一种固定化底物制备茶黄素的方法

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种固定化底物制备茶黄素的方法。

背景技术

茶黄素是儿茶素分子的二聚体产物，是存在于红茶中的一种金黄色色素。成品茶中的茶黄素含量稀少，仅0.5～1.5％，提取成本高昂，被誉为茶叶中的“软黄金”，在医疗健康领域广泛作用。茶黄素的工业化制备，基本都采取内源性或外源性酶促发酵的方法。

内源性酶促发酵，指的是采用鲜茶叶内源性的多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD，通过冷冻及控温发酵等相关工艺技术，制备高茶黄素含量的茶叶，再提取精制高含量的茶黄素；外源性酶促发酵，指的是利用富含多酚氧化酶的外源性酶源，酶促催化儿茶素合成制备茶黄素。现有的外源性酶催化技术，分为游离性酶催化和固定化酶催化两种技术路线。

其中，固定化酶催化是指将提取的PPO粗酶，经过纯化后，再通过诸如离子结合、生物特异性相互作用、废铁一星相互作用、疏水作用、螯合作用或亲和结合等方式，固定在适当的载体上，然后与反应体系中的含儿茶素类物质的溶液接触，在有氧参与及合适的pH值条件下，酶促催化儿茶素类分子聚合生成茶黄素。这种工艺酶的纯化和固定化成本较高，固定化酶使用次数较低，易产生大量工业废弃物；PPO酶在纯化及固定化过程中，酶与载体的多个活性点接触及键合，导致酶的空间构型固化，酶的空间位形、结构和构象都会较游离态发生改变，在载体上固化后的酶很难在空间构型上发生改变，对底物儿茶素的催化选择性发生变化，尤其对酯型儿茶素的催化能力产生干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化底物制备茶黄素的方法，本发明提供的方法解决了固定化酶催化技术的问题，成本低，催化效果好。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种固定化底物制备茶黄素的方法，包括以下步骤：

(1)将茶多酚溶液与惰性吸附载体混合进行吸附后依次水洗和醇洗，得到固定化底物；所述惰性吸附载体包括大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂的孔径为10～180埃；所述醇洗用醇液的浓度为4～20wt％；

(2)将所述固定化底物与酶液混合且通氧进行酶促反应，得到酶催化载体；所述酶液中的酶为多酚氧化酶PPO；

(3)将所述酶催化载体脱附得到的洗脱液浓缩，得到茶黄素。

优选的，步骤(1)中，所述茶多酚溶液的浓度为0.5～100g/L。

优选的，步骤(1)中，所述茶多酚溶液中的茶多酚与惰性吸附载体的质量比为3～15:100。

优选的，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系pH值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。

优选的，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂包括LX-8树脂、LX-5树脂、AB-8树脂、NKA树脂和NKA-9树脂中的一种或几种；

所述惰性吸附载体还包括硅胶和氧化铝中的一种或几种。

优选的，步骤(2)中，所述固定化底物与酶液的体积比为0.5～1:0.5～1。

优选的，步骤(2)中，所述酶促反应的温度为5～35℃，酶促反应体系pH值为4.5～6.5，氧气体积浓度为60～90％，保温时间为4～8小时。

优选的，所述酶促反应采用A

所述测试惰性吸附载体醇提液为：每反应30min取固定化底物和乙醇混合，室温超声振荡提取，吸取上清液；

测定所述上清液在380nm的吸光度值，在吸光度值终止上升后停止酶促反应。

优选的，步骤(2)中，所述酶液为诺维信的多酚氧化酶或沧州夏盛酶生物技术有限公司的漆酶，或梨匀浆过滤得到的梨汁，或鲜茶叶匀浆过滤得到的粗酶液。

优选的，步骤(3)中，所述脱附用洗脱剂为浓度60～80wt％的食用乙醇。

本发明提供了一种固定化底物制备茶黄素的方法。本发明提供的方法以固定化底物的途径进行催化聚合，将天然植物单体儿茶素类分子底物，以非共价键的方式富集在惰性吸附载体上，实现非键合方式固定化，形成多分子聚集态的形式，并加以纯化(水洗和低浓度醇洗)，再加入高选择性的游离外源PPO酶液进行催化，在水溶液中游离性的PPO酶蛋白质链形的分子构架空间位形舒展，对酯型及非酯型的儿茶素类物质催化活性高；同时，因为底物被大部分锁定在吸附载体上，游离在酶液中的底物浓度低，底物对酶的毒化作用及对酶活的抑制作用大大降低，在解析-催化聚合-吸附的微动态平衡条件下，高效率的催化载体上的富集底物儿茶素聚合成二聚体类物质茶黄素，开创性地将底物儿茶素的纯化及酶促氧化缩合集中在同一载体上完成，极大地简化了工艺的操作难度，操作简单。

