用于产生液滴、核酸扩增和检测的集成微流控系统

本申请要求于2018年11月16日提交的共同待审的美国临时申请第62/768715号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明的领域涉及用于产生液滴、在液滴中进行核酸扩增反应并随后测量反应信号的装置和方法。

背景技术

本文所有出版物的引用程度均如同每个单独出版物或专利申请被具体并单独引用以通过引用并入。当在并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中的术语的定义。

以下描述包括可能对理解本发明有用的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。

液滴数字PCR(ddPCR)是一种基于油包水乳液技术的方法。样品被分成数以万计的液滴，如果每个液滴包含模板分子，就会在每个液滴中发生模板分子的PCR扩增。与传统的实时PCR相比，ddPCR技术的优势包括绝对定量、无与伦比的精确度和更高的灵敏度。典型的过程包括在微流控芯片上产生液滴，将液滴转移到PCR管(板)中，在热循环仪中进行PCR扩增以及使用液滴读取器读取液滴荧光信号。

例如，在US9631230B2中，Mark Davies等人公开了一种进行核酸反应的方法，包括使用“油包液滴”技术进行数字PCR的方法。液滴在不混溶的载体流体的连续流动中通过热循环仪的通道，从而扩增目标。然而，该过程包括几个手动转移步骤，这是不希望的，因为它是劳动密集型的并且有被污染的可能性。

Youngbull等人的WO2017004250A1公开了用于连续数字液滴PCR生物分析的另一种系统和方法。然而，该系统没有内置的检测系统。因此，数字PCR系统扩增了液滴中的目标DNA后，必须手动转移经扩增的目标DNA以进行检测。这种手动转移可能会导致不期望的PCR后污染，并且还是劳动密集型的。

因此，仍然需要设计可以实现整个过程而无需用户在不同步骤之间手动转移样品的集成的微流控系统和装置。

发明内容

本发明的主题提供了一种用于集成微流控系统和装置的设备、系统和方法，其可以实现数字PCR的所有步骤，而无需几个手动转移步骤，并且不会造成不希望的PCR后污染。

在一个方面，本发明的主题提供了一种用于扩增和检测目标多核苷酸的微流控装置，其包括：(a)用于接收一种或多于一种底物的一个或多于一个孔；(b)与一个或多于一个孔流体连通的产生液滴的通道，其中微流控通道适于产生液滴；和(c)与产生液滴的通道流体连通的腔室，其适于收集由产生液滴的通道产生的液滴，还适于在液滴中进行化学反应，并且还适于允许光学观察液滴。腔室和产生液滴的通道被配置成使得腔室的流体力学流动阻力小于产生液滴的通道的流体力学流动阻力。预期腔室的深度为产生液滴的通道的宽度或深度的50％至200％，使得腔室内部收集的液滴以单层方式布置。腔室的体积通常是用于产生液滴的水相体积的1倍至20倍。形成的液滴可以是油包水液滴或水包油液滴。设想液滴中会发生许多化学反应。非限制性实例包括聚合酶链反应、诊断反应或限制酶消化。

在另一个方面，本发明的主题提供了一种微流控系统，其包括如本文所述的微流控装置；热循环仪，该热循环仪包括适于接收微流控装置的平坦表面，并且所述热循环仪适于以不连续的、预编程的步骤升高和降低表面的温度；和光学检测单元，其包括(a)一个或多于一个发射光发生器，(b)检测反射光和/或荧光的光学检测器，(c)用于接收微流控装置的芯片台，和(d)控制电路和存储电路，其中控制电路可以在XYZ方向上移动芯片台以扫描微流控装置中的腔室区域，并且其中存储电路存储由光学检测器检测到的反射光和/或荧光的强度和波长。

本文所公开的微流控系统还可以包括用于在产生液滴的通道中产生液滴的压力控制装置。该微流控系统还可以包括用于在腔室中进行核酸扩增的热循环仪。在优选的实施方案中，微流控系统还可以包括光学读取控制单元，所述光学读取控制单元用于光学检测来自液滴内部的核酸扩增的信号，用较高和较低信号对液滴的数量进行计数，并检测液滴的尺寸。此外，设想了一种软件系统，所述软件系统用于用较低和较高荧光信号计算液滴百分比以及基于从光学单元获取的图像来计算液滴的尺寸。

