一种治疗糖尿病肾病的中药单体异荭草素

技术领域：

本发明属于中药用于技术领域，涉及一种治疗糖尿病肾病的中药单体异荭草素。

背景技术：

糖尿病肾病(DN)是最常见和最严重的糖尿病并发症之一。最新数据显示，DN占慢性肾脏疾病总数的1/3，其发病率已达9.1％。且DN也是终末期肾脏疾病的主要病因之一。然而，目前DN仍然缺乏有效的治疗方法。

在临床实践中，我们发明了一种治疗DN的中药方剂，名为“金葫固肾方”。该方已用于治疗200多名Ⅲ期以上肾功能不全的DN患者。它可以显著降低DN患者的尿微量白蛋白/肌酐比率(UACR)和血肌酐。葫芦巴是组方中的重要草药君药之一。根据古代中医的记载，葫芦巴长期以来被用来治疗肾功能不全的症状。在现代中医中，葫芦巴也被用于治疗慢性肾功能衰竭。

足细胞减少和形态异常是DN的主要病理改变之一。由于足细胞是终末分化细胞，不能进行分裂和自我更新，因此保护足细胞免受糖尿病损伤尤为重要。自噬是一种自我吞噬过程，对维持细胞的稳态起着重要作用。同时，自噬对于维持人类足细胞的结构、功能和代谢稳态也非常重要。在高糖条件下，自噬可以清除受损的线粒体，保护细胞免受高糖的损伤。自噬缺陷已被证明会加重糖尿病肾损害。基于自噬在糖尿病肾病发生发展中的重要作用，我们筛选了40多种金葫固肾方中的活性成分，以确定在高糖条件下能显著增强自噬和保护足细胞的小分子化合物。在筛选出的化合物中，异荭草素(ISO)的表现最好。

异荭草素(ISO)是一种黄酮类化合物，也称为3'，4'，5,7-四羟基黄酮-6-d-吡喃葡萄糖苷或木犀草素6-C-葡萄糖苷，是葫芦巴的有效成分之一。异荭草素(ISO)已被发现有助于预防代谢综合症，如高血糖、高脂血症和胰岛素抵抗。根据资料，异荭草素(ISO)的治疗效果应归功于其抗氧化和抗炎特性。然而，具体机制在很大程度上仍不清楚。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提供一种治疗糖尿病肾病的中药单体-异荭草素，通过验证异荭草素减轻高糖所致足细胞损伤的假说及其相关机制，发现异荭草素对治疗糖尿病肾病的潜在价值。

为了实现上述目的，本发明所述异荭草素的化学结构式为：

异荭草素是一种含有木犀草素结构的黄酮类化合物，广泛存在于苦菜、荞麦、西番莲和葫芦巴等植物的药用或食用部位，分子式为C

本发明与现有技术相比，采用中药单体异荭草素治疗糖尿病肾病，其疗效好，无毒副作用，异荭草素来源广泛易得，成本低。

附图说明：

图1为本发明实施例中体内实验工作流程图。

图2为本发明实施例中体外实验工作流程图。

图3为本发明实施例所述异荭草素ISO调节SGLT-2的表达图，其中A为检测SGLT-2的蛋白表达结果，B为统计分析结果。

图4为本发明实施例中异荭草素(ISO)通过增强自噬来保护足细胞免受汞诱导的损伤，(A)足细胞暴露于异荭草素(ISO)分子(0、20、40、60、80、100、120、140和160μM)24、48和72小时，并使用CCK-8方法测量细胞活力；(B)足细胞暴露于HG和HG+ISO(10、20和40μM)中，在处理24-72小时后，使用CCK-8方法测量细胞活力；(C-D)通过流式细胞术(膜联蛋白V染色)评估细胞凋亡水平。(*P<0.05；**P<0.01)；(E)在每组100到150个细胞中计数显示LC3分布的点数，并进行三个独立实验；(F)用葡萄糖、HG、HG+ISO和HG+ISO+3-MA处理表达GFP-LC3的MPC5细胞，观察显示LC3在细胞中分布的共焦图像；标度：25μm(G-J)，通过Westernblotting检测LC3和p62蛋白的表达；(K)MPC5细胞经葡萄糖、HG、HG+ISO和HG+ISO+3-MA处理后，用CCK-8法测量吸光度**P<0.01；(L-R)为实验分析统计结果。

