKaRaMiniBESTUniversal Genomic DNA提取试剂盒(购自宝日医生物技术有限公司)提取基因组DNA。植物材料使用深加工食品与饲料基因组DNA提取试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)进行DNA提取。

提取的基因组DNA使用NanoDrop 2000进行检测，以确定其纯度和浓度。结果表明，所有DNA提取液的纯度较高，A

实施例2引物和探针设计

使用一对本发明人课题组前期设计报道的可同时扩增6种乳用动物(奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛)线粒体靶基因的通用引物A2-F、B4-R(Xue C,Wang P,Zhao J,etal.Development and validation ofa universal primer pair for the simultaneousdetection of eight animal species.Food Chem,2017,221:790-796)，同时依据GeneBank数据库中奶牛、水牛、牦牛、骆驼、山羊、绵羊、马和驴8种动物的线粒体基因组序列，通过MegAlign多重比对分析DNA序列，利用Primer Premier 5设计马和驴的物种特异性引物以及内参引物，并使用Oligo 7设计并评估8个物种的特异性探针以及内参探针，分别标记FAM、VIC、ROX和CY5荧光基团，这些荧光基团具有一定波长差异，可以提高多重检测时荧光PCR的检测灵敏度。引物通过NCBIPrimer BLAST进行物种特异性比对。引物的退火温度设计控制在54～60℃，探针设计高于相应引物退火温度，且均没有二级结构，保证引物和探针具有高度的物种特异性，上述设计以便保证引物和探针可用于后续的特异性检测。引物和TaqMan探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列如下：

内参上游引物16S1F：5'-GAGAAGACCCTATGGAGC-3'(SEQ ID NO.1)

内参下游引物16S1R：5'-GGTAACTTGTTCCGTTGAT-3'(SEQ ID NO.2)

马源上游引物HF1：5'-TCACCCTCATGTGCTATG-3'(SEQ ID NO.3)

马源下游引物HR1：5'-ATGCGTGTTGACTGGAAA-3'(SEQ ID NO.4)

驴源上游引物DF1：5'-TCAGCTCAACATACAATACTC-3'(SEQ ID NO.5)

驴源下游引物DR1：5'-GACACGTAATTGGAGGGA-3'(SEQ ID NO.6)

通用上游引物A2-F：5'-CCTCCCTAAGACTCAAGGAA-3'(SEQ ID NO.7)

通用下游引物B4-R：5'-CGGAGCGAGAAGAGG-3'(SEQ ID NO.8)

内参探针16SP2：5'-TTCTCCGAGGTCACCCCAA-3'(SEQ ID NO.9)

水牛特异性探针BP4：5'-TGACTTTACACTCTAGCCTAAC-3'(SEQ ID NO.10)

山羊特异性探针GP1：5'-CTTACAGACATGCCAACAACCCACA-3'(SEQ ID NO.11)绵羊特异性探针SP：5'-ACCCACCCACGGACATGAGCGTTCA-3'(SEQ ID NO.12)

马特异性探针HP1-1：5'-CCCACCTGACATGCAATATCT-3'(SEQ ID NO.13)

骆驼特异性探针CP2：5'-CGGTAGCCCTTGAGTATTATTACA-3'(SEQ ID NO.14)

牦牛特异性探针YP1：5'-ACGTATTCCCCCGTTTGGAC-3'(SEQ ID NO.15)

驴特异性探针DP1S：5'-ACATCGTGCATTAAATTGTTCACCC-3'(SEQ ID NO.16)

奶牛特异性探针TP2：5'-ACACGCCCATACACAGACCACA-3'(SEQ ID NO.17)。

内参探针16SP2、水牛特异性探针BP4和骆驼特异性探针CP2序列的5'端修饰有报告基团FAM，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；山羊特异性探针GP1和牦牛特异性探针YP1序列的5'端修饰有报告基团VIC，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；绵羊特异性探针SP和驴特异性探针DP1S序列的5'端修饰有报告基团ROX，3'端修饰有淬灭基团BHQ2；马特异性探针HP1-1和牛特异性探针TP2序列的5'端修饰有报告基团CY5，3'端修饰有淬灭基团BHQ3。

实施例3引物和探针组合的特异性检测

利用奶牛特异性探针、水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、马特异性探针和驴特异性探针与对应引物组合，以实施例1提取的奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、马和驴乳DNA为模板，对其对应源性物种DNA进行实时荧光PCR特异性检测；同时利用内参探针对上述DNA样品以及大豆、小麦、玉米、大米、芝麻、荞麦进行实时荧光PCR特异性与通用性检测；以上均以ddH