腔室的流体力学阻力优选地是产生液滴的通道的流体力学阻力的50分之一至1000分之一，或更优选地是产生液滴的通道的流体力学阻力的50分之一至100分之一。预期腔室的体积为20μL至500μL，腔室的深度为20μm至500μm，更优选地为40μm至200μm。腔室的宽度通常为几毫米至几厘米，例如1mm至100cm，或更优选地为3mm至10cm，或者最优选地为3mm至2cm。预期微流控通道将腔室出口连通至孔。装置可包括多个产生液滴的通道和/或多个腔室，例如1个至8个腔室，每个腔室彼此流体连通并且与产生液滴的通道流体连通。

本公开的各种实施方案还包括用于在单个微流控装置中产生液滴、液滴中的核酸扩增以及检测液滴信号的方法，提供了如本文所公开的微流控装置，其中孔包括具有待扩增的目标核酸的样品，在第二孔中包含油。然后通过提供连续流动通过产生液滴的通道的样品和油，并在微流控装置的腔室中收集液滴，将样品划分以形成包封在油包水型液滴中的样品。将微流控装置放置在，提供足以在液滴中进行核酸扩增的温度循环的热循环仪上，并被放置在用于荧光检测和定量扩增的核酸的光学模块上。

在优选的实施方案中，腔室和产生液滴的通道被配置成使得腔室的流体力学流动阻力小于产生液滴的通道的流体力学流动阻力。腔室的深度为产生液滴的通道的宽度或深度的50％至200％，使得腔室内部收集的液滴以单层方式布置。腔室的体积可以是用于产生液滴的水相体积的1倍至20倍。

如本文公开的荧光检测可以包括正交入射激发光照明或倾斜入射激发光照明。光学模块还可以适于检测液滴尺寸信息。通过以下步骤检测液滴尺寸信息：(a)扫描微流控装置的腔室以计算液滴的总数；和(b)基于像素信息使用液滴图像来直接测量或计算液滴尺寸。每个液滴中的荧光信号强度可用于计算具有正荧光信号的液滴的百分比。荧光信号强度还可用于计算每个液滴中扩增的核酸(例如，DNA或RNA)的平均数量。

通过以下对优选实施方案的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中，相同的附图标记表示相同的组件。

在附图中示出了示例性实施方案。旨在将本文公开的实施方案和附图视为说明性而非限制性的。

图1描绘了根据本文的实施方案的集成微流控装置的示意图。左：一个腔室的设计。右：两个腔室的设计。腔室的数量不受限制，并且最多可以有8个不同的腔室。

图2描绘了根据本文的实施方案的集成微流控装置的设计。

图3A描绘了根据本文的实施方案进入如本文公开的集成微流控装置的腔室的液滴。

图3B描绘了根据本文的实施方案的如本文所公开的集成微流控装置的腔室中的单层液滴。

图4描绘了根据本文的实施方案用于产生液滴、PCR扩增和液滴荧光检测的微流控系统的示意图。

图5描绘了根据本文的实施方案使用正交入射激发光照明的荧光检测的示意图。

图6描绘了根据本文的实施方案使用倾斜入射激发光照明的荧光检测示意图。

图7描绘了根据本文的实施方案使用倾斜入射光照明的液滴尺寸信息检测示意图。

图8描绘了根据本文的实施方案使用环形光照明的液滴尺寸信息检测示意图。

图9A描绘了根据本文的实施方案在腔室内的液滴尺寸测量的暗场图像。

图9B描绘了根据本文的实施方案在腔室内的液滴尺寸测量的荧光图像(激发：495nm，发射：520nm)。

图10描绘了根据本文的实施方案基于暗场图像使用被开发为计算液滴直径的两种不同算法(边缘检测法和最近邻法)示例性计算液滴直径的图示。

图11示出了将液滴示例性聚类为两组：正液滴和负液滴，以及负液滴百分比的计算，指示为95.62％，计算浓度为0.0448拷贝/液滴，如图所示。

具体实施方式

如本文所述，根据本文的各个实施方案，发明人已经开发了具有适当结构的微流控系统和装置，用于产生液滴、核酸扩增(PCR)和荧光检测。该微流控装置包括：具有用于产生液滴的通道和交叉点的基材；用于容纳产生的液滴并进行核酸扩增反应的大腔室；设置在基材上的用于装载试剂的孔；以及用于试剂流动的必要通道。大腔室位于两个高阻力通道之间，其中流动阻力至少是腔室的流动阻力的50倍。

如本文所公开的微流控装置集成了产生液滴的通道、用于液滴的PCR腔室和荧光检测。对于本领域技术人员而言明显的是，尽管本文公开的装置和方法示出了通过荧光进行的检测，但是为了检测目的也可以使用其他检测方法，例如，酶促方法或化学发光方法。