图5为本发明实施例中ISO通过增强线粒体吞噬功能保护足细胞线粒体，(A)正常组、HG组、ISO组和3-MA组足细胞线粒体蛋白TOM20和GFP-LC3的免疫荧光标记；(B-C)使用用于共定位阈值和散射的ImageJ插件随机分析100-150个细胞，并获得共定位图像；(D)LC3和TOM20在随机线段上的荧光分布；(E-H)使用ImageJ插件JACoP随机分析100-150个细胞，对PCC、重叠系数和MCC等共定位系数进行统计分析。(一)线粒体的定量统计；(J)统计数据显示与点状LC3共定位的线粒体数量，*P<0.05，**P<0.01；(K)免疫印迹法检测TIM23和TOM20；灰色值的统计分析结果见(L-M)，**P<0.0；(N)用荧光探针通过JC-10染色检测受损和去极化的线粒体。绿色和红色荧光分别代表线粒体去极化和膜电位正常的线粒体，刻度：50μm；(O)显示绿色荧光强度与总荧光强度的比率，用于统计分析，数据以独立实验的平均值±SEM值表示，单因素方差分析(ANOVA)用于多组比较，**P<0.01。

图6为本发明实施例中ISO干预可逆转汞诱导的PI3K Tyr458和Tyr199、AKTThr308、TSC2 Ser939和mTOR Ser2448位点的异常磷酸化，(A-B)改良蛋白质组学和韦恩图结果；(C)自上而下：磷酸化TSC2(pTSC2)、总TSC2(tTSC2)、磷酸化PI3K(pPI3k)、总PI3K(tPI3K)、磷酸化AKT(pAKT)、总AKT(tAKT)、磷酸化mTOR(pmTOR)、总mTOR(tmTOR)和β-肌动蛋白的内部参数；(D-G)分析pTSC2、pPI3K、pAKT和pmTOR与β-肌动蛋白的比率，总TSC2、PI3K、AKT和mTOR与β-肌动蛋白的比率，以及pTSC2、pPI3K、pAKT和pmTOR与tTSC2的比率，以及tPI3K、tAKT和tmTOR**P<0.01。

图7为本发明实施例中对DN动物模型的分析证明，ISO可抑制糖尿病肾损害，(A-F)从左到右：ALB、UACR、Scr、BUN、AU和Ccr，*P<0.05，**P<0.01，Ccr(L/24小时)＝(尿肌酐浓度/血肌酐浓度)×24小时尿量；(G-M)从左到右：血糖、CHO、TG、FFA、LDL、HDL和体重；(N)HE染色和Masson染色图像中的黑色箭头和橙色箭头表示肾小球；在使用透射电镜获得的代表性图像中有基底膜、足突、线粒体和被自噬体吞噬的线粒体；(P-R)从上到下视野中平均足突间距、最大足突间距和平均基底膜厚度的统计分析；箭头表示线粒体*P<0.05和**P<0.01。

图8为本发明实施例中对原代足细胞的分析证实，ISO对DN小鼠的足细胞具有保护作用，因为它增强了有丝分裂吞噬功能，(A)免疫荧光标记和分类足细胞通过激光共聚焦成像；(B)琼脂糖凝胶电泳鉴定nephrin和podocin基因；(C)对正常组、DN组和ISO组的原代足细胞进行免疫荧光标记LC3激光共聚焦成像；(D)50个单元格中LC3点的统计图。(E)免疫印迹法检测LC3的表达；(F)LC3灰度值的统计分析；(G)线粒体的定量统计。(H)正常组、DN组和ISO组的免疫荧光标记线粒体；(I-K)通过Western blotting检测TOM20和TIM23水平的变化和灰度统计；(L-M)用于共定位阈值和散射的ImageJ插件用于100-150个细胞的随机分析，以获得共定位图像；(N)LC3和TOM20在随机线段上的荧光分布；(O)通过激光共聚焦成像观察正常组、DN组和ISO组的免疫荧光标记原代足细胞；(P)点状LC3共定位线粒体；(Q-T)ImageJ插件JACoP用于100-150个细胞的随机分析，以获得共定位分析系数的统计结果，如PCC、重叠系数和MCC；(U)荧光探针JC-10染色检测线粒体损伤和去极化，尺度：40μm；(V)绿色荧光与红色荧光比率的统计分析，数据以独立实验的平均值±SEM值表示，使用方差分析对多组进行比较*P<0.05，**P<0.01。

