一种NDUFA4L2参与赫赛汀耐药的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及过表达NDUFA4L2参与逆转HER-2阳性的乳腺癌细胞对赫赛汀耐药的作用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，在女性肿瘤死亡中排第一，其中HER-2阳性的患者占20-30％，这部分患者预后较差。

赫赛汀是针对HER-2编码的受体酪氨酸激酶胞外段的人源化单克隆抗体，是目前临床上最常用于治疗HER-2阳性乳腺癌患者的药物。

虽然赫赛汀提高了HER-2阳性乳腺癌患者的生存，但是超过70％的患者治疗后1年内出现耐药。因此，赫赛汀的耐药问题成为影响HER-2阳性晚期乳腺癌患者治疗疗果和生存时间的重要瓶颈。

目前已经进行了多项关于赫赛汀耐药机制的研究，大多围绕耐药后信号通路的激活以及EGFR家族受体结构上的改变开展，已阐明的机制主要包括：

①肿瘤细胞表面的HER-1、HER-2或HER-3的表达增加导致抗体药物效价降低；

②PIK3CA基因突变或者PTEN缺失，造成PI3K信号通路持续激活或EGFR家族成员、MET受体和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，IGF-1R)信号通路的活化；

③转化生长因子TGF-α、神经调节蛋白以及血管内皮生长因子VEGF过表达等产生的补偿机制。

为了逆转赫赛汀的耐药，目前临床已经有针对耐药机制研发的药物，如针对HER-2的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)拉帕替尼、阻滞HER-2/HER-3异源二聚体形成的帕妥珠单抗等，这些药物与赫赛汀联合，可提高赫赛汀的疗效，但患者最终仍会出现耐药，导致病情进展。

现有的研究只能部分阐明EGFR家族相关的信号通路激活可能仅代表赫赛汀耐药的冰山一角，但是在逆转耐药的新方法方向的研究较少，因此如何逆转或者延缓赫赛汀耐药可以大大延长HER-2阳性乳腺癌患者的生存时间，节约患者的治疗费用，具有重要的临床意义和社会效益。

目前对赫赛汀耐药机制方面的探讨，关于HER2驱动导致肿瘤的发生和肿瘤细胞能量代谢之间的交互作用方面的研究甚少。

肿瘤细胞的能量代谢主要依赖于糖酵解，在有氧的情况下，不仅可以产生能量，而且可以将营养物质转化为细胞增殖所需的生物量，被称为Warburg效应。

NDUFA4L2是位于线粒体内膜的蛋白，参与细胞的代谢。

发明内容

本发明的目的是发现NDUF1L2参与赫赛汀耐药的新机制，为HER-2阳性患者药物的选择、预后判断以及制备逆转赫赛汀耐药药物提供依据。

通过对赫赛汀敏感和耐药的细胞中进行基因检测，发明人首次发现了NDUFA4L2在赫赛汀耐药的细胞中表达增高，通过调节线粒体内的能量代谢以及氧化应激水平，调节糖酵解的过程，参与了赫赛汀耐药的过程，为HER-2阳性患者治疗方案的制定、预后判断以及日后制备逆转乳腺癌患者对赫赛汀耐药的药物提供基础和实验依据。

为实现上述目的，本发明提供的具体技术方案如下：

一种NDUFA4L2参与赫赛汀耐药的乳腺癌药物中的应用，其特征在于，NDUFA4L2可以在细胞上起到逆转HER-2阳性乳腺癌细胞株对赫赛汀耐药的作用。

一种发现NDUFA4L2参与赫赛汀耐药的过程，其特征在于，通过浓度梯度的方法构建了BT474耐赫赛汀的细胞株，发现与敏感的亲本细胞相比，耐赫赛汀的BT474HR细胞中NDUFA4L2表达明显增高，在细胞水平发现NDUFA4L2通过氧化应激和能量代谢，参与调节赫赛汀的耐药过程。

本发明首先通过对赫赛汀敏感或耐药的细胞进行全基因组分析，总共487个探针，通过了FDR校正，发现了453个有差异表达的基因，其中NDUFA4L2是差异最显著的基因，通过其能量代谢以及氧化应激水平，从而调控对赫赛汀的敏感性。其应用于临床可以有助于临床医师治疗方案的制定，预后的判断以及日后成为相关药物研发的靶点，提高赫赛汀的疗效，具有良好的临床推广价值。