在一个方面，发明人在本文中公开了一种微流控装置，该装置包括：用于接收一种或多于一种底物的一个或多于一个孔；与该一个或多于一个孔流体连通的产生液滴的通道，其中该微流控通道适于产生液滴，和与产生液滴的通道流体连通的腔室，该腔室适于收集由产生液滴的通道产生的液滴，还适于在液滴中进行化学反应，并且还适于检测来自液滴的光信号。腔室和产生液滴的通道被配置成使得腔室的流体力学流动阻力小于产生液滴的通道的流体力学流动阻力。腔室的深度为产生液滴的通道的宽度或深度的50％至200％，使得腔室内部收集的液滴以单层方式布置。腔室的体积是用于产生液滴的水相体积的1倍到20倍。

液滴可以是油包水型液滴或水包油型液滴。设想在液滴中进行许多化学反应，例如DNA扩增反应、限制酶消化和/或诊断反应。微流控装置还可以包括用于在产生液滴的通道中产生液滴的压力控制装置。腔室的流体力学阻力优选地是产生液滴的通道的流体力学阻力的50分之一至1000分之一，或更优选地是产生液滴的通道的流体力学阻力的50分之一至100分之一。腔室的体积为20μL至500μL。腔室的深度为40μm至500μm，或者在某些情况下为20μm至200μm。通道的深度为20微米至500微米，宽度通常为几厘米。在一些实施方案中，微流控通道是用于将腔室出口连接至孔的。在一些实施方案中，装置可包括多个产生液滴的通道和/或多个腔室，例如1个至8个腔室，每个腔室彼此流体连通并且与产生液滴的通道流体连通。

在另一个方面，发明人已经公开了一种微流控系统，其包括如上所述的微流控装置；热循环仪，该热循环仪包括适于接收微流控装置的平坦表面，并适于以不连续的、预编程的步骤升高和降低表面的温度；和光学检测单元，其包括(a)一个或多于一个发射光发生器，(b)检测反射光和/或荧光的光学检测器，(c)用于接收微流控装置的芯片台，和(d)控制电路和存储电路，其中控制电路可以在XYZ方向上移动芯片台以扫描微流控装置中的腔室区域，并且其中存储电路存储由光学检测器检测到的反射光和/或荧光的强度和波长。系统还可以包括用于在产生液滴的通道中产生液滴的压力控制装置。光学检测单元光学检测来自液滴内部的核酸扩增的信号，用较高和较低信号对液滴的数量进行计数，并检测液滴的尺寸。此外，微流控系统可以包括软件系统，所述软件系统用于用较低和较高荧光信号计算液滴百分比以及基于从光学单元获取的图像来计算液滴尺寸。

在另一个方面，本文公开了一种用于在单个微流控系统中产生液滴、在液滴中扩增核酸以及检测液滴信号的方法，包括提供一种微流控系统，其包括：(i)一种微流控装置，该装置具有用于接收一种或多于一种底物的一个或多于一个孔；与该一个或多于一个孔流体连通的产生液滴的通道，其中该微流控通道适于产生液滴，和与产生液滴的通道流体连通的腔室，该腔室适于收集由产生液滴的通道产生的液滴；(ii)热循环仪，其包括适于接收微流控装置的平坦表面，适于以不连续的、预编程的步骤升高和降低表面的温度；和(iii)光学检测单元，其包括一个或多于一个发射光发生器，用于检测反射光和/或荧光的光学检测器，用于接收微流控装置的芯片台以及控制电路和存储电路，其中，控制电路可以使芯片台沿XYZ方向移动，以扫描微流控装置中的腔室区域，并且其中存储电路存储由光学检测器检测到的反射光和/或荧光的强度和波长；在第一孔中提供包含目标核酸的样品，在第二孔中包含油；通过使样品和油连续地流过产生液滴的通道，并在微流控装置的腔室中收集油包封的样品液滴，将样品划分以形成包封在油液滴中的样品(例如，油包封的样品液滴)；将微流控装置放置在热循环仪上，该热循环仪提供足以在液滴中进行核酸扩增的温度循环；将微流控装置放置在光学模块上，用于荧光检测和定量油包封的样品液滴中的扩增核酸。腔室和产生液滴的通道被配置成使得腔室的流体力学流动阻力小于产生液滴的通道的流体力学流动阻力。腔室的深度为产生液滴的通道的宽度或深度的50％至200％，使得腔室内部收集的液滴以单层方式布置。腔室的体积是用于产生液滴的水相体积的1倍到20倍。荧光检测可以包括正交入射激发光照明或倾斜入射激发光照明。光学模块可以检测液滴尺寸信息，包括以下步骤：扫描微流控装置的腔室以检测液滴的边界，并计算液滴的总数以形成液滴边界信息；使用液滴边界信息来识别和定位液滴；以及使用液滴边界信息找到每个液滴的平均液滴尺寸、体积和/或直径。本文公开的方法还可包括计算通过液滴边界信息识别和定位的每个液滴的荧光信号强度；或者计算每个液滴中的荧光信号强度以计算每个液滴中的荧光信号强度，或者计算每个液滴中的荧光信号强度，以计算计算具有正荧光信号的液滴的百分比，或通过使用基于边界信息的估计平均液滴体积来计算目标多核苷酸的浓度。