图9本发明实施例中对原代足细胞进行分析，以验证ISO可以逆转DN诱导的PI3K/AKT/TSC2/mTOR通路的变化，(A)从上到下：pAKT、总AKT、pTSC2、总AKT、总TSC2和β-肌动蛋白；(B-E)分析pTSC2、pPI3K、pAKT和pmTOR与β-肌动蛋白的比率，总TSC2、总PI3K、总AKT和总mTOR与β-肌动蛋白的比率，以及pTSC2、pPI3K、pAKT和pmTOR与总TSC2、总PI3K、总AKT和总mTOR的比率，**P<0.01。

图10为本发明实施例中研究机制的模型图，在糖尿病条件下，足细胞中PI3K-AKT-TSC2-mTOR通路过度激活，导致自噬抑制，ISO降低了该途径的活性，从而恢复了自噬，**P<0.01。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例：

本实施例通过具体实验验证了异荭草素用于治疗糖尿病肾病的的工作机制，包括体内实验和体外实验，具体过程为：

1、体内实验

(1)DKD模型的构建与药物干预：

选择雄性C57BL/6J，5～6周龄小鼠，随机分为正常组与糖肾模型组(DN组)，对糖肾模型组小鼠使用含量60％的高脂饲料喂养小鼠4周后，连续腹腔注射5次小剂量(40mg/kg)链脲佐菌素(STZ)，1周后测小鼠随机血糖，随机血糖＞16.7mmol/l为小鼠糖尿病模型造模成功，继续喂养小鼠2月后，测量小鼠尿微量蛋白/肌酐，尿蛋白微量/肌酐＞30mg/kg为糖尿病肾病造模成功；再将造模成功小鼠随机分为非干预组与异荭草素分子干预组(ISO组)：低剂量治疗组(10mg/kg)、中剂量治疗组(20mg/kg)、高剂量治疗组(40mg/kg)，腹腔注射给药，对于正常组和DN组，则每天一次接受等量溶剂(0.2％羧甲基纤维素钠和0.1％的吐温80)，连续给药8周，监测小鼠一般状况、体重与血糖，在给药8周后，再次使用代谢笼收集小鼠24尿，检测小鼠尿微量蛋白尿、尿肌酐水平，麻醉后，取血分离血清，用于肾功能评价；肾组织将用于足细胞分选(取出后立即开展)、形态学分析、RNA与蛋白质分析；

(2)足细胞的分选：

用分布与细胞表面的足细胞的标志蛋白如Nephrin的抗体，通过磁珠分选方法分选小鼠肾脏足细胞：将新鲜取得的肾脏，剪碎后用II型胶原酶、中性酶消化，并用红细胞裂解液去除红细胞，通过25μm滤器分离出单细胞悬液，首先用交联CD31抗体的磁珠去除血管内皮细胞，再用PE标记的Nephrin抗体与交联了PE抗体的磁珠分选出足细胞，用流式细胞术检测分选所得的足细胞的纯度，Ayumi Murakami等已经用该方法成功分选出高纯度的足细胞，为提高足细胞分选纯度，本实施例采用以下分选足细胞方法：(a)腹腔注射2％戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出小鼠肾脏组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离除去肾包膜；(b)机械解离肾脏组织后，预热混合酶液消化，混合完全培养液终止消化；(c)采用差异过筛的方法获得肾足细胞，将足细胞接种于处理后的细胞瓶中培养；(d)将培养3d的细胞经胰酶消化后再次筛网过滤，离心弃上清，重悬接种于处理后的细胞瓶中；(e)细胞免疫荧光鉴定肾足突细胞；(此种方法为江苏齐氏生物科技有限公司发明，分离得到的小鼠肾足突细胞贴壁率较高，存活率达98％以上，细胞纯度达97％以上)；