本发明开创性地以固定化底物的途径催化合成茶黄素，后续可以将该富集了茶黄素的树脂简单真空干燥后，用该富集了茶黄素的载体为基础模板，进行后续的分子功能团接枝改性，为低浓度的功能性小分子物质的富集、纯化及后续的固定化再靶向催化合成功能性大分子提供了新的思路，开发前景广阔。

相比于现有技术，本发明提供的方法绿色环保，不产生废弃的固定化酶等有毒有害废弃物，不使用毒性较强且易燃易爆的乙酸乙酯和石油醚，脱除咖啡因及除杂过程中不使用有毒有害的卤代烷烃，可以在同一生产线上生产高含量茶多酚(固定化底物)和高含量茶黄素，并为后续的以茶黄素为底物进行活性基团分子的修饰和分子改性等操作奠定了基础平台。

进一步的，步骤(1)中，所述吸附的温度为5～35℃，吸附体系pH值为4.0～5.5，保温时间为1～5h。步骤(2)中，所述酶促反应的温度为5～35℃，酶促反应体系pH值为4.5～6.5，氧气体积浓度为60～90％，保温时间为4～8小时。本发明提供的方法操作条件温和，有利于安全生产，节约能源，降低生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的固定化底物制备茶黄素的方法的流程图；

图2为本发明实施例4制备的茶黄素的HPLC检测谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种固定化底物制备茶黄素的方法，包括以下步骤：

(1)将茶多酚溶液与惰性吸附载体混合进行吸附后依次水洗和醇洗，得到固定化底物；所述惰性吸附载体包括大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂的孔径为10～180埃；所述醇洗用醇液的浓度为4～20wt％；

(2)将所述固定化底物与酶液混合且通氧进行酶促反应，得到酶催化载体；所述酶液中的酶为多酚氧化酶PPO；

(3)将所述酶催化载体脱附得到的洗脱液浓缩，得到茶黄素。

本发明将茶多酚溶液与惰性吸附载体混合(记为第一混合)进行吸附后依次水洗和醇洗，得到固定化底物。在本发明中，所述茶多酚溶液的浓度优选为0.5～100g/L。

在本发明中，所述茶多酚溶液的制备方法优选包括方法一、方法二或方法三；所述方法一优选包括以下步骤：用65～90℃热水搅拌浸提茶叶；所述浸提的次数优选为1次以上，更优选为2次以上；单次所述浸提的时间优选为20～60min，更优选为30～50min，进一步优选为40min；所述茶叶优选为大叶种绿茶和小叶种绿茶中的一种或几种；所述大叶种绿茶优选为福建福鼎大叶种绿茶；所述小叶种绿茶优选为江西婺源小叶种绿茶。

在本发明中，所述方法二优选包括以下步骤：将含量30～99wt％的市售茶多酚粉末和水混合；所述含量30～99wt％的市售茶多酚粉末优选包括市售茶多酚TP30产品～茶多酚TP99产品中的一种或几种。

在本发明中，所述方法三优选包括以下步骤：对低于目标浓度的茶多酚溶液进行富集。

在本发明中，所述惰性吸附载体包括大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂的孔径为10～180埃；所述大孔吸附树脂优选包括LX-8树脂、LX-5树脂、AB-8树脂、NKA树脂和NKA-9树脂中的一种或几种；所述惰性吸附载体优选还包括硅胶和氧化铝中的一种或几种。本发明中的惰性吸附载体可以是一种或几种大孔吸附树脂，也可以是硅胶和/或氧化铝等，载体来源广泛。

在本发明中，所述茶多酚溶液中的茶多酚与惰性吸附载体的质量比优选为3～15:100，更优选为5～12:100，进一步优选为7～10:100，更进一步优选为8～9:100。