图1是具有产生液滴的通道、用于PCR扩增和荧光检测的液滴收集腔室以及用于装载试剂的孔的集成微流控装置的示意图。为了产生直径为30μm至150μm的液滴，产生液滴的通道的尺寸为20μm至150μm(宽度和深度)。腔室与产生液滴的通道直接连接。在某些情况下，可以设计2个或多于2个腔室，以使设计紧凑并容纳足够量的液滴，如图1的右侧所示。这些腔室与产生液滴的通道流体连通。为了避免液滴之间的荧光干扰，液滴应以单层方式填充在腔室内。为了实现这种单层填充，基于液滴大小设计腔室深度。深度为液滴直径的70％-130％。孔用于容纳试剂，例如油和样品。腔室体积是产生液滴过程中使用的油和样品的总体积积。

图2示出了本文公开的微流控装置的另一种设计。在该实施方案中，产生液滴的通道的深度为85μm。根据位置的不同，通道的宽度为70μm至90μm。通过在油和样品孔上施加2psi至3psi的压力，可以产生直径为110μm的液滴。腔室的深度为120μm，其中110μm大小的液滴可形成单层。总腔室体积为40μL。当使用20μL样品产生液滴时，会消耗20μL的油。在一个实施方案中，设计通道并且以这样的方式设定施加到油和样品相上的压力，使得油与样品的消耗比为1:1。

从不同的角度来看，发明人已经公开了一种系统，该系统用于实现产生液滴、腔室中收集液滴、在腔室中进行PCR反应以及荧光检测，如图4所示。在第1阶段中，上述微流控装置位于提供温度循环的热循环仪的顶部。例如，使用热循环仪可以在腔室内进行95℃30秒和55℃1分钟的循环，共40个循环。压力歧管用于形成良好的气密密封。可以将0至20psi的压力施加到微流控芯片上的孔中。为了在微流控通道中产生液滴，可将不同的压力施加到油孔和样品孔。例如，分别向样品孔和油孔施加4.5psi和4.2psi的压力，以获得110μm的液滴尺寸。收集液滴并将其填充到腔室中后，通过使用热循环仪在微流控芯片的薄膜侧施加温度循环来开始PCR反应。通过歧管向微流控装置上的所有孔施加15psi的压力，以减少蒸发并防止气泡形成。PCR反应后，通过机械转移机制将微流控芯片转移至第2阶段。在第2阶段，微流控芯片位于芯片台上。用于亮场和荧光检测的光学模块位于芯片台下。芯片台可以在所有方向例如水平和垂直方向上移动。从另一个角度看，考虑沿X轴、Y轴和Z轴移动，从而使光学模块可以将光源聚焦在腔室内并扫描整个腔室区域。光学模块可以扫描液滴腔室，以在多个光学通道中收集尺寸信息和荧光信号。

光学模块包括两个主要的功能子模块。一个子模块用于检测腔室内液滴的荧光信号。另一个子模块用于检测液滴的尺寸信息。光学检测系统可以通过不同的方法来实现。

图5示出了使用正交入射激发光照明的荧光检测。为了能够检测多个荧光通道，将激发光、激发滤镜、分色镜和发射滤镜组装为用于一个特定荧光通道的一个机械结构。多个组件可以一起安装在系统中，并且每次通过运动控制系统切换一个组件以进行特定的荧光通道检测。激发光通过脉冲控制信号打开。同时，由发射滤镜过滤的荧光信号被检测器收集。可以使用2D图像扫描仪逐个区域地收集液滴数据，或者通过行扫描仪逐行收集液滴数据，或者通过XY运动台移动芯片以进行整个腔室扫描。