附图说明

图1-A至图1-D为Real-time PCR、蛋白免疫印迹以及免疫荧光法检测BT474和BT474HR细胞结果示意图；

由图可知，在赫赛汀耐药细胞中NDUFA4L2表达增高，同时HER-2蛋白转移至线粒体内。

图2-A至图2-I为使用CyQuant方法检测BT474、BT474/HR以及BT474、SKBR3过表达NDUFA4L2得到结果示意图；

具体为使用CyQuant方法检测细胞对增殖以及赫赛汀敏感性的研究，并进行3D细胞培养，观察对赫赛汀的敏感性，注：p<0.05。

图3-A至图3-F为检测BT474&BT474HR以及BT474&BT474 NDUFA4L2过表达后，赫赛汀治疗后OCR、ECAR的变化以及ATP以及乳酸水平的变化示意图；

注：p<0.05。

图4-A至4-D为使用DCFDA探针检测赫赛汀分别对BT474&BT474HR以及BT474&BT474NDUFA4L2过表达患者，得出的氧化应激水平的变化示意图。

图5为细胞浓度图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。

实施例1

检测BT474、BT474HR细胞中差异基因的表达：

(1)方法：Real-time PCR、Western blot以及细胞免疫荧光；

(2)结果测定：如图1-A至图1-D所示。

(3)结果分析：赫赛汀耐药细胞BT474HR细胞中，NDUFA4L2表达显著增高，主要位于细胞的线粒体内。

实施例2

使用CyQuant试剂盒检测BT474、BT474HR以及BT474、SKBR3过表达NDUFA4L2后对赫赛汀敏感的影响：

(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔4000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

(2)培养细胞：将培养板移入CO

(3)呈色：培养第24-96h后，每孔加入2×CyQuant试剂100ul，37℃，继续孵育1h。

(4)比色：使用480/535nm波长测定光密度值(OD)，每组3个复孔,重复三次实验。计算生存率。细胞增殖率＝实验组OD值/对照组OD值×100％。

按如上方法将BT474&BT474HR、BT474&SKBR3过表达NDUFA4L2后种在96孔板上，4000个细胞/孔。每组给予不同浓度的赫赛汀处理，给药3天后CyQuant法检测细胞活力，做出各自的增殖曲线。

(5)结果测定:如图结果测定:如图2-A至图2-I。

(6)结果分析:BT474HR以及细胞过表达NDUFA4L2后，明显表现对赫赛汀的耐药性。

实施例3

检测BT474、BT474HR以及BT474 NDUFA4L2过表达后，ATP的变化。

(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种于6孔培养板中。

(2)培养细胞：将培养板移入CO

(3)裂解细胞：收集同样数的细胞，加入细胞裂解液，充分裂解后，每组抽取10ul上清液上机检测；

(4)比色：制作标准反应曲线作为本底荧光数值，从样品中的数值减去本底值，绘制出对对照样品校正后的结果；

如上方法将BT474、BT474HR、BT474过表达NDUFA4L2后种在6孔板上，10000个细胞/孔。给予赫赛汀处理3天后ATP检查试剂盒法检测细胞内的ATP的变化；

(5)结果测定:如图3-A至3-B所示。

(6)结果分析:BT474细胞加入赫赛汀后，ATP下降，然而BT474HR细胞以及过表达NDUFA4L2加入赫赛汀后，ATP水平无显著变化。

实施例4

使用Seahorse法检测BT474对比BT474HR以及BT474 NDUFA4L2过表达后，糖酵解途径的变化。

(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，每孔3200个细胞，每孔体积200ul。

(2)处理细胞：细胞贴壁后，用XF检测液清洗细胞，最终将细胞板移入无CO

(3)加药：从无CO

(4)上机检测：完成ECAR、OCR的测定，仪器自动完成数据分析；

按如上方法将BT474、BT474HR以及BT474过表达NDUFA4L2细胞，3500个细胞/孔。每组给予不同浓度的赫赛汀处理，给药3天后seahorse法检测细胞ECAR、OCR水平的变化。

(5)结果测定:如图3-C、图3-D以及图3-E所示。

(6)结果分析:与奥西替尼单独处理相比较，奥西替尼+PF-4708671可以逆转HCC-827/OR对奥西替尼的耐药性。

实施例5

使用流式细胞方法检测赫赛汀对BT474、BT474HR以及过表达NDUFA4L2细胞氧化应激的影响：

(1)细胞经过赫赛汀处理，培养一定时间后，经胰酶消化、PBS润洗。

(2)然后加入DCFDA，37℃孵育30分钟后。

(3)通过流式细胞仪FACS检测细胞ROS水平的变化。

(4)结果测定:如图4-A至4-D所示。

(5)结果分析:赫赛汀处理BT474细胞后，ROS水平显著增加，然而BT474HR细胞无显著变化。而基线期，NDUFA4L2过表达细胞与对照组相比，ROS水平增高，加入赫赛汀后，ROS水平的增加的水平不如对照组显著。

本申请中提及的细胞株、质粒以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。