表1引物和探针组合的物种特异性测试

上述实时荧光PCR的反应体系为：总体积25μL，包含上游引物F(10μM)0.5μL，下游引物R(10μM)0.5μL，探针Probe(10μM)1.0μL，ddH

实时荧光PCR反应，设置Threshold为自动，读取反应孔的Ct值。当内参和阳性对照Ct≤35，空白对照Ct为0时可以进行相应源性结果判定；相应探针Ct≤35，结果判定为具有相应源性。

经过相应测试，结果显示各组引物与特异性探针组合分别对奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、马和驴乳源性成分具有高度特异性；内参引物探针组合具有良好的通用性以及特异性。结果如表2所示。

表2通用性和特异性引物探针检测结果

注：-表示未检出，/表示未检测。

实施例4双管双重PCR和多重TaqMan探针组合与体系优化

对8种不同乳源特异性探针根据发光基团的不同进行组合，产生多种不同的组合，并避开马、驴物种在同一体系的组合。将8种乳源DNA均调至5ng/μL，每种体系对应的4个物种DNA等体积混合作为阳性扩增模板，同时设置内参对照，以ddH

优化后得到两个多重实时荧光PCR体系：

体系1为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上游引物mix(10μM)0.5μL，下游引物mix(10μM)0.5μL，探针mix(10μM)1.0μL，ddH

体系2为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上游引物mix(10μM)0.5μL，下游引物mix(10μM)0.5μL，探针mix(10μM)1.0μL，ddH

多重实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，55℃退火30s，40个循环。

实时荧光PCR反应，设置Threshold为自动，读取反应孔的Ct值。当内参和阳性对照Ct≤35，空白对照Ct为0时可以进行相应源性结果判定；当相应探针Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应多源性。

采用上述优化后的体系和程序，利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针对水牛、山羊、绵羊和马源性混合DNA进行四重实时荧光PCR的检测，利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、奶牛特异性探针对骆驼、牦牛、驴和奶牛源性混合DNA进行四重实时荧光PCR的检测，结果如图1所示，8个物种均出现扩增曲线。

利用水牛特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针、马特异性探针构成多重体系，分别对奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、驴和马的DNA(10ng/μL)进行多重实时荧光PCR特异性测试，结果如图2所示，四种特异性探针均表现出高度特异性；利用骆驼特异性探针、牦牛特异性探针、驴特异性探针、牛特异性探针构成多重体系，分别对奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、驴和马的DNA(10ng/μL)进行多重实时荧光PCR特异性测试，结果如图3所示，四种特异性探针均表现出高度特异性。

实施例5双管双重PCR和多重TaqMan探针的灵敏度测试

分别将8种乳用动物DNA稀释至以1ng/μL作为起始模板，均以10倍连续稀释至6个浓度梯度，并以ddH

灵敏度测试结果如表3所示，表明，水牛特异性探针可以检测到乳样品中0.01ng的水牛源性DNA，奶牛特异性探针、骆驼特异性探针、驴特异性探针、山羊特异性探针、绵羊特异性探针可以检测到样品中1pg的奶牛、骆驼、驴、山羊、绵羊源性DNA，马特异性探针、牦牛特异性探针可以检测到样品中0.1pg的马、牦牛源性DNA，内参探针可以检测到1pg的动物源性DNA，说明本发明的大部分探针检测可达到皮克水平，灵敏度高，可满足乳品掺伪检测需要。仪器自动生成标准曲线结果，R

水牛灵敏度测试结果如图4所示，山羊灵敏度测试结果如图5所示，绵羊灵敏度测试结果如图6所示，马灵敏度测试结果如图7所示，骆驼灵敏度测试结果如图8所示，牦牛灵敏度测试结果如图9所示，驴灵敏度测试结果如图10所示，奶牛灵敏度测试结果如图11所示。

表3多重体系灵敏度分析

实施例6掺伪乳品样品模拟测试

取实施例1中奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、牦牛、马和驴8种乳用动物的乳样本备用，以牛乳或水牛乳作为混合基质，分别与另一体系的靶标乳混合，按照每种靶标乳含量0.01％、0.1％、1％、10％(w/w)梯度制备，以水作为空白对照，对目标物种进行双重实时荧光PCR检测，每个反应设置3个重复。

检测结果如表4所示，检出限均可达0.1％。水牛检出限如图12所示，山羊检出限如图13所示，绵羊检出限如图14所示，马检出限如图15所示，骆驼检出限如图16所示，牦牛检出限如图17所示，驴检出限如图18所示，奶牛检出限如图19所示。

表4多重体系检出限

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。