图6示出了使用倾斜入射激发光照明的荧光检测的示意图。在该实施方式中，被激发的光以被激发滤镜过滤的倾斜入射角照射到液滴腔室上。它还可以通过切换特定荧光通道的激发光、激发滤镜、分色镜和发射滤镜来检测多个荧光通道信号，同时可以固定检测器。

尺寸信息用于识别和定位腔室中的液滴。它是由光学子模块通过暗场或亮场照明收集的。图7示出了使用倾斜入射光照明的液滴尺寸信息检测的示意图。图8示出了使用环形光照明的液滴尺寸信息检测的示意图。

图9A至图9B示出了PCR反应后在第2阶段收集的数据的实例。图9A示出了暗场图像，图9B示出了荧光图像(激发：495nm，发射：520nm)。根据暗场图像，开发了算法来计算液滴直径，如图10所示。两种算法用于计算液滴直径：边缘检测法和最近邻法。使用边缘检测法，通过强度差定义液滴的边缘。可以检测到每个液滴的两个峰。两个峰之间的距离用于计算液滴直径。使用最近邻法，由于大多数液滴紧密堆积，因此对于大多数液滴而言，最近的液滴到液滴的距离被认为是液滴的直径。基于图9B(荧光数据)，可以计算具有正荧光信号的液滴的数量和具有负信号的液滴的数量和/或百分比。最后，以下公式用于计算原始DNA拷贝浓度。

其中c是DNA拷贝浓度(拷贝/uL)；P

图11将液滴聚类为两组：正液滴和负液滴，并计算出负液滴百分比(95.62％)。计算出的浓度为0.0448拷贝/液滴。

以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方案。尽管每个实施方案代表发明要素的单个组合，但是发明主题被认为包括所公开要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方案包括要素A、B和C，而第二实施方案包括要素B和D，那么即使没有明确地公开，本发明的主题也被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合。

在以下实施例中进一步描述本公开的实施方案。这些实施例仅是说明性的，绝不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。

实施例

使用本文公开的装置的PCR过程

在一个实施方案中，本文描述了使用所公开的微流控装置的典型方法。将20μL的样品加载到样品孔中，并将90μL的油加载到微流控装置的油孔中。芯片已加载到系统中。降低歧管，并对不同的孔施加不同的压力(样品：2.5psi，油：2.2psi)以产生液滴。通常需要90秒。在产生液滴的同时，液滴进入腔室(图3A)并以单层方式堆积在腔室内(图3B)。

液滴的产生完成后，将15psi的压力施加到所有孔中，并开始温度循环。PCR扩增的示例性温度循环如下所示：

PCR扩增完成后，将微流控芯片转移到第二阶段。系统拍摄了明场和荧光图像。通过软件进行数据分析以给出DNA浓度。对于本领域技术人员而言明显的是，也可以使用其他温度、压力和时间来实践本文公开的方法。

在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明某些实施方案的表示成分的量、性质，例如浓度、反应条件等的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，在书面说明和所附权利要求书中所述的数字参数是近似值，其可以根据特定实施方案试图获得的期望特性而变化。在一些实施方案中，应该根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释数字参数。尽管本发明的一些实施方案的所述的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中列出的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可能包含某些误差，这些误差是由于在它们各自的测试测量中发现的标准偏差而必定导致的。

除非上下文指示相反，否则本文所述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放范围应解释为仅包括商业上实用的值。同样，除非上下文指示相反，否则所有值列表都应视为包括中间值。

如本文的说明书和随后的整个权利要求书中所使用的，不使用数量词的含义包括复数引用，除非上下文另外明确指出。另外，如本文的说明书中所使用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文另外明确指出。

本文中列举的数值范围仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，否则将在范围内的每个单独的值并入说明书中，就如同其在本文中是单独列举的一样。除非本文另外指出或除非与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

各组本文公开的本发明的替代要素或实施方案不应被解释为限制。每个组成员可以单独引用或要求保护，也可以与该组的其他成员或本文找到的其他要素组合使用。出于方便和/或可专利性的原因，一个或多于一个组成员可以包含在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书在本文中被认为包含经改变的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

对于本领域技术人员明显的是，在不背离本文的发明构思的前提下，除了已经描述的改变之外，还可以进行更多的改变。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他性的方式指代要素、组件或步骤，指示可以存在或利用所引用的要素、组件或步骤，或所引用的要素、组件或步骤可以与其他未明确引用的要素、组件或步骤组合。如果说明书权利要求体积选自A、B、C……和N的至少一种，则该文本应解释为仅要求其中的一个要素，而不是A加N或B加N等。