在本发明中，所述第一混合优选为搅拌混合；所述搅拌的转速优选为1～200转/分钟，更优选为10～100转/分钟，进一步优选为30转/分钟。

在本发明中，所述吸附的温度优选为5～35℃，更优选为10～30℃，进一步优选为15～25℃，更进一步优选为20℃，吸附体系pH值优选为4.0～5.5，更优选为4.5～5.0，保温时间优选为1～5h，更优选为2～4h，进一步优选为3h。本发明将茶多酚溶液与惰性吸附载体搅拌混合，完成茶多酚的聚集吸附。

在本发明中，所述水洗用水优选为纯水；所述水洗的终点优选为洗至洗液基本无色。本发明通过水洗，去除多糖类杂质。

在本发明中，所述醇洗用醇液的浓度为4～20wt％，优选为8～15wt％，更优选为浓度10～14wt％；所述醇液优选为食用乙醇。本发明通过醇洗，去除咖啡因和水溶性氨基酸等干扰后续酶促催化反应的杂质。

在本发明中，所述醇洗后优选还包括过滤，将惰性吸附载体滤出备用。

得到固定化底物后，本发明将所述固定化底物与酶液混合(记为第二混合)且通氧进行酶促反应，得到酶催化载体。在本发明中，所述酶液优选为诺维信的多酚氧化酶或沧州夏盛酶生物技术有限公司的漆酶，或梨匀浆过滤得到的梨汁，或鲜茶叶匀浆过滤得到的粗酶液。

在本发明中，所述梨优选为雪梨；所述梨匀浆过滤优选为：将雪梨冷冻后化冻，然后将化冻的雪梨和pH缓冲液混合后匀浆，四层纱布滤除梨渣；所述化冻优选为自然化冻；所述雪梨与pH缓冲液的质量比优选为1:0.2～1，更优选为1:0.4～0.8，进一步优选为1:0.6；所述pH缓冲液的pH值优选为5.5～6.5，更优选为5.5～6.0，进一步优选为5.5；所述pH缓冲液优选为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

在本发明中，所述酶液的浓度优选为20～100wt％，更优选为50～100wt％，进一步优选为80～100wt％。

在本发明中，所述固定化底物与酶液的体积比优选为0.5～1:0.5～1，更优选为0.6～0.9:0.6～0.9，进一步优选为0.7～0.8:0.7～0.8。

在本发明中，所述第二混合优选为搅拌混合；所述搅拌的转速优选为30～600转/分钟，更优选为100～500转/分钟，进一步优选为400～500转/分钟。

在本发明中，所述通氧的速度优选以不使反应体系溶液泡沫溢出为度。

在本发明中，所述酶促反应的温度优选为5～35℃，更优选为10～30℃，进一步优选为15～25℃，更进一步优选为20℃，酶促反应体系pH值优选为4.5～6.5，更优选为5.0～6.0，进一步优选为5.5，氧气体积浓度优选为60～90％，更优选为70～80％，保温时间优选为4～8小时，更优选为5～7小时，进一步优选为6小时。

在本发明中，所述酶促反应优选采用A

在本发明中，所述固定化底物的质量优选为2g，所述乙醇的体积优选为50mL；所述乙醇的体积浓度优选为95％；所述超声振荡提取的时间优选为5min；所述吸取上清液10mL后优选将所述上清液添加至50mL容量瓶中，用体积浓度95％的乙醇定容；本发明优选以体积浓度95％的乙醇作为空白对照。

得到酶催化载体后，本发明将所述酶催化载体脱附得到的洗脱液浓缩，得到茶黄素。在本发明中，所述脱附用洗脱剂优选为浓度60～80wt％的食用乙醇，更优选为浓度70～75wt％的食用乙醇。

在本发明中，所述脱附前优选对所述酶催化载体依次进行水洗和醇洗；所述水洗用水优选为纯水；所述醇洗用醇优选为浓度5～20wt％的食用乙醇，更优选为10～15wt％的食用乙醇。本发明通过水洗和醇洗，除杂纯化酶催化载体。

在本发明中，所述浓缩优选为真空浓缩；所述真空浓缩的倍数优选为10～20倍，更优选为12～18倍，进一步优选为14～16倍，真空度优选为-0.1MPa；所述浓缩的目标固含率优选为30～40wt％，更优选为35～37wt％。

在本发明中，所述浓缩后优选还包括对所得浓缩物进行干燥；所述干燥优选为冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥；所述真空干燥的设备优选为真空带式干燥机。