(3)免疫印迹实验对足细胞中目标蛋白含量与磷酸化水平进行相对定量分析：包括检测AKT、TSC2与其相应磷酸化形式；检测LC3-I和LC3-II以评价自噬水平；检测TOM20和TIM23等线粒体标志蛋白以比较线粒体数量，并检测Parkin、PINK1、BNIP3等线粒体自噬关键蛋白，筛选出磷酸化蛋白质组学有显著性差异的蛋白，如表1所示：

表1：用修饰蛋白质组学技术筛选出具有显著差异的54种蛋白质(*p值小于0.05)

(4)肾组织形态学检测：

采用HE染色观察肾小球与肾小管的大致结构，透射电镜观察肾小球结构、足细胞的形态和足细胞内线粒体与自噬体，用Masson染色检测肾间质纤维化；

(5)足细胞自噬的原位观察

采用免疫荧光标记实验原位观察足细胞中的自噬情况，用足细胞标志蛋白的抗体进行免疫标记显示足细胞位置，用LC3抗体进行免疫荧光标记显示自噬体；

2、体外实验：

(1)足细胞系MPC5的培养与高糖和药物处理：

采用与体内实验相同的条件进行培养与药物干预，正常组对照培养基葡萄糖浓度为5.5mM，高糖处理采用的葡萄糖浓度为30mM，ISO处理组在高糖的基础上加入异荭草素分子40μM,ISO处理时间为48小时；

(2)稳定RNA干扰：

采用转染或用慢病毒介导的方式将shRNA导入足细胞，通过质粒携带的抗性基因进行筛选，如表1所示，得到稳定RNA干扰的足细胞株；

(3)基因敲除与基因敲入：

基因敲除：采用Cas9基因编辑技术构建基因敲除MPC5株，用CHOP在线软件设计sgRNA，连接到Lenti-Cas9-v2载体，转染到足细胞，通过质粒携带的抗性基因进行筛选，得到基因敲除细胞用于研究；

基因敲入：构建TSC2 S939A、S939E两种磷酸化位点突变的基因敲入MPC5细胞株，先设计sgRNA，连接到Lenti-Cas9-v2载体，再构建携带上述突变与PAM序列同义突变的donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入突变；

(4)细胞自噬的检测：

免疫印迹检测LC3-I与LC3-II，LC3-II/LC3-I的比值反应细胞的自噬水平。此外，将转染GFP-LC3表达质粒，采用激光共聚焦显微镜成像，计数细胞内点状分布的GFP-LC3；

(5)线粒体自噬的检测：

先检测线粒体数量，通过检测线粒体标记物，对细胞内线粒体含量进行相对定量分析，为了避免处理因素对标记物本身有影响，对多种标记物进行分析，包括检测线粒体蛋白质TOM20、TIM23蛋白含量，以及检测线粒体DNA，还通过透射电镜观察线粒体自噬；再检测线粒体与自噬体的共定位，采用免疫荧光标记检测线粒体标记蛋白TOM20、TIM23(标记总线粒体)与非弥散分布的LC3(活化的IC3，即LC3-II呈现点状或泡状分布)的共定位；然后分析细胞内受损但未被自噬清除的线粒体数量：活细胞状态下用MitoTracker标记线粒体，选择与线粒体结合依赖线粒体膜电位，并且经过多聚甲醛固定仍保持荧光的MitoTracker(如MitoTracker Red CMXRos)，被MitoTracker染色的为正常线粒体，免疫荧光标记TOM20(显示所有线粒体)，TOM20信号阳性，而MitoTracker信号阴性的线粒体为受损的线粒体；

(5)Biacore实验寻找ISO作用靶点：

将ISO连接到Biacore的传感芯片上，将制备好的足细胞裂解液通过缓冲液注入并流经生物传感器表面，生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射率的变化，通过监测SPR的角度变化，生物分子间反应的变化即被观察到。结合质谱分析及计算机拟合技术，构建直观的ISO作用的靶点；明确靶蛋白后，通过其结构特点，对与ISO结合的靶蛋白进行干扰，同时检测AKT、TSC2 S939位点磷酸化改变，以及自噬和线粒体自噬的变化，进一步研究ISO对足细胞活力的保护作用；

(6)细胞活性分析：

采用MTT检测活细胞数量，采用AnnexinV-PI双染-流式细胞术与TUNEL染色分析细胞的凋亡。