本发明提供的固定化底物制备茶黄素的方法，工艺流程如图1所示：本发明将茶多酚溶液用惰性吸附载体吸附，并进行纯化，然后通氧进行酶促反应，反应后通过水洗和醇洗除杂，之后将负载产品的酶催化载体进行脱附后浓缩，得到茶黄素。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明的方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)取福建福鼎大叶种绿茶末100克，分别用1升90℃纯净水搅拌提取两次，每次30分钟，滤出提取液，将滤出的两次提取液合并，用磷酸调节pH值至4.0～5.5，提取液冷却至室温备用。

(2)室温条件下，将上述茶叶提取液加入到100克LX-8树脂中，以30转/分钟的转速搅拌吸附2小时，滤除吸附底液；分别用1升纯净水搅拌洗涤树脂4次，每次10分钟，至水洗液基本澄清无色，滤除水洗液；分别用1升6％的食用乙醇水溶液搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除稀乙醇洗液；吸附并净化后的树脂呈土黄色，备用。

(3)取雪梨100克，冷冻后自然化冻，加入100毫升pH值5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，匀浆，四层纱布滤除梨渣，取过滤后的梨汁备用。

(4)将上述梨汁倒入步骤(2)的净化树脂中，30℃搅拌并通氧，通氧速度1升/分钟，搅拌转速400转/分钟，搅拌过程中每隔30分钟对树脂取样，乙醇提取后检测A380吸光度变化，吸光度变化为线性上升后走平，待吸光度值走平后停止反应；反应后的树脂由土黄色变为漂亮的橙红色。

(5)滤除梨汁反应液(反应液酶活检测只有初始值的10％)，树脂用以磷酸调节pH值至4的纯净水搅拌洗涤5次，至洗涤液澄清无色，滤除洗涤液。

(6)分别用15％食用乙醇水溶液1升搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除低醇洗液，最后一次尽量将低醇洗液滤净。

(7)树脂装柱，用80％食用乙醇洗脱树脂上的茶黄素，洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩干燥，制得金橙粉末8.2克，以茶叶重量计收率8.2％，该茶叶中总儿茶素含量为12.6％，以儿茶素总量计收率65％，产品经HPLC检测，茶黄素含量为53.6％。

实施例2

(1)取江西婺源小叶种绿茶末100克，分别用1升90℃纯净水搅拌提取两次，每次30分钟，滤出提取液，将滤出的两次提取液合并，用磷酸调节pH值至4.0～5.5，提取液冷却至室温备用。

(2)室温条件下，将上述茶叶提取液加入到100克LX-5树脂中，以30转/分钟的转速搅拌吸附2.5小时，滤除吸附底液；分别用1升纯净水搅拌洗涤树脂4次，每次10分钟，至水洗液基本无色，滤除水洗液；分别用1升5％的食用乙醇水溶液搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除稀乙醇洗液；吸附并净化后的树脂呈土黄色，备用。

(3)取雪梨100克，冷冻后自然化冻，加入50毫升pH值5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，匀浆，四层纱布滤除梨渣，取过滤后的梨汁备用。

(4)将上述梨汁倒入步骤(2)的净化树脂中，30℃搅拌并通氧，通氧速度1升/分钟，搅拌转速400转/分钟，搅拌过程中每隔30分钟对树脂取样，乙醇提取后检测A380吸光度变化，吸光度变化为线性上升后走平，待吸光度值走平后停止反应；反应后的树脂呈现漂亮的橙红色。

(5)滤除梨汁反应液(反应液酶活检测只有初始值的11％)，树脂用以磷酸调节pH值至4的纯净水搅拌洗涤5次，至洗涤液澄清无色，滤除洗涤液。

(6)分别用12％食用乙醇水溶液1升搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除低醇洗液，最后一次尽量将低醇洗液滤净。

(7)树脂装柱，用80％食用乙醇洗脱树脂上的茶黄素，洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩干燥，制得金橙粉末7.6克，以茶叶重量计收率7.6％，该茶叶中总儿茶素含量为11.3％，以儿茶素总量计收率67％，产品经HPLC检测，茶黄素含量为56.7％。

实施例3

(1)称取市售低咖啡因含量的茶多酚TP90产品10克，溶解于200毫升纯净水中，该TP90产品EGCG≥40％，EGC≥10％，儿茶素总量71％，咖啡因≤1％。

(2)室温条件下，将上述溶液加入到100克AB-8树脂中，用磷酸调节溶液pH值至4，以30转/分钟的转速搅拌吸附2小时，滤除吸附底液；分别用1升纯净水搅拌洗涤树脂2次，每次5分钟，至水洗液基本无色，并滤除水洗液；吸附并净化后的树脂呈棕黄色，备用。

(3)取雪梨100克，冷冻后自然解冻，加入50毫升pH值5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，匀浆，四层纱滤除梨渣，取过滤后的梨汁备用。

(4)将上述梨汁倒入步骤(2)的净化树脂中，30℃搅拌并通氧，通氧速度1升/分钟，搅拌转速500转/分钟，搅拌过程中每隔30分钟对树脂取样，乙醇提取后检测A380吸光度变化，吸光度变化为线性上升后走平，待吸光度值走平后停止反应；反应后的树脂呈现漂亮的深橙红色。

(5)滤除梨汁反应液(反应液酶活检测只有初始值的4％)，树脂用以磷酸调节pH值至4的纯净水洗涤4次，至洗涤液澄清无色，滤除洗涤液。

(6)分别用10％食用乙醇水溶液1升搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除低醇洗液，最后一次尽量将低醇洗液滤净。

(7)树脂装柱，用65％食用乙醇洗脱树脂上的茶黄素，洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩干燥，制得金橙色粉末7.5克，以原料茶多酚计收率75％，产品经HPLC检测，茶黄素含量为62.7％。

实施例4

(1)称取市售低咖啡因含量的茶多酚TP95产品10克，溶解于200毫升纯净水中，该TP95产品EGCG≥45％，EGC≥10％，儿茶素总量75.6％，咖啡因≤1％。

(2)室温条件下，将上述溶液加入到100克NKA-9树脂中，用磷酸调节溶液pH值至4，以30转/分钟的转速搅拌吸附2小时，滤除吸附底液；分别用1升纯净水搅拌洗涤树脂3次，每次5分钟，至水洗液基本无色，并滤除水洗液；吸附并净化后的树脂成棕黄色，备用。

(3)取雪梨100克，冷冻后自然解冻，加入30毫升pH值5.5的磷酸氢二钠-磷酸钠缓冲液，匀浆，四层纱滤除梨渣，取过滤后的梨汁备用。

(4)将上述梨汁倒入步骤(2)的净化树脂中，30℃搅拌并通氧，通氧速度1升/分钟，搅拌转速500转/分钟，搅拌过程中每隔30分钟对树脂取样，乙醇提取后检测A380吸光度变化，吸光度变化为线性上升后走平，待吸光度值走平后停止反应。反应后的树脂为漂亮的深橙红色。

(5)滤除梨汁反应液(反应液酶活检测只有初始值的4％)，树脂用以磷酸调节pH值至4的纯净水洗涤4次，至洗涤液澄清无色，滤除洗涤液。

(6)分别用15％食用乙醇水溶液1升搅拌洗涤树脂3次，每次10分钟，滤除低醇洗液，最后一次尽量将低醇洗液滤净。

(7)树脂装柱，用75％食用乙醇洗脱树脂上的茶黄素，洗脱液用旋转蒸发仪真空浓缩干燥，制得金黄色粉末7.3克，以原料茶多酚计收率73％，产品经HPLC检测，茶黄素含量为63.9％。

对本实施例制备的茶黄素进行HPLC检测，采用以下型号高效液相色谱仪：日本岛津公司Shimadzu LC-10ATVP系统控制器，LC-10ATVP二元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，Shimadzu LC-Solution色谱工作站；色谱分析参数：色谱柱为HypersilBDS(C18,5μ,4.6x250mm)，流动相A为2％乙酸，流动相B为乙腈-乙酸乙酯(体积比21:3)，梯度洗脱，流动相B在30min内从18％线性梯度变化到30％，流速0.9mL/min，柱温40℃，检测波长280nm，进样量10μL；茶黄素4种单体组分的标准品外购，外标法构建标准校正曲线，得到的检测图谱如图2所示。根据图2可以看出，本发明采用固定化底物游离酶催化技术，催化得到均衡的TF、TF-3-G、TF-3’-G、TFDG四组茶黄素，可见本发明提供的方法酶催化效率高。

由以上实施例可知，本发明提供的方法成本低，催化效果好，步骤简单，操作方便，极大地简化了工艺的操作难度，绿色环保。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。